玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测

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组蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用检测

Ｈ４，ａｎｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｉｒｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｕｔｏｎｏｍｏｕｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｙｅａｓｔｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｏｆＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３ａｎｄＨ４ｗｅｒｅａｍｐｌｉｉｆｅｄａｎｄｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＧＢＫ－Ｔ７ｙｅａｓｔｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｙｅａｓｔＡＨ１０９ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｔｏｔａｌｙｅａｓｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｔｈｅｎｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅａｂｏｖｅｈｉｓｔｏｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｉｒａｕｔｏｎｏｍｏｕｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｃｏｄ — ｉｎｇｒｅｇｉｏｎｓｏｆＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３ａｎｄＨ４ｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＧＢＫ— Ｔ７ｖｅｃｔｏｒｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｎｄｈｉｓｔｏｎｅＨ４ｇｏｔｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｓｈｏｗｅｄｎｏａｕｔｏｎｏｍｏｕｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅＬａｃＺ，ＨＩＳ３ａｎｄＡｄｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｙｅａｓｔｔｗｏ — ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｈｉｓｔｏｎｅＨ４．

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达马芳芳;苏彦冰;张彬;李红英;韩渊怀【摘要】为克隆玉米（Zea mays L ．）磷酸丙糖异构酶基因 ZmT PI ，并进行序列分析和原核表达研究，根据玉米 T PI 基因的 cDNA 全长序列设计特异引物，以玉米叶片总 RNA 为模板，采用RT‐PCR 方法扩增得到了约750 bp 的基因编码区cDNA 片段，T ／A 克隆后进行了序列测定及序列分析，随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX‐4T‐1上，得到的重组表达质粒GST‐ZmTPI 转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。

结果显示，玉米 ZmT PI （GenBank ：EU959275）cDNA 全长1216 bp ，753 bp 开放阅读框编码250个氨基酸，推测分子量26.7205 kDa ，理论等电点为5.12；该蛋白具有高度保守的 TIM 结构域，与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性；进化树分析表明，玉米 TPI 与甘蔗亲缘关系最近，处于同一进化支；SDS‐PAGE 检测结果显示，成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。

玉米 ZmTPI 蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功，为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。

%ZmT PI gene cloned from Zea mays was expressed in E .coli Bl21. In this work ,based on the full‐length cD‐NA sequences of maize T PI gene ,a cDNA coding region fragment about 750 bp was amplified using RT‐PCR method from total RNA of maize leaves and cloned into the prokaryotic expression vector PGEX ‐4T‐1 ,resulting the recombi‐nant plasmid of GST‐ZmTPI .The resulting construct GST‐ZmTPI was then transformed intoE .coli Bl21 for further analysis .Results showed that the ZmT PI (GenBank :EU959275) cDNA sequence is 1 216 bp in length and has an open reading frame (ORF) of 753 nucleotides ,encoding a protein of 250amino acids with a predicted molecular mass of approximately 26.7205 kDa polypeptide and an isoelectric point of 5.12 ;The ZmTPI protein has highly conserved TIM domain ,and was highly similar with its homologous proteins in other plants ;phylogenetic analysis showed that the de‐duced amino acid sequence of ZmTPI was most similar to that of Saccharum o f f icinarum ,indicating that they belong to the same evolutionarybranch ;SDS‐PAGE assay showed that the fusion protein was successfully expressed and puri‐fied with the expected size .The ZmT PI gene was cloned and successfully expressed and purified in E .coli Bl21. This study will provide a foundation for further research on biological function of this protein .【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)006【总页数】7页(P381-386,438)【关键词】玉米;磷酸丙糖异构酶;基因克隆;原核表达【作者】马芳芳;苏彦冰;张彬;李红英;韩渊怀【作者单位】山西农业大学农学院，山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031;山西农业大学农学院，山西太谷030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031;山西农业大学农学院，山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031;山西农业大学农学院，山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031;山西农业大学农学院，山西太谷 030801; 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原 030031【正文语种】中文【中图分类】S513;Q78磷酸丙糖异构酶(Triosephosphate isomerase，TPI)能够催化二羟丙酮磷酸(DHAP)和D型甘油醛-3-磷酸(GAP)这两种丙糖磷酸异构体之间的可逆转换[1,2]，作为糖酵解及糖异生途径中的关键酶，TPI被发现几乎存在于所有的生物体当中[3,4]。

