发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研(精)
豆粕脲酶活性相关资料
尿素酶活性与抗胰蛋白酶之间关系，Wright(1981)
脲酶活性测定的局限性
局限性
尿酶活性没有负值，它对任何过熟豆粕的最低值为零；对于 加热过度的豆粕尿酶测定值不是一个可靠的指标 。
解决办法：
利用蛋白质溶解度去评价。原理是：加热使游离氨基酸与其 它化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内 的结合键，因而降低了蛋白质的溶解度 。一般要求蛋白质溶 解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85% 时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度
PH增值法（续）
操作方法
准确称取0.400g样品2份，分别置于两支比色管中，一只比 色管中加入20ml磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一 只比色管中加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在 30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇 匀一次。取出后立即加入饱和氯化汞溶液2～3滴，在冷水中 冷却，5min内测定溶液的PH值。
另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用 水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
滴定法（续）
仪器与器皿 pH计 恒温水浴 比色管 10ml移液管
滴定法（续）
试剂
尿素：分析纯 尿素缓冲液：4.45g磷氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并
稀释至1000ml，再将30g尿素溶于此缓冲液中。 0.1mol/l盐酸 0.1mol/l氢氧化钠标准溶液
标定方法：取基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，溶于50ml水中，加 热至沸，加入2～3滴酚酞指示剂，用配制的氢氧化钠标准溶液 滴定至呈粉红色30s不退色为终点。以下列公式计算浓度：
发酵豆粕资料
发酵豆粕1、外观物性：外观呈淡黄色粉状，味微酸，具有饼粕发酵物之香味。
2、常规指标•粗蛋白Crude Protein≥50%•无氮抽出物 Non-nitrogen extrout≥25%•粗灰份Crude Ash ≤7%•粗纤维Crude Fiber≤5%•水分Moisture≤10%•粗脂肪Crude Fat≤3.0%3、消化率（DCP）：≥95%4、乳酸含量：≥30mg/g PH：5.2±02氨基酸含量％氨基酸含量％天门冬氨酸Asp 6.11 蛋氨酸Met 0.78 苏氨酸Thr 2.14 异亮氨酸IIe 2.42 丝氨酸Ser 2.61 亮氨酸 Leu 4.02 谷氨酸Glu 9.98 酪氨酸Tyr 1.91 脯氨酸Pro 2.58 苯丙氨酸Phe 2.70 甘氨酸Gly 2.36 赖氨酸Lys 3.28 缬氨酸Val 2.52 组氨酸His 1.40 丙氨酸Ala 2.51 精氨酸Arg 3.60 以上氨基酸总量：50.92河北职业技术学院检测检验中心（沧州）氨基酸检验报告仪器型号：日立L-8800高速氨基酸分析仪分析：审核：制表：检验日期：发酵豆粕营养指标主要营养指标粗蛋白≥45-60% 、粗脂肪≤3.0％、粗纤维≤5.0％、粗灰份≤7.0％、总钙 0.53％、总磷 8.50％、有效磷 7.40％、无氮浸出物≤28.0％、水份≤10％、乳酸≥3％、益生菌≥108cfu/g 、钾 22000mg/kg、镁5094.7mg/kg、铜16.2mg/kg 钠242.2mg/kg铁168.8mg/kg 锌213.4mg/kg 锰21.8mg/kg猪消化能(DE) 3985kcal/kg 猪代谢能(ME) 3600kcal/kg 猪净能(NE) 2305kcal/kg禽代谢能(ME) 2575kcal/kg 肉牛消化能3520kcal/kg 奶牛净能1090kcal/kg羊消化能3520kcal/kg 总能4350kcal/kg氨基酸分析氨基酸含量（%）氨基酸含量（%）氨基酸含量（%）天门冬氨酸Asp 5.40%赖氨酸Lys 3.05% 蛋氨酸Met 0.65% 胱氨酸Cys 0.46% 苏氨酸Thr 2.05%亮氨酸Leu 3.78% 精氨酸Arg 3.50%甘氨酸Gly 2.14% 丝氨酸Ser 2.48%异亮氨酸Ile 2.21% 苯丙氨酸Phe 2.40%缬氨酸Val 2.35% 组氨酸Hi 1.25%谷氨酸Glu 9.80% 丙氨酸Ala 2.24% 脯氨酸Pro 2.08%色氨酸 Trp 0.56%酪氨酸 1.20%抗营养因子比较抗营养因子大豆蛋白发酵豆粕抗营养因子大豆蛋白发酵豆粕胰蛋白酶抑制因子10-60mg/g —大豆抗原100 —植酸 1.00% —大豆球蛋白4% ≤1.5 ppm脲酶活性0.35% —ß－大豆伴球蛋白 2% ≤1 ppm脂肪氧化酶活性100% —凝血素 3% ≤0.5 ppm致甲状腺肿素165.59ppm —寡糖 6% ≤1%与鱼粉的比较指标鱼粉发酵豆粕指标发酵豆粕氨基酸态氮量78%90% 贮存期短长灰份14%≤7.0%抗氧化剂有无生物胺有无化学污染可能无品质易变化稳定病原菌污染可能无。
发酵豆粕各项指标检测方法与标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵工艺2010-12-31 15:16:17 阅读86 评论0 字号：大中小订阅1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
