酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

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酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白罗深恒;许丽红;楚雯;马岳;刁爱坡【摘要】采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.%To screen the candidate protein interacting with prostate transmembrane protein, androgen induced 1 (PMEPA1). The bait plasmid pGBKT7 - PMEPA1 was constructed and transformed into yeast strain Y2H Gold, and then validated by auto - activation and toxicity assays.A universal human library was used for screening with the bait plasmid pGBKT7 - PMEPA1, and positive clones were selected after screening and co - transformation identification. The interaction between two proteins was further analyzed by GST pull - down. The bait plasmid pG-BKT7 - PMEPA1 was successfully constructed. No auto - activation and toxicity were detected. A target protein of Dynactin6 was fished out and GST pull - down assay confirmed the interaction between PMEPA1 and Dynactin6. Dynactin6 was identified as a PMEPA1 interacting protein using yeast two - hybrid system, suggesting that Dynac-tin6 might be involved in regulating intracellular protein transport of PMEPA1. These results will lay a foundation to further study the biological function of PMEPA1.【期刊名称】《华南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(044)004【总页数】5页(P96-99,108)【关键词】PMEPA1;酵母双杂交;Dynactin【作者】罗深恒;许丽红;楚雯;马岳;刁爱坡【作者单位】天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457;天津科技大学生物工程学院,天津300457【正文语种】中文【中图分类】Q789前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protein，androgen induced 1)N-端含有1个跨膜区，由252个氨基酸组成，在正常的前列腺组织大量表达，在前列腺癌细胞中表达量低，且表达水平受雄激素的调控［1-2］，如经雄激素抑制剂处理雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP，PMEPA1表达明显下降［3］．说明PMEPAl是一个雄激素诱导负调节前列腺癌细胞生长的基因，通过DNA甲基化介导的表达沉默在前列腺癌的发生过程中发挥重要的作用［4］．Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)属于泛素连接酶家族的一员［5］，Nedd4泛素化与PMEPA1互作，其功能还不清楚［2，6］．本研究利用酵母双杂交技术从人cDNA文库中筛选PMEPA1的互作蛋白，进一步研究PMEPA1蛋白质间互作在前列腺癌细胞癌变中的作用，为探索治疗前列腺癌的新方法提供科学理论依据．1 材料与方法1．1 材料大肠杆菌Top10和BL21-RIPL感受态细胞，纯化重组蛋白 His-PMEPA1、GST-Nedd4、GSTGolgin84，PMEPA1兔多克隆抗体，由本实验室制备和保存;酵母双杂交系统试剂盒(含表达载体pGBKT7质粒，pGADT7质粒)和酵母菌株Y187(含人cDNA文库)，Y2H Gold均购自Clontech公司;内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA连接酶，PCR高保真酶pfu、Taq酶购自Fermentas公司;DNA纯化和小提质粒提取试剂盒购自天根公司;酵母质粒提取试剂盒购自Clontech公司;谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱购自 GE healthcare公司;YPD、-Trp Do Supplement、-Leu-Trp Do Supplement、-Leu-Trp-His-Ade Do Supplement、X- α -Gal、Aureobasidin A 为Clontech公司产品．1．2 方法1．2．1 诱饵蛋白载体的构建以人PMEPA1基因为模版，上游引物:5’-CACTACAAGCTG TGTCTG-3’，下游引物5’--3’．PCR 扩增PMEPA1序列，下划线酶切位点分别为NdeⅠ和Eco RⅠ．PCR反应程序:95℃预变性2 min;95℃变性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸90 s，30 个循环;72℃延伸5 min;4℃保存．产物用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的DNA片段后利用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切，随后与经酶切好的pGBKT7载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态，经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，提取转化子质粒进行PCR和酶切鉴定后，由北京华大基因公司测序鉴定．1．2．2 免疫印迹检测诱饵蛋白的表达参照Clontech说明的乙酸锂法将诱饵载体pGBKT7-PME-PA1和空载体pGBKT7分别转化酵母菌Y2H Gold，涂布SD/-Trp固体培养基，30℃培养2～3 d后，挑取转化子在50mL SD/-Trp培养液中培养20～24 h．裂解菌体并提取酵母菌蛋白，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后直接经半干法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，用一抗PMEPA1兔多克隆抗体和二抗Alexa680标记羊抗兔IgG(Invitrogen)免疫印迹检测PMEPA1在酵母菌中的表达．1．2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测将构建好的pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7空载体分别转化到酵母 Y2H Gold中，同时在 SD/-Trp和 SD/-Trp/X-α-Gal/-Aba固体培养基上培养3～5 d后观察，比较菌落生长情况，确定蛋白是否有自激活作用和菌体毒性．