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_MYC2构建及表达鉴定

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_MYC2构建及表达鉴定刘武;肖牧;阮颖;刘春林【摘要】MYC2是一类含有helix - loop - helix (bHLH)结构域的转录因子.为进一步研究MYC2因子在植物防御抗性中的作用及其参与植物JA,SA等信号途径的作用机制,克隆了拟南芥的MYC2基因,以此构建了pGBKT7_MYC2酵母双杂交载体,通过Western blotting验证表明,该载体能在酵母细胞里正常表达.%MYC2, a basic helix - loop - helix (bHLH) domain - containing TF, acts as a positive regulator of abseisic acid - dependent drought responses and is also induced in JA - mediated responses. Taking the cDNA from Arabidophsis as the template, full - length COS of MYC2 had been cloned and then was ligated into the bait expression vector pG-BKT7. After verified by digestion, the bait vector was transformed into Clod yeast cells, and the expression of MYC2 gene was checked by Western blotting. As a result, the bait expression vector pGBKT7_MYC2 was constructed successfully, which laid the foundation for screening target proteins interacting and mapping the network with the MYC2 protein.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2012(026)002【总页数】5页(P143-147)【关键词】MYC2基因;pGBKT7_MYC2;诱饵载体;蛋白表达【作者】刘武;肖牧;阮颖;刘春林【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学农学院,长沙410128;作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q78MYC2是一类含有helix－loop－helix(bHLH)结构域的转录因子，在拟南芥中能够激活或抑制茉莉酸 (JA)信号途径的相关基因表达［1］。

VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

VSV糖蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测韩岩岩;宋德光【摘要】构建水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）酵母双杂交诱饵载体，检测其在酵母细胞中的表达和自激活作用，为进一步研究酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作用蛋白奠定基础。

通过RT-PCR方法从水泡性口炎病毒（VSV）克隆糖蛋白（G）基因， BamH I和Sal I双酶切后连接诱饵载体pSos，获得诱饵质粒pSos-VSV-G，经测序鉴定后pSos-VSV-G转化到酵母菌株cdcH25（α），在营养缺陷培养基中观察pSos-VSV-G的自激活作用和毒性作用，同时利用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达。

成功扩增VSV-G基因，并准确克隆入pSos中，诱饵载体pSos-VSV-G成功转化到酵母菌株cdcH25（α）中，经表型筛选检测无自激活作用和毒性作用，蛋白印迹法检测证实pSos-VSV-G在酵母细胞中表达诱饵蛋白。

可以利用酵母双杂交系统筛选与VSV-G相互作的蛋白质。

%It was to construct a bait vector for vesicular stomatitis virus glycoprotein(VSV-G)and detect its protein expression and self-activation activity in yeast cells, as a basis for further study of screening and VSV-G protein interaction in two hybrid system. Fragment of VSV-G gene were amplified using RT-PCR and directly ligated to pSos vector, insert-contained plasmid was confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing. The self-activation and toxicity of the bait plasmid transformed into the yeast cellscdcH25(α)was observed in selective culture medium, and the bait protein was confirmed by Western blot. Results showed that VSV-G gene was found in the reconstructed plasmid pSos-VSV-G by sequencing. Yeast two-hybrid tests showed that yeast ce lls cdcH25(α)transfected with pSos showed that VSV-G had no self-activation and toxicity, the expression of bait protein was confirmed by Western blot. The yeast two-hybrid system can be applied to screen the interacting proteins of VSV-G.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P109-114)【关键词】水泡性口炎病毒;糖蛋白;酵母双杂交;诱饵载体【作者】韩岩岩;宋德光【作者单位】遵义医学院公共卫生学院，遵义563003;吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062【正文语种】中文水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是引起人和多种哺乳动物水泡性口炎（Vesicular stomatitis，VS）的病原［1］。

