基因转移与重组体筛选和鉴定
14 第十四讲(2) 重组子的筛选和鉴定
2 营养缺陷型检测法
如果目的基因产物能降解某些药物使菌 株呈现抗性标记，或者基因产物与某些药物 作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直 接筛选含目的基因的克隆子。
亮氨酸(leu)为leu菌所必须 。 在不含leu的基本培养基中，只有重组子 表达的leu才能被leu缺陷菌所利用而能生 长，形成菌落。 因此，能生长的菌落是阳性的重组子克 隆，没有重组子的leu缺陷菌在不含leu的 培养基中不能生长，不能形成菌落。
催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸， 产生萦光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选 含gus基因的转化子。 尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接 产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融 合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在 转化生物体中的定位分析。
Hale Waihona Puke 萤火虫萦光素酶基因（luc）
luc表达产物萤火虫萦光素酶（LUC）在 Mg2+的作用下，可以与萦光素和ATP底物发 生反应，形成与酶结合的腺苷酸萦光素酰 化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合 物转变成为处于激活状态的氧化萦光素， 可以用萦光测定仪快速灵敏地检测出产生 的萦光，是目前研究动植物转基因很好用 的一种报告基因。
3 依赖于重组子结构特征分析的筛选法
⑴ 快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的 重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴 定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝 胶电泳，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带 中，落后的带是重组DNA的带。 此方法只用于重组子的初步鉴定。
7 插入失活法
基本原理： 是将特定的DNA随机插入到重组DNA分子 中，获得一系列插入重组子，根据其突变 的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插 入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。
基因转移及方法
目的基因的用途
➢研究该基因的全貌与内涵：结构、功能、 调控
➢寻找异常基因异常点，探索疾病的机理与 治疗
➢研究生物种系进化与相关同源性 ➢基因工程重组表达 ➢改造某些基因 ➢基因治疗
原理
➢ 原核目的基因获得：直接分离 ➢ 真核目的基因获得：
➢ 从cDNA 中组织细胞
↓温和破碎细胞 DNA片段与载体的连接包装
↓限制性内切酶消化，噬菌体或粘粒 导入细胞
↓核酸杂交 筛选目的基因
人工合成目的基因片段
➢原理：DNA是由3’，5’-磷酸二酯键连接 ➢技术：DNA自动合成仪 ➢方法
➢ 化学合成法：固相 ➢ 酶促合成法：需模板 ➢ PCR
理
构建流程
组织细胞 ↓破碎细胞，除去DNA与蛋白质
提取总RNA ↓oligo（dT）纤维素亲合柱层析
制备mRNA ↓反转录 合成cDNA第一链 ↓置换法；外加引物法 合成cDNA第二链 ↓加接头，插入载体 重组D法
原理：2’，3’ddNTP与dNTP不同之处在于脱氧核糖 的3’ 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶 作用下通过其5’ 三磷酸基团掺入到DNA链中，但 不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，DNA链就不 可能继续延伸。这样，合成时在4种dNTP中加入 少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但十 分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核 苷酸链，长度取决于从用以起始DNA合成的引物 末端到出现链终止位置之间的距离。在4组独立的 酶反应中分别采用4种不同ddNTP，结果将产生4 组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、 T、C、G位置上。
DNA 模板 (为第一轮聚合链反应产物经电泳纯化后混合)
引 物 A 突变区
3' 半分子
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组DNA转化及筛选实验报告
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
重组体分子的选择与鉴定方法及鉴定
电泳后的图谱
挑三个菌落 鉴定，图显 示的是三个 菌落中的质 粒双酶切的 结果
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR方法筛选鉴定重组子
• 基本原理： • 在载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列多为 已知，通过与插入位点两侧已知序列互补的引物，从单 克隆中提取少量质粒DNA作为模板进行PCR扩增，琼脂 糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性标记法示意图
b类插入失活筛选
• 从原理上讲，当外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内 的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活 (insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组 DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子 （筛选）的主要方法。
常用的抗药性选择标记
抗药性 氨苄青霉素 （Amp） 溶解剂 虑过 除菌 是 贮存温度 贮存浓度 终浓度
水
-20℃
50mg/ml
50~100µ g/ml
氯霉素（Cm） 卡那霉素 （Ka或Kan）
四环素（Tet 或Tc） 链霉素（Sm 或Str）
乙醇
否
-20℃
34mg/ml
20~17交液中，在60℃下放置6h；把同 位素标记的DNA探针于100℃变性后加入杂交溶液中，然 后放入滤膜，60℃杂交16－24h。探针的用量一般为105 －106cpm/ml。用2×SSC洗脱3次，每次30min。 • 7 放射自显影：将洗好的滤膜用吸水纸吸干，夹于两层保 鲜膜中，在暗室内放进暗盒，放好X线片，并于X线片上 作好标记，置于－70℃冰箱暴光48－72h。 • 8 洗片：在暗室内取出X线片，进行显影和定影，分析杂 交结果。
RNA水平
蛋白质水平
免疫化学检测法（放射性抗体检测法、 免疫沉淀检测法） Westhern印迹杂交法
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
重组子筛选与鉴定
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
