植物凝集素的分离纯化及部分性质测定
猴头菌凝集素的分离、纯化及理化性质的实验草案
猴头菌凝集素的分离、纯化及理化性质的实验草案
一、材料与方法
1.主要材料猴头菌
2.主要试剂硫酸铵(固体)
3.主要仪器离心机血凝板
4.试验方法
（1）凝集素分离纯化：
称取猴头菌实体100g，剪碎，加入适量的生理盐水并研磨均匀，将得到的提取液进行抽提，离心，在上清液加入固体硫酸铵达饱和度进行盐析，取沉淀透析除盐得凝集素粗品。
Sepharose 4B或6B经活化处理后，装柱并经缓冲液平衡，结合相应的糖分子。
凝集素粗品经同一缓冲液平衡后上柱，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，至A280小于0.02后改用相应糖溶液洗脱，收集并检测A280。
收集的溶液透析除糖，冻干即得不同糖结合专一性的猴头凝集素纯品。
（2）凝集素的凝集活性：
把待测样品在血凝板上进行倍比稀释，加入2%血球悬液，静止后观察结果，以最后一个使红细胞凝集的孔的凝集素浓度作为最低抑制浓度。
（3）凝集素的理化性质：
①糖抑制试验：将不同的糖溶液倍比稀释后与等体积的不同凝集素相互孵育，然后与2倍体积的2%红细胞悬液相互作用，抑制凝集素的红细胞凝集活性的最小糖溶液浓度作为糖的最低抑制浓度。
②温度稳定性：凝集素在不同温度下（0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100℃）处理30 min后，检测其红细胞凝集活性。
③pH稳定性：凝集素与不同pH值（1-14）的缓冲液孵育60 min，然后调节pH至7.0，检测其红细胞凝集活性。
二、结果分析
三、讨论。
红藻琼枝麒麟菜中凝集素的提取、纯化及其性质研究
红藻琼枝麒麟菜中凝集素的提取、纯化及其性质研究黄丽波;沈伟哉;李药兰;岑颖洲;许少玉【期刊名称】《华西药学杂志》【年(卷),期】2002(17)6【摘要】目的从琼枝麒麟菜中分离纯化凝集素 ,并测定其生物活性。
方法采用缓冲液低温提取、4 0 %～ 90 %(NH4) 2 SO4分级盐析沉淀、SephadexG - 75凝胶过滤层析进行纯化 ;SDS -PAGE检测其纯度和测定分子量 ;考察该凝集素凝血活性的血型专一性 ,糖抑制性及高温、酸、碱处理下的稳定性。
结果琼枝麒麟菜中有凝集素 ,分子量为2 90 0 0。
该凝集素对人A、B、O和AB 4种类型血细胞均显凝血活性 ,该活性对高温、酸、碱处理有较好的稳定性。
结论琼枝麒麟菜中存在凝集素。
【总页数】3页(P406-408)【关键词】提取;纯化;性质;琼枝麒麟菜;凝集素;凝血活性;植物药【作者】黄丽波;沈伟哉;李药兰;岑颖洲;许少玉【作者单位】暨南大学生命科学技术学院化学系;暨南大学医学院解剖学教研室【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.琼枝和异枝麒麟菜中硫酸酯基多糖不同提取方法的化学分析比较 [J], 梁智渊;岑颖洲;叶绍明;伍秋明2.麒麟菜多糖的研究——Ⅱ琼枝多糖溶液的流变性质 [J], 郑淑贞;林瑞洵;庞建昌;陈世雄3.麒麟菜多糖的研究——Ⅰ．琼枝多糖的性质及其红外光谱 [J], 郑淑贞;陈欣权;曾丽仙;庞建昌;林瑞洵;林慧贞4.超声波辅助酶法提取琼枝麒麟菜多糖及其理化性质研究 [J], 李继伟;杨贤庆;许加超;潘创;戚勃5.超声波辅助酶法提取琼枝麒麟菜多糖及其理化性质研究 [J], 李继伟;杨贤庆;许加超;潘创;戚勃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
饲料中大豆凝集素的分离纯化与生物活性测定
２ ． ５ 后备母猪选育
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案 ，了解祖代、父代 、同胞 、半同胞的信息。
不 良的遗传性状将直接决定它们对肢蹄病 的易感程 度 ，肢 ３ 蹄病治疗 势、肢型与遗传有很大关系 。 治疗蹄病要 以准确诊断为基础 ，根据母猪 的临床症状 ，通 过细致 的问诊 、望诊 、触诊 以及各种特殊检查等诊断程序 ，确定 １ ． ３ 饲养管理 因素 １ ． ３ ． １ 饲养环境 如限位饲养方式、粗糙的地板、漏粪板尖锐的 肢蹄病 的发病原因，根据发病原 因的不同 ，采取相应的措施 ，如 边缘 、湿滑的地 面、不合理的粪尿沟、潮湿高温的环境都会引起 果是疾病引起的应该积极治疗原发病 ；如果是环境 因素引起的 ，