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测闵婕;李青;马楠;康艳霞;李娜【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2013(021)003【摘要】Objective;To construct a bait vector containing human cide -3 gene in yeast two -hybrid system in order to screen the human liver cDNA library. Methods; The fragment including all exons of cide -3 gene was amplified by RT-PCR and was inserted into the multiple cloning sites of the shuttle vector pGBKT7. After confirmation with restricted endonuclease digestion and sequence analysis,by using PEG/LiAC method,the plasmid pGBKT7 - cide -3 was transformed into yeast AH109. The plasmid and protein isolated from the positive yeast AH109 clone was tested its expression,toxicity and transcriptional activation. Results:The human cide -3 cDNA was amplified. The restrictive endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the plasmid pGBKT7 - cide - 3 was obtained. The yeast AH109 clone transformed with pGBKT7 - cide - 3 was screened out by the SD/ - Trp nutritional media. Sequence analysis revealed that the fragment was correctly inserted into pGBKT7 with a right reading frame and its expression in yeast was verified. Conclusion; The bait plasmid pGBKT7 -cide -3 constructed expresses correctly,and can not activate the transcription of。

OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测

OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测潘家强;侯学文【摘要】采用 PCR 技术扩增水稻根UV‐B 敏感基因2.1(ROOT UV‐B S EN S IT IV E 2.1,RUS2.1)四个不同片段[OsRUS2.1(1‐1317),OsRUS2.1(1‐138),OsRUS2.1(139‐879),OsRUS2.1(880‐1317)],连接到 T 载体pMD18‐T‐Simple 上,测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体 pGADT7上.结果表明：四个OsRUS2.1基因片段的表达载体构建成功,读码框正确；分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞 Y187中,用 LacZ 、M EL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD‐Leu‐DO 培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明构建的四个OsRUS2.1不同片段的猎物表达载体对酵母菌株 Y187均没有转录激活活性和毒害作用,可用于后续研究.%Four fragments of rice(Oryza sativa)ROOT UV‐B SENSIT IV E 2 .1(OsRUS2 .1) ,OsRUS2 .1(1‐1317) , OsRUS2 .1(1‐138) ,OsRUS2 .1 (139‐879) ,OsRUS2 .1 (880‐1317) ,were amplified by PCR from cloned OsRUS2 .1 plasmid ,and were ligated with pMD18‐T‐simple vector ,then transformed to E .coli TOP10 competent cell .The posi‐tive clones were selected and sequenced .The confirmed fragments were subcloned to prey vector pGADT 7 .The four constructed pGADT7 prey vectors were further confirmed by enzyme digestion and sequencing . The confirmed 4 types of pGADT7 prey vectors were transformed to Y187 yeast c ompetent cells .The self‐activation and toxicity of the plasmids to host yeast Y187 were detected by LacZ and MEL1 activity assays and culturing in auxotroph medium SD‐Leu ‐DO .Results showed that the fourconstructed plasmids had no self‐transcriptional a ctivity and not toxicity to yeast strain Y187 ,and they could be used in the following yeast two‐hybrid experiments .【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】6页(P76-81)【关键词】水稻根对敏感基因 2.1;猎物载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测【作者】潘家强;侯学文【作者单位】华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642;华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642; 华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室，广州 510642【正文语种】中文【中图分类】Q782UV-B是太阳辐射的组成部分，它能够穿过大气层到达地表，但到达地表的UV-B 辐照强度与季节、云层厚度以及大气层臭氧含量有关。