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T4 ligase
nick缺口
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口
虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接
1.在引物的5’端设计酶切位点
（1）设计原则
符合载体的多克隆位点； 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构
转化率：106-108/g DNA
（2）电转化法
原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时 性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束， 细胞恢复原状。
实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞
“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离 子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击 过程中细胞不被击穿而死亡。
（二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。
（三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。
（一）转化（transformation）
（1）热激法（heat shock） （2）电转化法（electronporation） （3）PEG介导的原生质体转化 （4）接合转化
GGCCCTAG-p5’
GGC肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其 5’端的磷酸，防止自我连接。
BamHI adapter 5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’
Blunt-ended DNA
P-
-OH
HO-
-P
CIP处理
5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
② 优点： 连上后就能用。
③ 缺点：
接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接
CCGG
5‘p-GATCCCGG-
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。
5’ P3’ HO-
-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-
5’ P3’ HO-
-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
（1）热激法 制备感受态细胞
① 目的 增加受体菌细胞膜的通透性
感受态细胞：处于能吸收 外源DNA分子的生理状 态的细胞
（1）热激法
制备感受态细胞
② CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理
1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细 胞膨胀成球形，处于感受态；
2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；
3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点
请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保 护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外 ，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列 。写出P1和P2的引物序列。
attL+attR，产物：入门克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
三、Gateway 载体构建系统
（2）构建表达克隆 LR反应：attL+attR
attB+attP，产物：表达克隆
入门克隆
改造过的各种表达载体
√
√
第二节 重组体导入受体细胞
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。
3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物； 4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： （p140）
10ng 载体DNA
100L 感受态细胞
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
10-100L转化液 涂Amp＋平板
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
带酶切位点的PCR产物
5’- GCAGAATTC PCR产物 GGATCCGCG -3’
3’- CGTCTTAAG PCR产物 CCTAGGCGC -5’
EcoR I位点
BamH I位点
EcoR I BamH I
5’- AATTC PCR产物 G -3’ 3’- G PCR产物 CCTAG -5’ 两头各有一个粘性末端！
第六章基因转移与重组体筛选和 鉴定
第六章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组 合的DNA称为重组DNA。
一、粘性末端的连接
DNA 连 接 酶 把 相 互 靠近的5’端磷酸与3’OH连到一起
单酶切、双酶切
二、平末端（blunt end）的连接
EcoR I linker： GGAATTCC CCTTAAGG
（1）多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接 （3）限制性内切酶消化 （4）目的片段与载体连接
（（3二））DN人A工接加头尾（形ad成ap“t粘er性）末连端接”法 ① adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）
P-P
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点： 能把任何片 段连接起来
④缺点： 操作繁琐； 外源片段难以回收； 同聚物尾巴影响外源 基因表达。
非酶切位点
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（2）衔接物（linker）连接
Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数 个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
三2.、与PCTR载产体物直的接连连接接 PCR产物
载体
dNTP A
Taq DNA聚合酶
A T
dTTP T
TA TA
三、Gateway 载体构建系统
噬菌体位点特异性重组系统； 高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。
入门克隆
改造过的各种表达载体
三、Gateway 载体构建系统
（1）创建入门克隆 BP反应：attB+attP