发酵生产纤维素酶研究进展

发酵生产纤维素酶研究进展摘要：纤维素酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等领域。

纤维素酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。

综述了纤维素酶的种类、高产纤维素酶菌种选育、发酵类型与优化等方面的研究进展，并展望了纤维素酶发酵生产的研究方向及前景。

关键词：发酵 纤维素酶 液体发酵 固体发酵 优化纤维素原料是地球上分布广泛且含量丰富的可再生资源，其生物合成和降解过程是自然界中碳循环的中心环节。

纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。

随着纤维素资源越来越受到人们的重视，其能量密度低，难降解等特性却阻碍了其开发利用的进程。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它的作用是将纤维素转化为糖类，能够降解细胞壁，使细胞内溶物释放。

作为重要的工业用酶，纤维素酶广泛应用于在能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等诸多领域。

1977年，Elwyn T. Reese 发现木霉属中的菌株具有分泌纤维素酶的能力，并将该具有分泌纤维素酶能力的菌株命名为里氏木霉（Trichoderma reese ），该发现为工业大规模发酵生产纤维素酶奠定了基础。

纤维素酶广泛存在广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，其中真菌纤维素酶种类最多，最易获得和用于大规模生产，且具有较稳定的pH 、温度适应性，因此是工业用纤维素酶的重要来源。

目前应用最广的纤维素酶生产菌是里氏木霉，也有曲霉属（Aspergillus ）、青霉属（Penicillium ）的菌种。

自20世纪50年代首次发现以来，便得到广泛的研究与应用。

近几年来，真菌纤维素酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面。

1 纤维素酶的种类纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系。

包括内切 1，4-葡聚糖酶（C 酶），外切葡聚糖酶 （C 酶）和β-葡萄糖苷酶（C 酶）。

X 1B 作用方式如下图：首先内切葡聚糖酶（C X酶）作用于纤维素酶内部的非晶体区，随机水解β-1，4糖苷键，产生大量含非还原性末端的短链纤维素。

外切葡聚糖酶（C1酶）作用于纤维素非还原性末端末端，水解1,4-β-糖苷键，产物是纤维二糖。

上述两种酶的催化产物纤维二糖和短链的纤维寡糖由β-葡萄糖苷酶作用，产物为单链葡萄糖。

β-葡萄糖苷酶也可以仅水解纤维寡糖为纤维二糖。

因此，葡萄糖苷酶虽然不直接水解纤维素，但通过其对于另外两种纤维素酶水解产物的作用，可以消除产物抑制效应，对于纤维素的水解也至关重要。

下面简要介绍纤维素酶的一些分类：1.1 真核生物纤维素酶和原核生物纤维素酶真核生物纤维素酶一般出现在昆虫、植物和一些真菌中，而原核生物纤维素酶一般在纤维素聚集的。

虽然一直有这样的观点，很多动物自身并不产纤维素酶，而是依靠它们体内共生的微生物来利用纤维素，这些微生物可以分泌纤维素酶，在严格厌氧的环境下分解纤维素产生糖类供给微生物以及动物。

而近期研究表明，一些昆虫包含有可编码纤维素酶的基因，可以自身合成纤维素酶。

植物中也发现有纤维素酶的基因，这些基因参与植物果实的成熟过程，而且与一般降解纤维素的纤维素酶不同，植物中的纤维素酶不含有与纤维素结合的CBD结构域。

1.2厌氧纤维素酶和好养纤维素酶大部分厌氧微生物在其细胞表面产生一种多酶复合物，好养微生物往往会将纤维素酶分泌到细胞外，两种作用方式的结果都是将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖，然后将其转运至细胞内进行新陈代谢。

两者间区别的一个可能的解释是厌氧细菌受能量的限制更多，所以需要更多的纤维素降解产物以维持代谢。

一些厌氧菌通过表面纤维素酶和纤维素紧密结合，将纤维素降解产物限制在一个细胞可及的空间里，以便于细胞摄取利用。

纤维素是植物细胞的主要成分。

纤维素酶一方面将纤维素水解成葡萄糖等有效成分，另一方面它通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物(蛋白质、脂肪、淀粉)的提取率，所以纤维素酶可应用于以植物为原料的一切工业中。