酵母双杂交实验报告

酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。

本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。

二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。

转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。

这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。

在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。

如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。

通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。

三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。

设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。

2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。

酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML—V的构建、表达及鉴定

【ｂｔｃ】ＯｊｃｉｅＴｏｓｕｔｔｅａｘｒｓｎｅｔｒｐＢＴ－ＭＬＶｏｒｉｉｃｄｅｅｔａａｔｐｏｅ，ｒＡｓａｔｂｅｔ：ｏｃｎｔｃｈｂｉｅｐｅｉｖｃｏＧＫ７Ｐ－ｆｅｎｃｉｃｐｏｖｒｎｒｉｆｒｖｒｔｓｏｔｏａｒｒｉｔｎｏ
ｂｉｒｔｉｓａａｙｅｙＷｅｔｒｌｔｎ．Ｔｘｃｔ，ｅｋｇｎｓｌａｔａｉｎｏｈａｔｐｏｅｎｅｅｄｔｃｅ．ＲｅｕｔａｔｏｅｎｗａｎｌｚｄｂｐｓｅＢｏｔｇｏｉｉｌａａｅａｄｅｆｃｉｔｆｔｅｂｉｒｔｉｗｒｅｅｔｄｎｉｙ－ｖｏｓｌｓ：
一
２７一５
文章编号：２３３２（０８０ — ２７００５ — ６６２０）３０５ — ４
酵母双杂交诱饵载体ｐＢＴ一ＭＬＶ的构建、ＧＫ７Ｐ — 表达及鉴定
钟梁，王种，刘北忠，东生，王郝坡，畅，丹婷，刘金王春光
ＰＭＬ－ＶｗａａｓｍｐｌｅａｄｌｎｅｉｔｐＧＢＫＴ７ｕｃｓｆｌｙＴｅａｔｅｔｒｓｔａｆｒｅｉｔＡＨ０ａｗｅａｄｉｄｎｃｏｄｎｏｉｆｓｃｅｓｕｌ．ｈｂｉｖｃｏＷａｒｎｓｏｍｄｎｏ１９ｓｌｎｎｏ
ｓｒｅｉｔｅａｇｔｒｔｉｓｎｅａｔｎｗｉｔｅａｔｒｔｉｔｏｇｔｅｅｓｔ－ｈｂｒｄｙｔｍ．ＭｅｈｏｄＴｈｆａｍｅｓｆｃｅｎｎｇｈｔｒｅｐｏｅｎｉｔｒｃｉｇｈｔｈｂｉｐｏｅｎｈｒｕｈｈｙａｔｗｏｙｉｓｓｅｔｓ：ｅｒｇｎｔｏＰＭＬ—ＶｂｎｉｇｏａｎｉｄｎｄｍｉｗａａｐｉｅｂＰＣＲ，ｄｈｅｗａｃｏｅｉｔｔｅｓｍｌｆｄｙｉｎａｔｎｓｌｎｄｎｏｈｂａｔｘｒｓｉｎｅｔｒＧＢＫＴ７．ＡｆｅｂｉｇｉｅｐｅｓｏｖｃｏｐｔｒｅｎｖｒｆｂｓｑｎｉｔｂｉｖｃｏｐＧＢＫＴｅｉｉｅｄｙｅｕｅｃｎｇ，ｈｅａｔｅｔｒ７－ＰＭＬ－ＶＷａｔａｓｏｍｅｉｔＡＨ１９ｅｓｃｌｓＴｅｔｅｐｅｓｏｏｔｅｓｒｆｒｄｎｏｎ０ｙａｔｅ．ｈｎｈｅｘｒｓｉｎｆｈ

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玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用检测马芳芳;王瑞云;蒋明义【摘要】玉米中ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力,然而截至目前对其潜在的分子机制却知之甚少.为构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体,并检测其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性,利用gateway技术,以实验室保存的重组质粒pMD19T-ZmMPK5为模板,扩增得到带有attB位点的ZmMPK5基因的ORF片段,通过BP重组反应和LR重组反应,最终将该片段构建到诱饵表达空载体pDEST32上,PCR及测序鉴定结果表明,成功构建了阅读框方向和序列均正确的重组诱饵载体pDEST32-ZmMPK5.用PEG/LiAc法将重组诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5转化酵母菌株MaV203感受态细胞,通过缺陷型平板表型分析以及X-gal分析实验检测诱饵载体表达的蛋白对宿主细胞是否具有毒性和自激活作用.最终结果表明构建的诱饵载体对宿主酵母菌MaV203既无毒性也无自激活活性,可用于后续研究,为进一步利用酵母双杂交方法从玉米cDNA文库中筛选与ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基础.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】6页(P170-175)【关键词】ZmMPK5;酵母双杂交;诱饵载体;MaV203;自激活【作者】马芳芳;王瑞云;蒋明义【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷030801;南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095;山西农业大学农学院,山西太谷030801;南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】S513;Q78促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Proein kinase, MAPK)级联反应是生物体适应外界环境刺激的重要的细胞信号转导途径[1,2]。