采用高碘酸钠法将林可霉素与牛血清 白蛋 白 （ Ｂ Ｓ Ａ）及鸡卵清蛋 白 （ Ｏ Ｖ Ａ）分别偶联 ，合成免疫原Ｌ Ｉ Ｎ — Ｂ Ｓ Ａ 和包被原Ｌ Ｅ Ｎ — Ｏ Ｖ Ａ， 中采 并 采用 紫外分光光度法 （ ｕ ｖ）和聚丙烯 酰胺凝胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — 高 。且Ｎ 一 乙酰基一 Ｄ 一 半乳糖胺对大豆凝集素的亲和力较高 ，所制 Ａ Ｇ Ｅ）进行鉴定 。结果表明，半抗原Ｌ Ｉ Ｎ 和载体蛋 白偶联成功。 备的大豆凝集素活性测定与标准品一致，试验结果表 明， 该法是 Ｐ 动物免疫试验 （ 免疫Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ￣纯系小 鼠 ）结果显示 ，３ 只小 鼠效价 目 前制备大豆凝集素的最优方法 。 均 达 １： ３ ０ ０ ０ ，且 ２ 号 小 鼠多 抗 血 清 抗 Ｌ Ｉ Ｎ的半 数 抑 制 质量 浓 度 Ｃ ５ ０ 为３ ． ８ ５ ｇ ， Ｌ ，与莫能菌素的交叉反应率为６ ． １ ９ ％，与其他药物 林可霉素人工抗原的合成与鉴定／ 张小辉 （ 河南省农业科学 Ｉ 无交叉反应。表明成功获得高效价 、特异性好 、亲和力高的鼠源 院 农 业部 动 物免 疫 学重 点 开放 实 验 室河 南 省动 物 免疫 学 重 Ｉ Ｎ 多抗 血清 。 点实验室 ，郑州 ４ ５ ０ ０ ０ ），职爱民，侯玉 泽…／ ／ 西北农 抗 Ｌ
绿豆凝集素的分离提取及其部分性质研究
绿豆凝集素的分离提取及其部分性质研究凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。
凝集素在动、植物体内广泛存在。
凝集素具有糖基结合特异性，一种凝集素仅对某一种特定的糖基专一性结合，因此凝集素可以作为探针等研究工具，并且研究凝集素的特异性有助于以分子或原子层次了解生命现象或病理变化。
本文对绿豆凝集素进行了分离提取及纯化，并对其部分基础性质进行初步研究。
绿豆凝集素的凝集活性检测采用凝血法检测，对新鲜兔血红细胞进行处理，戊二醛浓度0.15%(V/V)，固定时间为20min；胰蛋白酶浓度25U/mL，25℃处理15min；提高了兔血红细胞凝集灵敏度且延长了兔血红细胞保存时间。
绿豆凝集素的提取采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)，最佳浸提溶液条件：0.2mol/L、pH7.2PBS。
将绿豆干粒粉碎100目，以料液比0.09（浸提液为1），NaCl浓度0.3mol/L，浸提时间4.16h，20℃下浸提，所得粗提液中绿豆凝集素比活力137.4U/mg。
对绿豆凝集素粗提液进行硫酸铵双重盐析，收集50%~60%饱和度沉淀，凝集素比活力达到805.9U/mg。
采用PEG600-硫酸铵双水相体系，PEG600质量分数15%，硫酸铵质量分数25%，绿豆凝集素样品浓度8mg/mL，萃取后绿豆凝集素凝血活性达到1307.8U/mg。
经过葡聚糖凝胶过滤后凝集活性为1961.9U/mg。
绿豆凝集素具有较强的抗热处理能力，对酸有一定的耐受性，在低pH下依然能保持凝集活性，但是碱性条件下耐受性较差，在pH为8.11的条件下很快失活，在pH6.5~7.5之间具有最大凝集活性。
绿豆凝集素SDS-PAGE电泳显示两条带，凝集素分子量约156.33KDa。
紫外吸收光谱显示具有特征吸收峰为234nm和275nm。
绿豆凝集素的纯化及性质研究的开题报告
绿豆凝集素的纯化及性质研究的开题报告一、选题背景绿豆凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）是一种从天然植物中提取的蛋白质凝集素，在免疫反应和癌症治疗中具有很大的潜力。
绿豆凝集素通过选择性结合细胞表面的糖基化蛋白，使得细胞发生凝集，从而对人体免疫系统相关的细胞和病理性细胞进行研究和治疗。