大豆制品中脲酶活性的测定
制作人：刘力、李亚杰
背景
大豆制品中含有大量抗营养因子，影响到动物的正常生长 发育。其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子，不耐热，但在 点击添加标题 生产加工过程中，过度的加热在灭活抗营养因子的同时， 导致蛋白质变性，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等严重 点击添加标题 变性，大大降低了大豆制品的消化率和生物学价值。抗胰 蛋白酶活性是直接反映大豆制品中抗营养因子水平及加热 程度的可靠指标，但由于该法费时、所用试剂昂贵，在生 点击添加标题 产上不适用。而脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关， 方法较简便、快速、经济，国内外常用脲酶活性作为检验 点击添加标题 大豆制品加热程度和抗营养因子水平的判断指标。
注意事项
若样品粗脂肪含量高于 点击添加标题 10%，则应先进行不 加热的脱脂处理后，在测定脲酶活性； 点击添加标题 称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则 会造成试验误差； 点击添加标题 试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防 止时间影响。 点击添加标题
问题
反应时间（30min ）对脲酶活性是否有影响？ 点击添加标题
仪器设备
粉碎机：粉碎时应不生强热，如球 点击添加标题 磨机。
点击添加标题 点击添加标题
点击添加标题
测定步骤
样品中脲酶活性的测定：称取0.2 g（准确至0.0001 g）样品（如果活性很
高，可称取0.05 g试样）玻璃试管中，加10 mL尿素缓冲液，立即盖好试管 盖剧烈振摇后，马上置于30±0.5 ℃水浴锅内，准确计30 min±10 s。取下 点击添加标题 后立即加入10 mL盐酸（0.1 mol/L），振摇后迅速冷却至20℃，将试管内容 物全部转入50 mL烧杯中，用20 mL蒸馏水冲洗数次，以0.1 mL的氢氧化钠 标准滴定溶液用酸度计滴定至 pH 4.70。记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量。 点击添加标题 如果选用指示剂，试管中内容物全部移入250 mL锥形瓶中，滴加8~10滴混 合指示剂，以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至蓝绿色，记录氢氧化 点击添加标题 钠滴定溶液消耗量。 空白测定：称取样品后立即加入10 mL盐酸溶液，之后不加。
大豆中脲酶活性的测定
e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度， mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体 积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的 体 积，ml； m——试验质量，g。
比色法
原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓 冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在 30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作 用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和 麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚， 借以比色。
大豆饼粕中脲酶活性的测定
豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一 种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗 营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料 中的应用。
大豆中的抗营养因子
胰蛋白酶抑制剂 植物红细胞凝集素 皂甙 胃肠胀气因子 植酸 抗维生素 致甲状腺肿因子
这些抗营养因子大多是不耐热的，
在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失 活，从而降低或者失去其有害作用 ，因 此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须 对大豆粕进行充分而又适当的加热，这 样才能使其中的抗营养因子失活 。
评价大豆饼粕的指标
脲酶活性： 检测豆粕的加热程度是否足以 破坏其中的抗营养因子的指标。 蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的 一个指标。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上 滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中， 放置5min后观察结果。 无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出 现，说明豆粕过熟； 有少量红点出现，说明脲酶活性较低，豆粕可 用； 样品表面有25％被红点覆盖，豆粕可用； 样品表面有50％被红点覆盖，应慎用； 样品表面有75％－100％被红点覆盖，脲酶活 性过高，豆粕过生，不可用；
