细胞培养考试题目

细胞培养特性：分为贴壁性（上皮细胞型、成纤维细胞型）和悬浮型（白细胞、癌肿细胞）体外培养细胞生长特点：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。

原代培养（原代细胞）：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前称为原代培养或原代细胞。

传代培养：细胞持续生长繁殖一段时间，到达一定浓度之后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿，并补充更新培养液。

细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。

有限细胞系：一般正常细胞系的寿命只能维持一段时间期限。

无限细胞系：传代中极少的后代发生转化，通过“危机期”，获得不死性而具有持久或无限增值能力，这种永生化细胞即为无限细胞系。

细胞株：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。

克隆：在动物细胞培养中从细胞群体中分离出一个细胞开始，其在体外无性繁殖成新的基因型相同的细胞群体，这种纯化的细胞群称为细胞株，他们中的每个细胞的遗传特征及生物特性极为相似，常用的细胞克隆技术有有限稀释法和平皿克隆分离法。

杂交瘤技术：主要由免疫动物、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、克隆化培养、单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，核心是细胞融合。

杂交瘤：由产生抗体的肿瘤细胞与抗原-刺激的正常浆细胞融合而形成的细胞，这种细胞产生的抗体称为单克隆抗体。

基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。

筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。

把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。

细胞杂交：通过人工培养和诱导将不同种生物或同种生物不同类型的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。

杂交技术过程:①免疫动物及细胞培养:用特定抗原免疫纯系动物获得预定抗体B淋巴细胞,利用细胞融合技术可使短寿命抗体形成细胞与能永久生长的同种骨髓瘤细胞系融合,获得既有分泌抗体能力,又有无限繁殖能力的细胞②筛选杂交瘤细胞(在具有筛选作用的培养基上培养)③克隆化培养④单克隆抗体的大量制备与鉴定(动物体内诱生法和体外培养法)⑤进一步分离和纯化单克隆抗体,鉴定单克隆抗体类型及亚类,测定抗体亲和力以及相应抗原的分子量等.显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，其计算公式是σ=λ/NA 式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。

可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。

NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。

要提高分辨率，即减小σ值，提高分辨率可采取以下措施:（1）降低波长λ值，使用短波长光源。

（2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsin(u)/2）。

（3）增大孔径角u值以提高NA值。

（4）增加明暗反差。

体外培养过程：原代培养或初代培养、传代期、衰老期。

每代细胞生长过程：滞留期（潜伏期）、指数生长期、平台期培养细胞生长条件：①营养需要：基本营养物质（氨基酸、维生素、碳水化合物及无机离子）和促生长因子等物质。

②生存环境：温度（35—37）、气相（CO2和O2）、pH值（）及渗透压③无污染及无毒：防止交叉污染、有害物质污染。

细胞冻存及复苏：基本原则：慢冻快融，以最大限度的保存细胞活力。

原理：细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

冻存步骤：①选择对数生长期细胞，冻存前一天最好换一次培养液；②用胰蛋白酶把单层生长细胞消化下来③去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入配置好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打细胞使其均匀,然后分装入无菌冻存管中④旋紧确保密封,标明细胞名称、冻存时间等信息⑤封好的冻存管可直接冻存（降温速度要慢：-1~-2℃/min，温度达到-25℃以下可以-5~-10℃/min，到-100℃以下可迅速浸入液氮中）复苏步骤：①取出冻存管直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其尽快融化②从水浴中取出冻存管，酒精消毒后开启，吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上的培养液（稀释保护剂二甲基亚砜，减少其对细胞的损伤），混合后低速离心去除上清液，再重复清洗一次③培养液进行适当稀释，接种到培养瓶继续培养。

干细胞分为：全能干细胞（胚胎干细胞，具有形成完整个体的分化潜能，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官）、多能干细胞（成体干细胞，具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制）和单能细胞（专能细胞或偏能细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化）无菌操作室理想划分为：更衣间、缓冲室和操作室；无菌操作间空气消毒用紫外灯，最好设置恒温恒湿装置。

超净工作台：侧流式称为垂直式；外流式称为水平层流式。

培养箱一般选用隔水式或晶体管自控温培养箱先碱后酸清洗玻璃器皿：苛性碱清洗剂会使玻璃表面带有电荷不适于细胞附着，需以HCl 或H2SO4中和；清洗步骤一般为：浸泡、刷洗、清洁液浸泡及冲洗。

胶塞、盖子等杂物清洗：不能使用清洁液浸泡，先用自来水冲洗干净，在进行常规清洗。

灭菌消毒方法：湿热（高温蒸汽）、干热、紫外线、射线、过滤、离心沉淀、化学消毒剂、抗菌素等。

湿热灭菌：器械、液体、橡胶制品、布料；不耐高温塑料制品使用消毒剂浸泡或紫外线照射；盐溶液以及一些耐高温溶液常使用高压蒸汽消毒，血浆、血清等生物性的天然活性的天然培养基，需使用过滤方法除菌。