2 纤维素酶高产菌株的选育目前产纤维素酶菌种的选育方式主要有如下三种：2.1 优化培养条件首先从有纤维素分解能力的菌源中筛选分离产纤维素酶的菌种，筛选比现有菌株产酶能力高的菌株。

调整培养条件，达到菌株的最适生长及产物合成条件，在此条件下，菌株能最大程度发挥其产酶优势。

纤维素酶是诱导酶，需要一定的生长因子以及诱导剂存在才可能大量产酶，而且产物的抑制作用也尤为明显，发酵过程中应适量添加诱导剂且最大程度解除产物抑制。

孙凯、盂宁、冯琳等利用CMC平板、透明圈法和滤纸崩解法从青藏高原牛粪中分离到可以产生胞外纤维素酶的黄杆菌属菌株Tibet-YD5000-3，并且测得该菌株产生的纤维素酶活在最适反应条件(温度30℃，pH=8.0)下为12U/mL ，酶活力很可观。

2.2 诱变育种自然界中筛选的天然产纤维素菌株往往具有酶活不高、产量不稳定等弊端，若对其进行人工诱变处理，从诱变菌种中就有可能筛选出大幅度改良其生物学性状、高产纤维素酶的菌株。

现今有很多研究者已经利用此方法来获取高产纤维素酶菌株。

具体诱变途径则是通过各种物理的和化学的方法，如X射线，紫外线、亚硝酸、硫酸二乙酯等。

冯培勇等利用NTG、DES、氯化锂依次对黑曲霉菌株进行化学诱变，得到了一株相对酶活力为出发菌株150．2% 的性状稳定的高产酶量菌株。

方尚玲等则以木霉为出发菌，利用紫外诱变育种获得了一株性能稳定的纤维素酶生产菌株，该菌株CMC酶活为1332．90U/g干曲，是诱变前菌株的2.19倍。

2.3 构建纤维素酶基因工程菌随着DNA体外重组技术的发展，国内外已有研究者将DNA重组应用于纤维素酶生产菌的改造或创造中。

与诱变育种相比，DNA重组进行菌种选育具有良好的定向性。

许多真菌的纤维素酶产量高但生长慢，而细菌繁殖快而纤维素酶产量低，因此，可以将真菌的纤维素酶基因导人到细菌DNA中使之表达，以得到高的纤维素酶产量。

具体做法是将纤维素酶基因通过基因分离、重组、载入生长繁殖快的宿主细胞，构建含有纤维素酶基因全组份的高效产纤维素酶的工程菌，那么对于纤维素的降解就会大大提高，从而实现纤维素酶的工业化生产。