大豆中的抗营养因子?胰蛋白酶抑制剂?植物红细胞凝集素?皂甙?胃肠胀气因子?植酸?抗维生素?致甲状腺肿因子这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因此在大豆加工生产饲用饼粕时必须此在大豆加工生产饲用饼粕时必须对大豆粕进行充分而又适当的加热这样才能使其中的抗营养因子失活
发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研(精)
发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1’张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。
用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。
关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。
发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。
这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。
发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。
大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。
这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。
本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。
1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。
豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性测定方法研究 (2)
收稿日期 :2005 - 11 - 03 ;修回日期 :2005 - 12 - 09
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一个胰蛋白酶单位 (AU) ,是 10ml 反映溶液在 本文叙述的条件下 ,于 410nm 处测得反映前后所增 加 0. 01 光密度为 1 单位 (Absorbance Unit) ,胰蛋白酶 抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位 ( TLU) 表示 。 2 结果计算
用 TLUΠml 对分析所用提取液体积 (ml) 做标准 曲线 ,并外推到零 。每克样品的 TLU 值 = 延伸值 × 稀释倍数 ,当用分析的提取液的 TLUΠml 对分析液体 积做图并不是直线关系时 ,则计算出每单位体积提 取液中 TLU 平均值 ,则 TLUΠg 样品 = 平均值 ×稀释 倍数 , 测出常见豆制品结果见附图 。
王英男1 ,修建成2 ,富校轶1 ,李家栋1
(1. 国家大豆工程技术研究中心 ,哈尔滨 150050 2. 哈药总厂哈尔滨康铃科技开发有限责任公司 ,哈尔滨 150086)
摘要 :利用紫外分光光度计 ,对豆制品中胰蛋白酶抑制剂在抑制牛胰蛋白酶活性反应前后的吸光 值差异制作差值曲线 ,从而得出斜率与抑制剂活性之间关系的方法 。并通过反复的实验对比 ,最 终可以快速准确地测定大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性 。 关键词 :豆制品 ;胰蛋白酶抑制剂活性 ;测定方法
Measurement of Trypsin Inhibitor Activities in Soybean Product Wang Yingnan1 ,Xiu Jiancheng2 ,Fu Xiaoyi1 ,Li Jiadong1
质检豆粕总结(3篇)
质检豆粕总结第1篇豆粕中存在着许多抗营养因子，如胰蛋白酶_、低聚糖、大豆凝血素、植酸、脲酶、大豆抗原蛋白(致敏因子)及致甲状腺肿素等，这些抗营养因子不仅影响饲料的适口性，还会影响饲料的营养价值和动物的物质消化吸收以及体内的一些生理过程，严重影响了动物的健康和生产性能。
通常检测豆粕品质的方法有以下几种：1.尿素酶活性(UA)测定法UA测定法是用于测定大豆中脲酶活性的方法，也是测定豆粕中胰蛋白酶_的间接方法，是评定大豆粕的加工程度是否适当及营养品质优劣的传统方法。
将粉碎的大豆粕与中性尿素缓冲溶液混合，在30±℃温度下保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨，在中性条件下用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠回滴，计算出每分钟每克大豆粕释放氨态氮的毫克数来表示尿素酶的活性(UA)。
通常认为豆粕中脲酶活性越低，豆粕的营养价值就越高，但如果加热过度又会引起氨基酸的被破坏。
2.蛋白溶解度(PS)测定法此方法被认为是一项优于UA测定方法的评估大豆加工过度与加工不足的最佳方法。
方法主要是用氢氧化钾溶解豆粕，测定其中的蛋白含量占未用氢氧化钾处理的豆粕中的蛋白含量的百分比，来表示蛋白溶解度。
其原理是：加热使游离氨基酸与其他化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内的结合键，因而降低了蛋白质的溶解。
一般情况下蛋白溶解度低于70%的豆粕营养价值已受到破坏，低于65%几乎可以肯定豆粕加热过度，严重过熟，致使蛋白的消化利用率会非常低。
近年来由于加工技术的改进，PS有增高的趋势。
有研究表明，豆粕蛋白在氢氧化钾溶液中的溶解度和脲酶活性呈正相关。
3.营养成分检测评定根据我国国家标准GB/T19541-2004，饲料用大豆粕的质量标准及分级标准主要以粗蛋白、粗纤维、粗灰分为质量指标，按含量分为三级。