作为级联途径中最后一个组成成分，植物MAPK在各种信号转导中处于核心地位，参与调控了众多诸如病原物、激素信号、活性氧、干旱、盐渍、低温、热激、渗透胁迫、机械刺激及损伤、O3、紫外、细胞死亡、重金属、氧化胁迫等信号转导过程以及植物生长发育过程[3～8]。

但目前人们对MAPK是怎样调控这些过程的却知之不多。

解开MAPK作用机理的关键一步是鉴定与MAPK相互作用的蛋白并阐明其在植物体内的生理功能。

目前已经明确的MAPK互作蛋白非常有限，因此需要通过一定的技术手段如酵母双杂交技术来筛选与MAPK相互作用的蛋白，从而更加明确MAPK 级联途径在植物信号转导中的机制和作用。

玉米中ZmMPK5属于MAPK家族的A类蛋白激酶，与OsMPK6、AtMPK6、PsMAPK、NtSIPK同源。

前人研究表明ZmMPK5参与了ABA诱导的抗氧化防护从而增强了植物对干旱、盐渍以及氧化胁迫的忍受能力[9～13]，然而其具体的作用机制尚未明确。

由于蛋白质相互作用在生命活动中扮演着重要角色，研究ZmMPK5相互作用蛋白将是阐明其作用机制的有效途径。

酵母双杂交系统具有许多优势，它的一个很重要的功能就是发现新的蛋白质以及发现蛋白质的新功能，即从cDNA文库中筛选出与已知蛋白相互作用的未知蛋白，进而为探索该蛋白的相关特性及功能奠定基础[14,15]，而构建有效的诱饵载体是运用酵母双杂交系统开展蛋白互作研究的重要前提基础[16～18]。

本研究拟通过构建玉米ZmMPK5酵母双杂交诱饵表达载体，并对其进行毒性和自激活活性的检测，以期利用诱饵载体从玉米cDNA文库中筛选与之相互作用的未知蛋白，从而为探索ZmMPK5的新功能提供线索。

1.1 供试材料1.1.1 菌株、质粒和载体大肠杆菌DH5α、pMD19T-ZmMPK5质粒由本实验室保存；酵母菌MaV203(MATα, leu2-3,112, trp1-901, his3Δ200, ade2-101, gal4Δ,gal80Δ,SPAL10::URA3, GAL1::lacZ, HIS3UAS GAL1::HIS3@LYS2, can1R, cyh2R)、入门载体质粒pDONR222、诱饵空载质粒pDEST32(含GAL4 DNA-Binding Domain)、猎物空载质粒pDEST22(含GAL4 Transcriptional-Activation Domain)、对照质粒pEXP32/Krevl、pEXP22/RalGDS-wt、pEXP22/RalGDS-m1、pEXP22/RalGDS-m2由 Invitrogen公司提供。

1.1.2 主要试剂Platinum Pfx DNA Polymerase、Gateway®BP ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix、Gateway® LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix、Proteinase K Solution购自Invitrogen公司；卡那霉素、庆大霉素、鲑鱼精DNA、PEG3350、LiAc、3-Amino-1, 2, 4-Triazole(3AT)、X-gal为Sigma公司产品；DNA Marker、Taq DNA Polymerase、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、酵母质粒提取试剂盒、溶壁酶购自天根生化科技有限公司；酵母培养所用的培养基购自Clontech公司。