1．2．4 诱饵质粒与文库的杂交筛选转化诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1到酵母Y2H Gold中，在SD/-Trp液体培养基中培养至OD600=0．8，离心，收集菌体，用5 mL新鲜SD/-Trp液体培养基重悬，加入1 mL含有文库质粒的酵母菌Y187，加入45 mL 2×YPDA培养基在30℃，30～50 r/min，培养20～24 h．离心，菌体用5 mL 0．5×YPDA重悬后，按200μL/板均匀涂布于直径150 mm的SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/-Aba(DDO/X/A)的平板上(约30块)，30℃倒置培养3～5 d．转移≥2 mm的阳性克隆到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)平板上，30℃倒置培养3～5 d，然后根据酵母在不同缺陷型培养基上的表型分析结果并鉴定阳性克隆．提取能同时激活4个报告基因的阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌Top10感受态，经氨苄霉素抗性筛选，提取猎物质粒．1．2．5 阳性克隆的复转验证和序列分析将候选的质粒与pGBKT7-PMEPA1重新共转至酵母Y2H Gold中，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮筛选后确定复转阳性的质粒，并送公司测序，序列结果用Research和NCBI上BLAST等工具进行分析．1．2．6 GST Pull-down实验以 pGADT7-dynactin6为模板，上游引物:5’GAGAAGACTCAAAA GAGTG-3’，下游引物:5’-TTAGTTCTTTACTGGAGTTG-3’，PCR扩增Dynactin6基因，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，与载体pGEX-4T-2连接构建pGEX-4T-2-Dynactin6重组质粒．转化大肠杆菌BL21-RIPL感受态细胞，使用终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导过夜，细菌收集后使用裂解液重悬，超声破碎细胞，12 000 r/min离心15 min，收集上清，上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，经PBS洗涤3次，用20 mmol/L的还原性谷胱甘肽洗脱，再经PD10柱除盐．以Nedd4+PMEPA1为阳性对照，Golgin84+PMEPA1为阴性对照．取5μg纯化蛋白GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GST-Golgin84 分别与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，各加入0．5μg的His-PMEPA1于4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，加入40 μL SDS上样缓冲液，western印迹检测．2 结果与分析2．1 诱饵质粒pGBKT7-PM EPA1的构建和鉴定根据Genebank中编号为199169．1的PMEPA1基因序列，利用PCR扩增不含跨膜区的PMEPA1序列，获得约690 bp的目的片段，PCR产物经纯化后用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切后连接到pGBKT7载体上，转化大肠杆菌Top10感受态，PCR和酶切验证(图1)，目的片段和质粒大小正确．测序结果表明重组质粒读码框架正确，可用于酵母双杂交筛选．图1 重组质粒的PCR(A)和酶切验证(B)Figure 1 Identification by PCR(A)and enzyme digestion(B)of recombinant plasmid1:DNA marker;2:pGBKT7-PMEPA12．2 诱饵蛋白的表达将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7载体分别转化酵母菌Y2H Gold，扩增培养后提取酵母菌蛋白，免疫印迹检测结果显示，转入诱饵载体pGBKT7-PMEPA1的酵母菌中有外源蛋白PMEPA1表达，而转入空载体pGBKT7的酵母菌中未检测到PMEPA1表达(图2)，表明人PMEPA1蛋白成功在酵母菌Y2H Gold中表达，可以利用酵母双杂交系统从人cDNA文库中筛选潜在的互作蛋白．2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7转化酵母菌Y2H Gold后，涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-gal/-Aba缺陷培养基上培养3～5 d．转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp上均能正常生长(图3)，表明蛋白没有菌体毒性;转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/-Aba上均不能生长，结果与预期一致，表明诱饵蛋白不具有自激活的活性．图2 诱饵蛋白的表达检测Figure 2 Expression assays of baitprotein1:pGBKT7-PMEPA1;2:pGBKT7图3 诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的毒性和自激活检测Figure 3 Toxicity and auto-activation assays of bait plasmidA，B:SD/-Trp;C，D:SD/-Trp/X-α -gal/-Aba2．4 人cDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定将含有人cDNA文库质粒的酵母菌Y187和含有诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的酵母菌Y2H Gold，在SD/Trp-/-Leu/X-α -gal/-Aba(DDO/X/A)缺陷培养基(150 mm)上共培养3～5 d，得到138个阳性转化子，挑取阳性转化子进行His、Ade 的表型分析，将阳性转化子转接到 SD/Trp-/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)缺陷培养基(100 mm)上培养3～5 d，结果获得78个阳性克隆．提取质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞，经过氨苄霉素抗性筛选获得猎物质粒，随后与pGBKT7-PMEPA1共转酵母Y2H Gold，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮复转验证后，得到17个阳性的质粒(图4)．测序后获得3个阳性克隆，表明均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因．2．5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用纯化蛋白 GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GSTGolgin84分别与与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱结合后，与His-PMEPA1蛋白共孵育后，结合物经SDSPAGE电泳分离后，用PMEPA1抗体进行 Western blotting检测．