现有文献中对绿豆凝集素的纯化及其生物学特性研究较少，因此本研究将从绿豆中提取绿豆凝集素并对其进行纯化和性质的研究，为其在临床医学中的应用提供理论基础。
二、研究目的1. 通过对绿豆进行提取和分离，纯化绿豆凝集素，分析绿豆凝集素的生物学性质和纯度。
2. 研究绿豆凝集素在不同条件下的凝集作用及其对血管内皮细胞的作用，探讨其在生物医学领域中的应用前景。
三、研究内容1. 绿豆凝集素的提取和分离：采用醋酸提取法、盐析、凝胶层析等方法对绿豆凝集素进行提取和纯化。
2. 绿豆凝集素的生物学性质分析：采用SDS-PAGE、UV-Vis光谱、免疫印迹、比色法等方法对纯化后的绿豆凝集素进行分析，评估其纯度和生物学活性。
3. 绿豆凝集素的凝集作用和对血管内皮细胞影响的研究：采用细胞实验、体外实验等方法研究绿豆凝集素的作用机制和应用前景。
四、研究意义1. 为绿豆凝集素在临床医学中的应用提供理论基础。
2. 深入探讨绿豆凝集素的生物学性质及其与肿瘤、自身免疫性疾病等疾病的关系，为其开发新药提供依据。
3. 对于理解绿豆的生物学特性，尤其是其对细胞的凝集作用机制，具有一定的学术价值。
五、研究方法与技术路线1. 绿豆凝集素的提取和分离（1）醋酸提取法：将绿豆粉末用生理盐水混合，过滤得到绿豆提取液，再用醋酸沉淀法进行提取与分离。
（2）盐析：将绿豆提取液采用逆流法与硫酸铵逐渐递增加盐，使绿豆凝集素逐渐析出。
（3）凝胶层析：将分离得到的绿豆凝集素溶液与聚丙烯酰胺凝胶混合，在特定的pH值下进行层析。
2. 绿豆凝集素的生物学性质分析（1）SDS-PAGE：对分离纯化后的绿豆凝集素进行SDS-PAGE电泳检测，确定其分子量和纯度。
植物凝集素的分离纯化及部分性质测定
第11周 2011-5-3/4植物凝集素的分离纯化及部分性质测定分离纯化工艺策略：主要是根据物质的结构和性质来选用各种纯化技术。
工艺次序的选择策略包括：1.应选择不同机理的分离单元组成一套工艺；2.应将含量多的杂质先分离出去；3.尽早采用高效分离手段；4.将最昂贵、最费时间的分离单元放在最后阶段。
也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段主要目的是尽量缩小样本体积，提高目的物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）；5.随后是高分辩率的操作单元，如具有选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以使分离效益大大提高。
色谱分离的次序。
一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤之间的过渡。
如：◇在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的交换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强。
◇凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。
总之，蛋白质的纯化大至步骤为：样品经初步提取筛除部分杂质后，选择不同的层析手段相互配合进一步提纯。
第一部分离子交换层析1. 原理：离子交换层析（Ion-exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对各类化学物质或生物大分子因电荷差异而产生不同的结合力，从而将混合物中不同组分进行分离的层析技术。
Cation exchanger（阳离子交换）: 层析介质本身带负电荷,交换带正电荷物质Anion exchanger （阴离子交换）:层析介质本身带正电荷,交换带负电荷物质–当缓冲环境 pH > pI, 蛋白质带负电–当 pH < pI, 蛋白质带正电–当pH = pI, 蛋白质不带电–以阳离子交换树脂交换分离蛋白质的原理和方法为例: 将阳离子交换树脂（本身带负电荷）颗粒填充在层析管内，带正电荷的蛋白质(pH<pI)就被吸引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。
苍耳子凝集素的分离纯化和某些性质研究
苍耳子凝集素的分离纯化和某些性质研究
王先酉;李明