三级大豆粕质量指标必须全部符合相应等级规定，二级饲用大豆粕为中等质量指标，低于三级者为等外品。
测定豆粕各项营养成分是评定豆粕营养价值的重要方法。
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发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1’张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。
用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。
关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。
发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。
这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。
发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。
大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。
这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。
本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。
1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。
1.2胰蛋白酶抑制因子(TI的测定方法发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的测定,参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2--2006, 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:胰蛋白酶抑制剂的测定。
其原理是,胰蛋白酶可作用于底物苯甲酰一L-精氨酸对硝基苯胺(队PA结构中精氨酸与对硝基苯胺的连接键,释放出黄色的对硝基苯胺,该物质在410hm有最大吸收值。
大豆及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应,使吸光度值下降,其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。
用分光光度法在410hm处测定吸光度值的变化, 可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。
1.3凝集素的测定方法发酵豆粕凝集素的测定,参照戴大章<饲料中植物凝集素的快速检测方法>…中的方法进行,其原理是,凝集素具有凝集兔、人等的红细胞的能力,细胞凝集作用是凝集索与细胞表面的糖分子结合在细胞表面形成许多交叉的“桥”的结果。
凝集活力(效价与凝集素的量成线性关系。
因此,利用凝血反应测定其血凝活力,通过比较标准品与待测样品的血凝活力,可以定量检测凝集素含量。
1.4B一伴大豆球蛋白(B—CongIycinin和大豆球蛋白(Glycinin测定方法B--Conglycinin,目前多数人认为这是相对分子量为180kDa的三聚体,是7S的主要组分,由三个亚基(a 7、0、B组成。
可用SDS-PAGE凝胶电泳使其变性,从而将其单体亚基分开。
大豆球蛋白(Glycinin,是纯化的11S大豆球蛋白,目前认为其是相对分子量为360kDa的六聚体,其单聚体亚基的结构为A-S-S-B,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,S-S为二硫键,将A和B连接起来。
B一巯基乙醇(B一脏等还原剂可将Glycinin的亚基和多肽分开幢1。
测定这两者的方法是,用 Tris-HCl提取,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳,对照标准蛋白质Marker,定性检验其在发酵豆粕中存在的情况。
1.4.1抗原蛋白抽提称取过60目的发酵豆粕1.OOg,向其中加入20.OmlO.03mol/L的Tris-HCl(pH8.0,包括 0.Olmol/L B一疏基乙醇,在室温下于摇床上(100r/min浸提1h,然后在10000r/min、20℃条件下离心20min后,取上清液。
此上清液为11S与7S的球蛋白混合液。
1.4.2试剂配制丙烯酰胺30%单体贮液:称取丙烯酰胺29.19,甲叉双丙烯酰胺0.99,于250mi烧杯中,向烧杯中加入约80ml灭菌去离子水,充分搅拌溶解,加灭菌去离子水将溶液定容至lOOml,棕色瓶4度冰箱保存。
分离胶缓冲液贮液1.5M Tris-Hcl(pH8.8:称量18.169Tris置于250Inl烧杯中,加入灭菌水约80ml,充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至8.8,将溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。
浓缩胶缓冲液贮液1.OM Tris-Hcl(pH6.8:称量12.129Tris置于250mi烧杯中,加入约80ml 灭菌水充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至6.8,将溶液定容至毫100m1.4度冰箱保存IO%SDS溶液:称量lOg SDS置于200ml烧杯中,加入lOOml灭菌水溶解,室温保存。
10%过硫酸铵:称取lg过硫酸铵,加入9mi去离子水后搅拌溶解,贮存于4度冰箱中。