Nedd4+PMEPA1泳道为阳性对照，Golgin84+PMEPA1泳道为阴性对照(图5)，Dynactin6+PMEPA1泳道检测到PMEPA1，表明Dynactin6与PMEPA1蛋白存在相互作用，进一步验证了酵母双杂交的筛选结果．图4 缺陷培养基筛选阳性质粒Figure 4 Screening of positive plasmids on dropoutmedia(A)DDO/X/A(150 mm)(B)QDO/X/A(100 mm)图5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用Figure 5 Identification of interaction by GST pull-down1:5%Input;2:Dynactin6+PMEPA1;3:Golgin84+PMEPA1;4:Nedd4+PME PA13 讨论研究蛋白相互作用的方法很多，其中酵母双杂交技术一直被认为是最为灵敏和可信的方法之一．本研究利用GAL4酵母双杂交系统，酵母菌Y2H Gold具有4个报告基因(ADE2，HIS3，MEL1，AUR1-C)，它们在蛋白质发生相互作用形成完整GAL4结构时被激活表达，作者以PMEPA1-GAL4 DNA结合域融合蛋白为诱饵，筛选用GAL4转录激活域构建的人cDNA文库．通过对人cDNA文库进行选择性平板筛选，及测序和序列分析，确定了3个阳性克隆，均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因，GST pull-down实验也进一步验证PMEPA1与Dynactin6蛋白间的相互作用(图5)．Nedd4基因片段较大(为2．7 kb)，并且其3’非编码区有3 kb，导致筛选用的cDNA文库中没有含Nedd4基因片段．PMEPA1是一个前列腺跨膜蛋白，在前列腺中大量表达，而PMEPA1蛋白在前列腺细胞癌变过程中表达水平明显下降或者缺失［6］．Nedd4能够通过泛素依赖蛋白酶体介导的蛋白降解，对细胞分化、增殖、凋亡等过程起着重要的作用．动力蛋白激活蛋白Dynactin复合体是真核细胞中由多亚基组成的蛋白复合物，与动力蛋白dynein结合，使其沿微管做长距离囊泡运输，并且在细胞有丝分裂及分化成熟中发挥重要作用［7］．组成Dynactin复合体的亚基按其结构特点分为3类:(1)长臂样结构亚基蛋白:DCTN1，DCTN 2和DCTN3;(2)Arp1棒状结构亚基蛋白:Arp1，actin，CapZ;(3)尖末端亚基蛋白:Arp11，DCTN4，DCTN5，DCTN6［8］．DCTN 1直接与动力蛋白和微管结合，对Dynactin复合体的结构和功能维护发挥至关重要的作用;DCTN2影响微管到中心体的锚固［9］;DCTN4直接结合Arp1亚基［10］．Arp1亚基已经被证明是 Dynactin复合体和囊泡结构(如高尔基体)连接的结构域［11］．动力蛋白在细胞内膜细胞器运输中有重要功能［12］．PMEPA1 是高尔基体相关的跨膜蛋白［6］，在胞内体上也有定位［13］，本研究结果暗示动力蛋白激活蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在高尔基体和胞内体间的运输．参考文献:［1］RICHTER E，SRIVASTAVA S，DOBIA．Androgen receptor and prostate cancer［J］．Prostate Cancer P D，2007，10(2):114-118．［2］LIH，XU L L，MASUDA K，et al．A feedback loop between the androgen receptor and a NEDD4-binding protein，PMEPA1，in prostate cancer cells［J］．J Biol Chem，2008，283(43):28988-28995．［3］BUEHLER P，FISCHER T，WOLFP，etal．Comparison of gene expression in LNCaP prostate cancer cells after treatmentwith bicalutamide or 5-alpha-reductase inhibitors［J］．Urol INT，2010，84(2):203-211．［4］RICHTER E，MASUDA K，COOk C，et al．A role for DNA methylation in regulating the growth suppressor PMEPA1 gene in prostate cancer ［J］． Epigenetics，2007，2(2):100-109．［5］WANG X，TROTMAN L C，KOPPIE T，et al．NEDD4-1 is a proto-oncogenic ubiquitin ligase for PTEN［J］．Cell，2007，128(1):129-139．［6］XU L L，SHIY，PETROVICSG，et al．PMEPAI，an androgen-regulated NEDD4-binding protein，exhibits cell growth inhibitory function and decreased expression during prostate cancer progression［J］．Cancer Res，2003，63(15):4299-4304．［7］SPUDICH JA，GERHART J，MCKNIGHT S L，et al．Dynactin ［J］．Annual Review of Cell and Developmental Biology，2004(20):759-779．［8］ECKLEY DM，GILL SR，MELKONIAN K A，etal．A-nalysis of dynactin subcomplexes reveals a novel actinrelated protein associated with theArp1 minifilament pointed end［J］．JCell Biol，1999，147(2):307-320．［9］UETAKE Y，TERADA Y，MATULIENE J，et al．Interaction of Cep135 with a p50 dynactin subunit in mammalian centrosomes［J］．Cell Motil Cytoskel，2004，58(1):53-66．［10］KARKIS，TOKITOM K，HOLAZBAUR E L．A dynactin subunit with a highly conserved cysteine-rich motif interacts directily with Arp1［J］．JBiol Chem，2000，275(7):43-48．［11］HOLLERAN E A，TOKITO M K，KARKI S，etal．Centractin(ARP1)associates with spectrin revealing a potential mechanism to link dynactin to intracellular organelles［J］．JCell Biol，2001，135:1815-1829．［12］翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学［M］．北京:高等教育出版社，2011．［13］YUKIHIDEW，SUSUMU I，TOSHIYASU G．TMEPAI，a trans membrane TGF-b-inducible protein，sequesters smad proteins from active participation in TGF-b signaling［J］．Mol Cell，2010，37(1):123-134．。