【期刊名称】《衡阳医学院学报》
【年(卷),期】1998(026)001
【摘要】苍耳子仁粉碎后用０．１５ｍｏｌ·Ｌ＾－１ＮａＣｌ、０．００１ｍｏｌ·＾－１ｐＨ７．０磷酸缓冲液抽提，硫到铵沉淀及乳糖－淀粉凝胶柱亲和层析，分离纯化得到苍耳子凝集素。
经聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝Ｒ２５０染色，显示一条蛋白带，其溶液用苯酚－硫酸显色证明是糖蛋白。
苍耳子凝集素使新鲜兔红细胞产生血凝作用所城最低浓度为６．８μｇ·ｍｌ＾－１。
苍耳子凝集素的专一结合的糖为２－乙酰氨基２－２脱氧－Ｄ－半乳糖
【总页数】3页(P37-38,40)
【作者】王先酉;李明
【作者单位】湖北医学高等专科学校;湖北医学高等专科学校
【正文语种】中文
【中图分类】R977.6
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阿魏菇凝集素分离纯化及理化性质的研究
阿魏菇凝集素分离纯化及理化性质的研究
杨爱霞;李应彪;许程剑
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】2014(033)001
【摘要】通过对新疆阿魏菇凝集素的提纯及分析,了解凝集素的基本理化特性,为深入探究阿魏菇凝集素的免疫调节活性在理论上奠定了基础.对阿魏菇组织实体打浆、PBS浸提、硫酸铵沉淀、冷冻干燥,DEAE-cellulose、Sepharose-4B等层析柱法
分离纯化得到较为纯净的凝集素.采用小鼠血液测定凝集素凝集效价的方法初步研
究凝集素的理化性质.分离纯化得到较为纯净的凝集素,此凝集素在温度升高至70℃时,凝血活性全部丧失;pH 4～9条件下,凝集素活性较为稳定,在pH 2以下及pH
10以上凝集素活性逐渐消失.盐度升高,凝集素活性降低;D-半乳糖是其良好的抑制剂;金属离子对凝集素活性的影响各不相同.
【总页数】7页(P34-40)
【作者】杨爱霞;李应彪;许程剑
【作者单位】石河子大学食品学院,新疆石河子832000;石河子大学食品学院,新疆
石河子832000;石河子大学食品学院,新疆石河子832000
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.3
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第11周 2011-5-3/4
植物凝集素的分离纯化及部分性质测定
分离纯化工艺策略：
主要是根据物质的结构和性质来选用各种纯化技术。
工艺次序的选择策略包括：
1.应选择不同机理的分离单元组成一套工艺；
2.应将含量多的杂质先分离出去；
3.尽早采用高效分离手段；
4.将最昂贵、最费时间的分离单元放在最后阶段。
也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等，这一阶段主要目的是尽量缩小样本体积，提高目的物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）；
5.随后是高分辩率的操作单元，如具有选择性的离子交换色谱和亲和色谱，而将凝胶过滤色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可以使分离效益大大提高。
色谱分离的次序。
一个合理组合的色谱次序能够克服某些方面的缺点，同时很少改变条件即可进行各步骤之间的过渡。
如：
◇在离子交换色谱之后进行疏水作用色谱，不必经过缓冲液的交换，因为多数蛋白质在高离子强度下与疏水介质结合能力较强。
◇凝胶过滤色谱放在最后一步又可以直接过渡到适当的缓冲体系中以利产品成形保存。
总之，蛋白质的纯化大至步骤为：样品经初步提取筛除部分杂质后，选择不同的层析手段相互配合进一步提纯。
第一部分离子交换层析
1. 原理：
离子交换层析（Ion-exchange chromatography，IEC）是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对各类化学物质或生物大分子因电荷差异而产生不同的结合力，从而将混合物中不同组分进行分离的层析技术。