5*Tris-Glycine Buffer(电极缓冲液:称量下列试剂于1L烧杯中:Tris15.19,Glycine(甘氨酸949,SDS 5.Og;加入约800ml去离子水,搅拌溶解,加去离子水将溶液定容至lL,室温保存。
样品缓冲液(0.踟Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl浓缩胶缓冲液贮液(1.伽Tris-Hcl,pH6.8,4ml IO%SDS,Iml 8一巯基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚蓝,转移到20ML容量瓶,加去离子水定容到刻度。
染色液:称取0.59考马斯亮兰P,250,加125mi异丙醇溶解,加50ml冰醋酸搅拌均匀,再加325mi去离子水搅拌,然后用快谜定性滤纸过滤.室温保存。
脱色液:取50ml冰醋酸,25ral无水乙醇,42钿1去离子永,混合均匀,室温保存。
I t3不连墟￥OS-P性黜电泳的浓缩腔和分离腔的材取按下表比例配制分离腔与浓缩胶表l 1羁升高睨和鼹浓缩胶配制144电泳将提取液与样品缓冲液以i:l的比例混台后,在100度水浴锅中煮5min取30u1,点样到制作好的电泳板上。
虽白质Marker的用量参照其说明书.内外均加^一样的电极缓冲{瘦,开始以80V电压电泳,持溴酚蓝条带进入分离脞后,加大电压到120V,溴酚蓝到底部上约050I处结柬电泳。
145染色、脱色和照相将电泳后的胶板移^染液中.在转速为40一60r/rain的摇床上染色2h后,转到脱色液中浸泡过夜,期间更换2--3狄脱色藏,至电林条带清晰为止。
用数码相机拍摄凝胶照片,记录井保存。
2结果与分析2I量■活性8种发酵豆粕的腮薛活性均为0。
22胰蛋白一抑崩囚于和疆墓素用上述方法测定了8种发酵豆粕胰蛋白酶抑制园子及凝集素,古量粮低.均未检出23大豆抗原用8种发酵豆粕和一种普通豆粕.做了电泳,图片如下:其中条带5是普通豆粕,9是蛋白质分子量标准(Marker,其余是发酵豆粕,标准物分子量条带如图标注所示,在一定条件下,蛋白质的分子量与电泳迁移率问的关系,可用下式表示:MW=K(10一hlgl哪=lgK—bnh=KI—bml式中:唧为蛋白质的分子量:K,K。
为常数;b为斜率;咖为相对迁移率测量标准物各条带到加样口的距离,而得到分子量与迁移率的相关方程为:y=一1.3275x+2.5002(r=0.99,从而算出7S和1IS的几个亚基的分子量如下表2,同样也把 Maruyama(1998和李德发(2003所研究的几个亚基的分子量列在表中,用以对照。
表2五个亚基的分子量表从图上可见,1、3、4、6、7、8号样品,几个亚基消失,说明大豆抗原已经完全分解,2号和10号样品,两种抗原的条带清楚,说明抗原存在,发酵不彻底。
3讨论3.1腮酶活性(UA尿酶活性测定值是传统的用以鉴定豆柏加热程度的指标。
尿酶本身无营养意义,但它与胰蛋白酶抑制因子的含量接近,而且遇热变性失活的程度与胰蛋白酶抑制因子相似。
在一定范围内,脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子的含量具有强相关性,测定脲酶活性可以间接地反映胰蛋白酶抑制因子的含量。
但尿酶没有负值.它对任何过熟豆粕的最低值均显示为零,而此时胰蛋白酶抑制因子未必为零, 因此测定脲酶活性是不够的,还需要测定胰蛋白酶抑制因子才行。
3.2发酵豆粕胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量在一定的范围内,随着大豆中抗营养因子的受热钝化。
大豆的营养价值得到改善。
在大豆抗营养因子中,胰蛋白酶抑制因子、脲酶和大豆凝集素是热敏性抗营养因子,对热比较敏感。
常压蒸汽处理,温度不超过100℃,蒸汽加热30min,胰蛋白酶抑制因子活性可降低90%㈨。
Oin(1996报道, 当生大豆通入蒸汽,120℃加热7.5min时,胰蛋白酶抑制因子的含量可由20.6mg/g下降到3.3mg/g¨1。
秦贵信(1995报道,常压蒸汽102℃,20min,胰蛋白酶抑制因子下降88%,而40min则下降92%, 60min,全部消失哺1。
与胰蛋白酶抑制因子相比,大豆凝集素对高温更为敏感,这是由于大豆凝集素是一种糖蛋白, 具有不可逆转变性特点,较容易失活。
Qin(1996报道¨1,102"C加热20min,大豆凝集素的存留率只有1.4%,当温度提高到。
提高到120℃,只要1.5min就完全失去活性.采用湿热处理,190"C加热 10—60秒就可以完全失活。
于平等(2001m1报道,湿热处理,加热到80℃.凝集素活性无明显变化,7595℃加热25min才开始明显下降,95℃加热35min或120℃加热15min,其活性可以完全丧失。
目前发酵豆粕是用固体发酵方法生产,其生产工艺流程是:豆粕加水拌匀、蒸煮、接种、发酵、后熟干燥、磨粉、包装。
其中蒸煮灭菌是,在常压下、温度100℃左右,进行蒸煮约30min,这可以使绝大部分胰蛋白酶抑制因子和凝集素失去活性。
胰蛋白酶抑制因子本身是一种蛋白质,可以被蛋白酶水解成更简单的多肽,活性随着酶解反应的进行,而逐步丧失。
Laskowski等(1974盯1发现,胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶能特异性地将KTI水解成多肽,降低其活性。
杨晓泉呻1等(2001研究发现,在一定条件下,碱性内切蛋白酶(alcalase 可同时降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制因子,其中胰蛋白酶抑制因子可被钝化8096。
Huo等旧1(1993用五种来源于细菌和真菌的蛋白酶进行了生大豆(RS和低温膨化全脂大豆粉(LTES中的胰蛋白酶抑制因子和凝集素的体外钝化试验,结果表明,它们都不同程度地钝化抗营养因子,其中一种来源于细菌的蛋白酶分别钝化生大豆中62%的胰蛋白酶抑制因子和91%的糜蛋白酶抑制因子(CIA。