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建

HeLa细胞cDNA文库及酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308的构建田颖新;王春苗;刘雪晴;贾晓晖;贾天军【摘要】旨在利用酵母双杂交系统构建HeLa细胞的cDNA文库,并构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CPn0308.从HeLa细胞中提取总RNA,应用SMARTTM技术,构建以pGADT7-Rec为载体的HeLa细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库.应用PCR技术扩增目的片段CPn0308,并成功克隆该基因到诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒转化酵母菌株AH109后,检测诱饵载体有无自激活和细胞毒性作用.结果显示,文库展现良好的多态性,重组诱饵载体pGBKT7-CPn0308不具有毒性且未自主激活报告基因,说明该文库和诱饵质粒可用于酵母双杂交系统.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】5页(P148-152)【关键词】HeLa细胞;cDNA文库;pGBKT7-CPn0308;酵母双杂交;自激活【作者】田颖新;王春苗;刘雪晴;贾晓晖;贾天军【作者单位】河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000;河北北方学院病原生物学实验室,张家口075000【正文语种】中文肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae，CPn）是一类革兰氏染色阴性、具有严格的活细胞内生长特性的微生物。

肺炎衣原体已被确定是呼吸道疾病的常见病原体，并与动脉粥样硬化[1]、老年痴呆症[2]、淋巴肉芽肿[3]、关节炎[4]和急性冠脉综合征[5]等有关。

包涵体是衣原体赖以生存和繁殖的微环境，衣原体致病的关键特性之一是其具有阻止包涵体与宿主细胞的溶酶体融合的能力[6,7]，从而避免宿主细胞对衣原体相关抗原的内源性途径的提呈而得以生存，对包涵体膜蛋白进行深入研究有助于解释衣原体的生理发育和致病机制，因而引起学者的极大关注。