1.1.3 引物attB1-ZmMPK5:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGACGGCGGGGGGCA-3′attB2-ZmMPK5:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT GGGTCCTAGCTGAAATTGAACTTTGGCTAC-3′M13-Forward:5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′M13-Reverse:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′Bait-Forward:5′-AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTG-3′Bait-Reverse:5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2 ZmMPK5诱饵载体的构建参照Gateway Technology操作手册，利用Gateway技术，首先使用含attB位点的引物attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5扩增pMD19T-ZmMPK5质粒(实验室保存)，得到attB-flanked ZmMPK5 PCR 产物，经回收纯化后与attP-containing donor vector pDONR222即入门载体进行BP重组反应，反应结束后，将产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜。

次日以M13 Forward和M13 Reverse为引物做菌落PCR鉴定，选取阳性结果，进行测序。

提取测序结果正确的重组入门载体质粒，与诱饵表达空载体pDEST32的质粒进行LR重组反应，反应产物转化DH5α感受态细胞后涂布于含庆大霉素抗性LB平板上，过夜培养，次日以attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5为引物做菌落PCR鉴定，选取阳性结果进行测序，最终将测序结果正确的重组诱饵质粒命名为pDEST32-ZmMPK5，同时进行保菌。

1.3 酵母感受态细胞的制备及转化制备：将酵母菌MaV203划线于YPDA(Yeast Extract Peptone Dextrose Adenine Hemis-ulfate Medium)平板上，30 ℃倒置培养2～3 d，挑单克隆接种于2 mL YPDA中，过夜培养。

12 000 r·min-1，离心15 s，弃上清，1 mL1×TE重悬沉淀。

12 000 r·min-1，离心15 s，弃尽上清，沉淀重悬于100 μL 1×TE/1×LiAc溶液中，即为酵母感受态细胞。

转化：每100 μL酵母感受态细胞加1 μg质粒、10 μL (100 μg)灭活的鲑鱼精DNA、600 μL 1×TE/1×LiA c/40% PEG 3350；30 ℃，200 r·min-1，30 min；加70 μL DMSO混匀，42 ℃热激15 min，冰浴1 min；12 000 r·min-1离心30 s，弃上清；100 μL 1×TE重悬沉淀，涂于相应SD缺陷型平板；30 ℃培养2～3天。

不同质粒转化样品如下：单转pDEST32；单转 pDEST32-ZmMPK5；共转pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22；空白对照：共转pDEST-32和pDEST-22；强阳性对照：共转pEXP32/Krel和pEXP22/RalGDS-wt；弱阳性对照：共转pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m1；阴性对照：共转pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m2。

1.4 含诱饵质粒酵母菌的鉴定单转诱饵质粒pDEST32-ZmMPK5至酵母感受态细胞(以单转pDEST32空载质粒作为对照)，SD-Leu平板上30 ℃培养；待菌落明显长出后，挑取单克隆接种于5 mL SD-Leu；30 ℃，200 r·min-1过夜培养；其中4 mL菌液进行酵母质粒的提取，以Bait Forward和Bait Reverse为引物做质粒PCR鉴定；将鉴定为阳性的剩余酵母菌菌液进行保菌，即加甘油至终浓度为25%，-80 ℃保存。

1.5 诱饵质粒毒性检测将单转pDEST32-ZmMPK5诱饵质粒和单转pDEST32空载质粒(对照)的酵母菌按照相同条件涂布在SD-Leu平板上，30 ℃培养，针对两者的菌落生长速度、大小、数目、形态等特征进行观察。

分别挑取二者的单克隆，并按相同条件接种于SD-Leu液体培养基，30 ℃，200 r·min-1培养16～18 h后，检测两者的OD600。

1.6 3AT浓度检测诱饵载体自激活活性按照1.3方法，分别共转化pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22、空白对照、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照；待不同转化的SD-Leu-Trp平板上菌落明显长出后，制备Master板，即分别挑取不同转化的两个单克隆在同一SD-Leu-Trp平板上划短线；30 ℃培养18 h后，用无菌绒布将Master板上的菌落复制到含不同浓度(0、10、25、50、75、100 mM)3AT的SD-Leu-Trp-His平板上，复制后马上清试，30 ℃培养24 h后再清试一遍；30 ℃培养48 h后观察结果。