细胞培养基：水、盐溶液、消化液、缓冲液、维生素及用于检测的各种染液，包括天然培养基（血清、血浆）、合成培养基（Eagle培养液、Ham培养液和RPMI1640培养液）人脐静脉血管内皮细胞：内皮细胞在血管内形成单层内表皮，培养方法主要是用胶原酶消化分离血管内皮细胞，然后培养在铺有明胶基质的培养器皿内，如果标本来源是毛细血管，培养基中需加有丝分裂剂。

步骤：①无菌条件下取新生儿脐带10cm ②超净工作台内剔除钳痕和凝血块阻塞部分，用PBSA液初步清洗，找到脐静脉后，用50ml注射器吸取PBSA液反复灌洗冲清③洗净后，用止血钳封住一端，在另一端注入15mlⅡ型胶原酶，反应15min，期间不可晃动④消化后打开止血钳，剪去钳痕，将消化液流入事先准备好的离心管中，用注射器吸取培养基灌洗血管，并与消化液合并，终止消化⑤收集到的消化液以1000r/min速度离心10min，弃上清，加入37℃细胞培养基，吹打均匀⑥取明胶包被的六孔细胞培养板，吸去明胶加入、5%CO2、38℃孵箱静置培养，24h后更换培养液并除去未贴壁细胞，3天换一次培养液至生长汇合。

鉴定：内皮细胞分泌第8因子，细胞内含有Weibel-Palade小体，吞噬低密度乙酰脂蛋白，表达内皮细胞特异性表面抗原，做免疫试验，可观察到细胞内产生黄色沉淀。

成骨细胞培养：成骨细胞包绕在硬组织中，用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化，均可分离培养成骨细胞。

步骤：①取骨标本室温下用无菌生理盐水冲洗数次（如果暂不使用，则浸泡于含12%胎牛血清及青霉素、链霉素的Ham’s E12培养液中4℃过夜）②用平衡盐液冲洗标本③在培养皿中切下标本上的骨小梁，将其放入第二个培养皿④加入10ml Hank’s液，洗数次除去血污及脂肪⑤在25cm2的培养瓶中加入2ml完全培养液，在CO2孵箱中预培养20min使培养液均匀化⑥把骨小梁组织切成1-3mm3的碎块⑦与培养瓶中除去培养液，重新加入新鲜Ham’s E12培养液，移入25-40个骨小梁组织块将培养瓶竖放或瓶底向上，用组织接种环将骨小梁碎块均与铺散在底壁上，37℃培养2h后将瓶底翻转向下，继续5-7天⑧细胞长满后可除去组织块，用胰蛋白酶消化离心法收集细胞，传代培养。

鉴定:形态观察(多为立方体、体积小、核圆)、碱性磷酸酶活性检测、骨玻璃样蛋白检测、Ⅰ型和Ⅲ型原胶原测定、矿化监测。

胚胎干细胞培养：是由动物囊胚的内细胞群或原始生殖细胞分离出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能型的胚胎细胞。

应用：①生产克隆转基因动物，提高其繁殖频率，保护濒危动物及物种②用于可移植器官③基础研究定向分化④用于细胞治疗⑤药用蛋白、动物抗性的育种培养方法有：饲养层共培养法（小鼠胚胎原代培养成纤维细胞、ES细胞的培养、亚克隆纯化的细胞）和无饲养层培养法鉴定分析：核型分析、离体分化能力鉴定、体内分化能力鉴定、碱性磷酸酶染色、免疫组化染色、冻存和复苏、端粒酶活性分析、嵌合体实验、移植核实验。

步骤（小鼠胚胎原代成纤维细胞培养）：①将鼠胚移入培养皿中,用PBS将血冲洗②将鼠胚剪成小块,DMEM将血冲洗净,组织块移入无菌培养瓶中,加入2-4ml消化液,37℃孵育10min,加入等量培养液中止③将消化下来的细胞用100um滤纱过滤,1000rpm离心10min,重复消化④调整细胞浓度至105个/ml接种于培养瓶或培养皿中，37℃、5%CO2、饱和湿度中过夜⑤48h 传代⑥用含丝裂霉素培养液给已铺满的成纤维细胞换培养液，37℃、5%CO2饱和湿度温箱中孵育，PBS洗3-4次⑦加入适量消化液消化30s-1min，中止消化，将3×105个/ml细胞接种于%明胶处理过20min的4孔培养板中，用前换培养液。

骨髓基质干细胞：哺乳动物的骨髓基质中，存在具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，称之为骨髓间充质干细胞。

培养：①取小鼠的胫骨和股骨，去除骨上附着的软组织和骨骺端②将分离的股骨和胫骨移入一无菌平皿，用针管抽5mlPBS将骨髓冲出，滤纱过滤，1500rpm离心4min③沉淀细胞重悬于10ml培养液中，2×106个接种于塑料90mm培养皿中④接种后24-28天换液⑤首次换液后每3-4天换液一次，7-14天首次传代⑥将已70%-80%长满的细胞用消化液消化，分散成单细胞，以106个/ml接种于90mm塑料培养皿中，每3-4天换液一次，7-10天传代。