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活

酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-cide-3的构建、鉴定以及毒性、自激活效应的检测闵婕;李青;马楠;康艳霞;李娜【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2013(021)003【摘要】Objective;To construct a bait vector containing human cide -3 gene in yeast two -hybrid system in order to screen the human liver cDNA library. Methods; The fragment including all exons of cide -3 gene was amplified by RT-PCR and was inserted into the multiple cloning sites of the shuttle vector pGBKT7. After confirmation with restricted endonuclease digestion and sequence analysis,by using PEG/LiAC method,the plasmid pGBKT7 - cide -3 was transformed into yeast AH109. The plasmid and protein isolated from the positive yeast AH109 clone was tested its expression,toxicity and transcriptional activation. Results:The human cide -3 cDNA was amplified. The restrictive endonuclease digestion and DNA sequencing proved that the plasmid pGBKT7 - cide - 3 was obtained. The yeast AH109 clone transformed with pGBKT7 - cide - 3 was screened out by the SD/ - Trp nutritional media. Sequence analysis revealed that the fragment was correctly inserted into pGBKT7 with a right reading frame and its expression in yeast was verified. Conclusion; The bait plasmid pGBKT7 -cide -3 constructed expresses correctly,and can not activate the transcription of。

酵母双杂交表达载体pGADT7—tTGA2的构建及酵母菌的转化

酵母双杂交表达载体pGADT7—tTGA2的构建及酵母菌的转化作者：何乐肖牧徐健阮颖来源：《安徽农业科学》2014年第30期摘要[目的]研究TGA2在植物系统获得抗性中所起的作用，阐明其作用机制。

[方法]通过PCR扩增获得拟南芥中TGA2基因全长CDS序列，克隆至pGADT7酵母表达载体，并转化至AH109酵母菌株中。

[结果]重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCR及单、双酶切验证重组质粒构建成功。

将重组质粒又转化到AH109酵母菌中，并在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。

[结论]为进一步研究TGA2参与水杨酸诱导抗性基因表达的作用机制奠定了良好的基础。

关键词 AtTGA2；CDS克隆；酵母转化中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10467-02作者简介何乐（1990- ），女，湖南长沙人，硕士研究生，研究方向：分子抗性。

*通讯作者。

TGA转录因子是一类含碱性DNA结合结构域和亮氨酸拉链结构域，可以结合到PR1基因启动子应答性的顺式作用元件。

它因含有TGACCG/as1（Activation seguence1）元件而得名[1-2]。

该类启动子通过与NPR1 基因协同作用参与植物对病害的防御作用。

具体作用方式为NPR1 寡聚体中的半胱氨酸残基分子间二硫键被水解还原，形成NPR1单体，NPR1单体具完整的核定位序列，使其能够转移到细胞核内并与结合在PR1基因启动子区的TGA类转录因子相互作用，调控PR基因的表达和系统性抗性（SAR）的产生[3-6]。

不同TGA成员有2种方式与NPR1互作，第一种是TGA与NPR1直接结合，正向调控PR1基因的表达和抗性的产生，两者结合的强度、保持时间与PR基因表达和抗性产生的强度成正比。

如在一些植物体内，在防卫反应启动子被激活的过程中，TGA因子能与激活子序列（as1）或类as1启动子元件相结合，如拟南芥中的PR1。

酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化

ｓｔｒｅａｍｇｅｎｅｓ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＣＤＳｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ１ｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｗｏｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｐＧＢＫＴ７ａｎｄｐＧＡＤＴ７，
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ＹｅａｓｔＴｗｏ－－－ｈｙｂｒｉｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆａｎｄｐＧＡＤＴ７ＮＰＲ１ＶｅｃｔｏｒｓｐＧＢＫＴ７ＮＰＲ１

hPIN1基因酵母双杂交表达载体的构建_百替生物

hPIN1基因酵母双杂交表达载体的构建及其毒性与自激活效应检测孟祥贵1黄轶2杨梅华3 刘立杰1(1第三军医大学新桥医院健康体检中心，重庆400037；2 重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室, 重庆市生化与分子药理重点实验室，重庆400016；3 第三军医大学新桥医院神经外科，重庆400037) [摘要]目的克隆人肽基脯氨酰顺反异构酶PIN1基因，构建酵母双杂交系统表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。

方法运用RT-PCR 从人胃癌组织中扩增PIN1基因片段,平端克隆入环状自连pMD18-T载体，测序鉴定后以此为模板再次扩增相应片段克隆入酵母双杂交载体pGBKT7与pGADT7中。