Cation exchanger（阳离子交换）: 层析介质本身带负电荷,交换带正电荷物质
Anion exchanger （阴离子交换）:层析介质本身带正电荷,交换带负电荷物质–当缓冲环境 pH > pI, 蛋白质带负电
–当 pH < pI, 蛋白质带正电
–当pH = pI, 蛋白质不带电
–以阳离子交换树脂交换分离蛋白质的原理和方法为例: 将阳离子交换树脂（本身带负电荷）颗粒填充在层析管内，带正电荷的蛋白质(pH<pI)就被吸
引，但由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也
不同。
然后再用含阳离子（如Na+)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗
脱下来，增加Na+浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质
被分开。
2.实验室常用介质：
离子交换介质：适用于分离蛋白质等生物大分子与水的亲和力较大，载体孔径大
弱阳离子交换剂弱阴离子交换剂
CM-Cellulose DEAE-Cellulose
羧甲基-纤维素二乙基氨基乙基-纤维素
CM-Sephadex DEAE--Sephadex
羧甲基- 葡聚糖凝胶二乙基氨基乙基- 葡聚糖凝胶
CM-Sepharose DEAE-Sepharose
羧甲基- 琼脂糖凝胶二乙基氨基乙基- 琼脂糖凝胶
CM-Sepharose 和 DEAE-Sepharose由于性价比最高，因此作为实验室最常用的离子交换树脂
3.实验操作：
在这一部分中，本实验分别选用CM-Sepharose阳离子柱和 DEAE-Sepharose阴离子柱对学生的生物化学知识实践能力进行考查及训练。
待纯化样品已经过初步提纯，具体操作步骤如下：
（1）用缓冲液平衡，经过至少5-6个柱体积的缓冲液平衡，使整个层析体系（包括层析柱里的凝胶和各仪器之间连接的管道）达到目标pH和离子强度，为下一步上样做准备。
CM-Sepharose阳离子柱使用pH5.0,20mM的NaAc-HAc缓冲液；DEAE- Sepharose阴离子柱使用pH9.0,50mM的Tris-HCl缓冲液
（2）蛋白粗提液上样，缓冲液平衡后，使之前用缓冲液透析过（pH和离子强度和缓冲液相同）的蛋白样品通过层析柱；根据前面所述的层析介质结合原理，在这一过程中在pH9.0条件下带负电荷（蛋白PI<9.0）的蛋白结合在阴离子交换树脂上；在pH5.0条件下带正电荷（PI>5.0）的蛋白则结合在阳离子交换树脂上。
为满足上述条件的蛋白随缓冲液流出层析柱。
（3）洗脱，选择适当盐（NaCl）浓度的缓冲液上柱，由于Na+或H-可以蛋白竞争性的结合在阳离子或阴离子交换树脂上，从而使之前结合在树脂上的带电蛋白质脱离下来。
盐离子浓度越高这种效应就越明显，因此随盐离子浓度的变化收集不同时期的洗脱蛋白，从而达到对不同蛋白组分的分离效果。
（4）层析柱再生，收集完相应的蛋白溶液后，可对层析柱进行清洁再生，一般使用0.5M NaOH +1M NaCl的洗柱液再生柱子，操作方法如前，横流过3-4个柱体积，使残留于柱上的蛋白迅速脱离。
（5）高水清洗，经过洗柱液清洗的层析柱不能在高碱和高盐环境中长期保存，因此需用纯水清洗，使柱内环境恢复到pH电中性
（6）从上述第2步开始实时检测样品的凝血活性，以判断目的蛋白的分离效果和所在的组分。
从上样起就可以紫外检测仪检测蛋白样品的过柱情况。
4.注意：
（1）选择适宜的交换剂
阳离子交换剂：DEAE-、 Q-
阴离子交换剂：SP-、CM-
（2）选择短而粗柱子，交换剂量根据上样量确定
（3）Buffer的确定、平衡与流速
阳离子交换剂对应Anion Buffer
阴离子交换剂对应阳离子Cation Buffer
样品体系要与上样Buffer一致
（4）对样品的体积没有严格限制，但在体积较大时应考虑样品浓度是否会超出层析柱中填料的载量
（5）上样Buffer的离子强度通常不大于0.1M
（6）洗脱方式通常采用盐浓度连续梯度或阶段梯度洗脱
（7）柱子可再生重新利用
（8）通常用20% 乙醇+ 0.03%NaN3保护长期不用的柱子，避免柱内滋生细菌等微生物（9）层析过程中避免层析柱中进入气泡，使柱压增大并且影响样品分离效果。