现在已经有很多研究者将纤维素酶基因重组至大肠杆菌或者毕赤酵母中得到了高效表达。

丁新丽等将木霉的内切葡聚糖酶基因和外切葡聚糖酶基因成功地转入酿酒酵母H158中，构建了可以同时分泌两种酶的工程菌。

3 纤维素酶的发酵生产尽管产纤维素酶的微生物分布广泛，但寻找适于工业生产的纤维素酶生产菌却比较困难。

目前认为优良产酶菌株的标准应是发酵周期短、营养基质低廉、菌株一份力、胞外酶、非致病菌、不长生毒素、遗传性状稳定及对噬菌体不敏感等。

纤维素酶的产量不仅可以通过菌种改良（包括传统育种和基因工程菌的构建），而且还可以通过对发酵条件的优化来提高。

同样的菌种，不同的发酵条件可能会对产酶量产生巨大的差异。

因此，发酵条件的优化和发酵策略的调控对纤维素酶的工业化生产具有重要的意义。

3.1纤维素酶的发酵培养基适当而丰富的营养物是菌体生长和酶大量产生的重要前提。

纤维素酶生产的发酵培养基包括无机盐类、复合营养物、表面活性剂和诱导物。

无机盐类指的是典型的发酵用盐，包括磷酸钾、硝酸铵、硫酸铵、氯化钙和硫酸镁。

复合营养物一般包括5~25g·L-1的玉米浆，有时也会添加适量酵母膏，为菌体生长提供充足的碳氮源。

不同菌种需要的碳源不同，对于康宁木霉来说，稻草是最佳碳源；对于黑曲霉来说，麸皮和玉米秸秆粉混合料是最佳碳源。

氮源主要用于氨基酸的合成，王石玉等研究了不同氮源对拟康氏木霉固态发酵产纤维素酶系的影响，结果表明，以(NH4) 2SO4为氮源，添加量为2.5%时，产酶量最佳。

表面活性剂的作用是消泡，表面活性剂包括一些商业用消泡剂或者食用油。

对于不同的菌种使用的诱导物是不同的，但是基本上都包含一些廉价的可溶或不可溶的糖类，有少数使用乳清作为诱导物，其中含有乳糖等作为其有效成分。

黄艳等研究了不同碳源对康氏木霉产纤维素酶的诱导作用，他们通过对产纤维素酶基因的RT —PCR扩增发现：利用微晶纤维素诱导产生的纤维素酶活最高，而且酶系最宽，同时也证明了纤维素酶合成的调节发生于预翻译水平。

3.2 培养基及发酵条件优化优良的生物产品从实验室水平到工业化生产首先要解决的问题是生物过程的优化。

工业发酵过程中，设计一个发酵培养基是至关重要的。

培养基的组成显著影响产品的浓度、产量和生产效率；商业化过程中，培养基的成本能显著影响总生产成本。

优化培养基设计大量的实验研究，是一个好时、耗力、耗费的过程。

影响发酵过程的因素很多，主要包括培养基的组成、接种量、种龄、培养温度、转速、装液量、发酵周期、溶氧、pH值和通气条件等，这些因素往往又不是独立影响发酵过程，经常是交互作用。

除了传统的单因子法、正交设计法在生物过程优化中得到广泛应用之外，响应面法、均匀设计法、人工神经网络、模糊逻辑控制、专家系统、遗传算法和化学计量分析等一批更有效的新方法也在发酵培养基的优化及过程程控制中逐步得到推广应用，并日益显示出优越性，其中响应面法应用最广。

刘洋等应用Plackett-Burman设计法对影响纤维素酶液体发酵的培养基组分进行筛选，确定了影响纤维素酶活力的关键因素为纤维素粉、豆饼粉和(NH4)2SO4。

采用响应面法以及二次方程回归求解确定纤维素粉、豆饼粉和(NH4)2SO4的浓度分别为18.18 g/L、10.58 g/L和2.03 g/L时，得到纤维素酶的最优FPA活力为2.19 IU/mL。

潘春梅等借助于miniTAB软件，采用Plackett-Burman试验设计法及响应面法分析，对纤维素酶高产菌康氏木霉Trichoderma koningii P12进行了发酵工艺条件的优化研究，得到其最优发酵条件：当装液量56.5mL，稻草粉浓度37.4 g/L和麦麸浓度11.3 g/L时，纤维素酶产量达到63．32 U/mL，纤维素酶活提高了96.7%。

3.3 纤维素酶发酵的培养方式与发酵条件调控纤维素酶的生产有固态发酵和液体发酵2种：固体发酵劳动强度大，生产率低，易污染；液体发酵具有不易污染，培养条件易控制，生产率高等特点，因而适合大规模工业化生产。

3.3.1 液体深层发酵液体深层培养易于控制，不易染杂菌，生产效率高，但分离纯化成本高，且会产生大量的污水。

液体深层培养通常采用分批(batch)、补料分批(fed-batch)和连续(continuance)发酵。

分批发酵(Batch Culture)中，细胞生长速率符合Monod方程，对于可溶性底物，在分批发酵的大部分阶段，S远大于K S，所以细胞的比生长速率μ接近最大比生长速率μmax，而此时菌体几乎不产纤维素酶，故纤维素酶的生产很少使用分批发酵。