醋酸锂法转化酵母菌AH109,检测诱饵蛋白对酵母AH109有无细胞毒性及对报告基因有无激活作用。

结果成功克隆出序列正确的PIN1基因,并正确构建PIN1基因的酵母双杂交表达载体。

PIN1蛋白对酵母菌AH109无细胞毒性,对报告基因亦无自激活作用。

结论可以利用酵母双杂交系统来研究“诱饵”PIN1相互作用的蛋白。

[关键词]: 基因；克隆；肽基脯氨酰顺反异构酶，PIN1；酵母双杂交中图法分类号：Q782 文献标识码：AExpression and construction of yeast expression plasmid containing human PIN1 gene in yeasttwo-hybrid systemMENG Xiang-gui1, HUANG Y i2 , YANG Mei-hua3 , LIU Li-jie11Health Screening Center，Xinqiao Hospital, Third Military Medical University，Chongqing 400037，China;2Department of Biochemistry and Molecular，Chongqing Biochemical and Pharmacological Key Laboratory, Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China，3 Department of Neurosurgery，Xinqiao Hospital, Third Military Medical University，Chongqing 400037，China.[Abstract]AIM: To construct yeast expression vector containing human PIN1 gene in orderto screen its interaction proteins in yeast two-hybrid . Methods Human PIN1 gene was amplified byRT-PCR from human gastric cancer tissue and inserted into pMD18-T by blunt-blunt ——————————作者简介：孟祥贵, 男，教授，主任医师，硕士生导师，Tel：（023）68755674，Email：yihuang828@ 通讯作者：黄轶, 男，讲师，Tel：（023）68485398，Email：yihuang828@ ligation. After verified by sequencing, the bait pGBKT7-PIN1 and pGADT7-PIN1 were constructed with pMD18-T- PIN1 as template.PIN1 bait plasmid was subsequently transformedinto yeast cell AH109, and its toxicity to AH109 and transcriptional activatition to reporter gene were tested with yeast two-hybrid system.. Results: Human PIN1 gene was abtained successfully.Sequence analysis revealed that PIN1 gene were in-frame inserted into pGBKT7 and pGADT7 vectors.Its expression product showed to be nontoxic to AH109 and did not activate the reporter genes. Conclusion The plasmidpGBKT7-PIN1 can be applied as a bait to trap the interaction protein from cDNA library by using yeasttwo-hybrid.[Keywords]：gene；cloning；PIN1；peptidyl-prolyl cis-trans isomerase; yeast two-hybrid PIN1基因（peptidyl-prolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1 ，PIN1),及Pinl蛋白质属多肽脯氨酰基顺反同分异构酶(Peptdyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase，)家族Pinl型亚家族,目前推测磷酸化特异性的肽基脯氨酰异构可能作为一种计时机制[1]，它允许细胞以种高效而精确的方式打开或关闭某些磷蛋白的功能。

酵母双杂交操作步骤

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。

优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。

优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。

PnsICE1基因酵母双杂交诱饵载体构建及转录自激活检测

PnsICE1基因酵母双杂交诱饵载体构建及转录自激活检测作者：王艳敏来源：《现代农业科技》2015年第13期摘要为了更好地研究与PnsICE1基因互作的蛋白，利用PCR方法扩增含有pGBKT7载体同源序列的PnsICE1基因片段，构建酵母双杂交载体。

测序结果表明，构建的目标基因序列正确。

将诱饵载体质粒转化酵母菌株Y2H感受态细胞，PnsICE1转化菌在SD/-Trp营养缺陷型培养基中正常生长，在SD/-Trp/X-a-Gal筛选培养基上长出蓝色的酵母单菌落，说明PnsICE1转录因子具有转录自激活活性。

关键词 PnsICE1；诱饵载体；转录自激活；测序中图分类号 Q943.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）13-0186-02Construction of Yeast Two-Hybrid Bait Vector of PnsICE1 and Testing of Autonomous Transcriptional ActivationWANG Yan-min 1，2（1 Forestry Science Research Institute of Heilongjiang Province，Harbin Heilongjiang 150081； 2 Key Laboratory of Fast-Growing TreeCultivating of Heilongjiang Province）Abstract In order to screen the PnsICE1 interacted proteins，the CDS sequence of PnsICE1 contains pGBKT7 vector homologous sequences was amplified using PCR and inserted into pGBKT7 vector to construct the bait vector for yeast two-hybrid（Y2H）system. Sequencing result showed that the PnsICE1 sequence was inserted into pGBKT7 vector in correct reading frame. Furthermore，the bait vector was transformed into Y2H yeast strain to test the autoactivation. The transformed yeast grew very well on SD/-Trp plate，in the SD/-Trp/X-a-Gal screening yeast，grown on the medium blue single colony，PnsICE1 transcription factor has the transcriptional activation activity.Key words PnsICE1；bait vector；autoactivation；sequencingICE1（inducer of CBF expression1）是编码一个类似转录激活基因（MYC）的bHLH转录因子，在常温下钝化，在低温条件下，能够与CBF3启动子中的MYC作用元件特异性结合，从而诱导CBF3的表达，CBF3进一步结合到其下游目的基因启动子的DRE序列，诱导下游一系列冷诱导基因的表达，继而提高转基因植株的抗寒性[1-3]。

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酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPR1与pGADT7_NPR1的构建及酵母菌的转化肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【摘要】NPR1是水杨酸介导的系统获得性抗性(SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子.在SA诱导下,NPR1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合,以启动下游基因的表达.本研究通过PCR扩增获得拟南芥中NPR1基因CDS序列,经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上,并成功将其转化至Gold酵母菌株中.为利用酵母双杂交筛选NPR1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础.%NPR1 is an indispensable transcription co-factor in SAR induced by salicylic acid.Upon the SA stimuli,NPR1 is translocated into the nucleus and interacts with some transcription factors,and then starts the expression of downstream genes.In this study,CDS sequence of NPR1 was cloned into two yeast expression vectors pGBKT7 and pGADT7,and then was transformed into yeast Gold strain.This study laid a foundation for sifting other possible proteins in transcriptional complex with participation of NPR1 by Yeast Two-Hybrid and elucidating its interaction model in plant defense signal transduction pathways.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2013(027)003【总页数】4页(P213-216)【关键词】NPR1;基因克隆;酵母双杂交载体;酵母转化【作者】肖牧;徐健;何乐;刘春林;阮颖【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】Q78拟南芥NPR1是水杨酸(Salicylic acid)介导的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其生物学功能的基础［2］。

在SA诱导下，NPR1被转入到细胞核内并与一些转录因子结合，启动下游基因的表达。

它介导植物对一系列水杨酸途径应答的植物病原菌，如 Pseudomonas syringae和Peronospora parasitica的抗性。

拟南芥中，过量表达NPR1能够增加植物对水杨酸或者功能类似物，如MeSA、BTH的敏感性，但并不会导致植物的形态改变，在未受到诱导物或者病原菌刺激的情况下，病原相关基因PRs(pathogenesis－related gene)的表达水平亦不会出现明显上升。

而在受到刺激后则表现出更强的PR1基因诱导以及对病原菌的抗性［2］。

NPR1缺失突变背景下，拟南芥表现出对各种SAR诱导物不敏感、丧失PR基因表达以及对各种细菌病害易感性增强［3］。

有关NPR1在水杨酸介导的SAR途径中的作用模式已有详尽报道［4］。

已知 SAR过程中，NPR1被转运至细胞核内对于PR基因的转录激活是必需的，但NPR1蛋白质本身并不包含任何DNA结合序列，且行使生物学功能的两个关键结构域(BTB/POZ，ankyrin repeat)均参与蛋白质相互作用的过程，这暗示着NPR1在SAR过程中起着一个间接的调控作用［2］。

进一步的研究表明，NPR1出入细胞核的过程受到SA及类似物触发的细胞内氧化还原电势调控［5］。

NPR1蛋白之间通常以二硫键链接而形成多聚体的形态存在于细胞质内，在受到SA诱导后，细胞内氧化还原电势发生改变而引起二硫键被剪切，NPR1多聚体被还原成单体并被转运到细胞核内。

NPR1在细胞核内与转录因子TGAs或者NIMINs结合，从而影响转录因子的DNA结合效率，进而从转录水平上对下游防御基因进行调控［6，7］。

此外，NPR1 亦能够与拟南芥中与其本身同源的两个蛋白——水杨酸受体NPR3，NPR4分别相互作用，且作用模式依赖于接收的SAR信号的强度，进而经由泛素化过程，来调节NPR1蛋白水平，这个过程对于拟南芥中SAR的建立同样关键［4，8］。

为了进一步研究NPR1在植物防御反应中的作用，并阐明其在调节不同防御信号传导途径中的具体作用机制，本研究利用特异性引物扩增哥伦比亚野生型拟南芥中的NPR1基因，并将其分别克隆至pGBKT7、pGADT7酵母双杂交表达载体上，为利用酵母双杂交技术寻找与NPR1转录辅助因子相互作用的蛋白并进一步理解其在植物防御信号中的作用模式以及调控下游基因转录水平的机理奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂限制性内切酶(RE)EcoR I、BamH I、T4 ligase、PCR Mix、LongAmp Taq DNA polymerase、PMD19 － T载体购自Takara公司;琼脂糖(Agarose)购自西班牙Biowest;质粒提取试剂盒购自Ambiogen公司;柱式DNA胶回收试剂盒、标准分子量DNA Marker购自Transgen公司;酵母用培养基购自Sigma;其他常用试剂均为分析纯，购自上海国药。

1.1.2 质粒与菌株大肠杆菌DH5α，酵母菌株(Gold菌株)，表达载体pGBKT7、pGADT7均为湖南农业大学植物代谢实验室保存。

1.2 方法(1)引物设计。

根据NCBI上查找到已公布的NPR1基因编码区序列(CDS，全长1 782 bp)，运用引物设计软件Primer Premier5，根据酵母表达载体pGBKT7、pGADT7的表达框及多克隆位点，在上下游引物5'端分别接入相应的酶切识别位点EcoR I及BamH I。

克隆所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

实验所用引物序列如下:NPR1－F:5'GGAATTCCATGGACACCACCAT TGATGGATTCG 3'NPR1－R:5'CGGGATCCCGTCACCGACGACG ATGAGAGAGTTTA 3'(2)重组酵母双杂交质粒示意图如下:图1 pGBKT7_NPR1载体构建示意图图2 pGADT7_NPR1载体构建示意图(3)PCR反应体系。

总体积50 μL，无菌去离子水20 μL，Buffer 6 μL，引物 (10 μM)各1.2 μL，long Taq(2.5 μL)1.2 μL，dNTP(10 mM)0.9 μL，模板cDNA(100 ng)1 μL(拟南芥 cDNA)。

反应参数:94℃ 变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸120 s，运行30个循环。

(4)T载体连接及大肠杆菌转化。

将PCR扩增得到目的片段和pMD19－T载体片段进行连接反应，体系为10 μL(1 μL vector，4 μL DNA，5 μL solutionⅠ)(具体操作参见Takara公司试剂盒说明书)。

(5)酵母双杂交载体构建。

使用限制性内切酶EcoR I、BamH I对 PMD19－T_NPR1重组质粒和pGBKT7、pGADT7载体分别进行双酶切(酶切体系参见Takara公司试剂盒说明书)，琼脂糖电泳后回收目的基因片段和表达载体片段(操作参见Transgen公司试剂盒说明书)。

在T4连接酶连接体系中将目的基因片段分别与两个表达载体片段连接后，转入大肠杆菌。

挑取阳性克隆进行PCR验证后提质粒进行酶切验证。

1.3 重组质粒转化酵母细胞(1)酵母感受态细胞的制备。

本实验采用醋酸锂介导转化法分别将两个重组质粒转化至Gold酵母菌株(操作流程以及选用试剂参见Clontech公司MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System User Manual)。

(2)重组质粒的转化。

将鲑鱼精 DNA、酵母感受态细胞以及重组质粒混匀后加0.7 mL PEG/LiAc溶液，30℃振荡培养30 min，再加入0.07 mL DMSO混匀，于42℃热激15 min，冰浴15 min，离心后弃上清，将沉淀重悬于1.5 mL 1×TE缓冲液中，分别涂布至缺少相应氨基酸的SD筛选平板。

28℃恒温箱里倒置培养，直至长出酵母阳性克隆。

2 结果与分析2.1 PCR扩增拟南芥NPR1基因图3 LongAmp酶扩增得到的NPR1全长CDS1，2为目的片段。

以引物的Tm降低5℃为基准，上下加减5℃设计退火温度梯度 PCR，确定最佳的退火温度为55℃。

以55℃为退火温度进行PCR扩增，PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，大小与预期一致(1 800 bp左右)(图3)。

2.2 NPR1全长CDS与T－Vector连接及测序结果分析切胶回收扩增出的1 782 bp左右的目的片段，在T4连接酶作用下将其连接到pMD19－T，热激法转化大肠杆菌DH5α，取100 μL菌液涂布于LB固体培养基上(含有氨苄青霉素50 g/mL)生长，筛选获得阳性克隆。

随机挑选数个单菌落进行PCR检测，筛选获得转化子。

挑取菌落PCR检测为阳性的单菌落，接种至含有50 mg/mL Amp的5～10 mL LB液体培养基中，37℃、220 rpm振荡培养。

过夜后提取质粒，利用EcoR I、BamH I进行双酶切验证。

挑选验证正确后的克隆测序，测序结果显示去除酶切位点后序列长度为1 782 bp。