大肠杆菌操纵元 otsBA 的定向进化研究
酶分子定向进化的最新研究进展及应用
用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化 ,已成 为生产精细化学品 、手性药物 、食品添加剂等的重要工 具 ,得到了广泛应用 。随着酶催化应用范围的不断扩 大和研究的逐步深入 ,研究者发现 ,酶催化的精确性和 有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的 要求 ,而且天然酶的稳定性差 、活性低使催化效率很 低 ,还缺乏有商业价值的催化功能 。因此对天然酶分 子的改造显得十分重要 。天然酶在自然条件下已经进
经用于以人工合成多聚酶为基础的传统实验设计 [9 ] 。 PCR 重新组装 ,这时在随机加尾处可产生 3 种类型的
这种方法应用十分广泛 ,目前仍有许多酶及其他蛋白 序列变化 ,即随机片段插入和碱基替换 、碱基替换 、随
分子的定向进化采用这种方法 ,这主要是因为它对父 机片段删除和碱基替换 。最后加入两端引物扩增出全
ast, CLKRY) 等 。以上方法的原理和操作已有许多文 献报道 。
2006 年 , Ryota 等为基因片段重组这一Andom Insertional - deletionalStrand Exchange mutagenesis, RA ISE) 。该方法主要由三个步 骤组成 ,即基因破碎 ; 添加随机短序列 ; 重新组装 。首 先用常规 PCR 扩增待突变基因 ,接着用 DNaseⅠ消化 , 获得一系列大小在 100 ～300bp 之间的 DNA 碎片 ,然 后在末端脱氧转移酶 ( TdT) 的作用下 , DNA 碎片的 3’ 末端被随意加上一个至几个碱基 ,随机碱基的个数可 由 dNTP 浓度和碎片浓度的比例来调节 ,一般 dNTP 的 浓度调整到碎片浓度的 10 倍 ,这样可以在每个碎片的
2 酶分子定向进化的原理
酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本 酶 (天然的或者人为获得的 )出发 ,经过基因的突变和 重组 ,构建一个人工突变酶库 ,通过筛选最终获得预先 期望的具有某些特性的进化酶 。在待进化酶基因的 PCR 扩增反应中 。利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′ 校对功能的性质 ,配合适当条件 。以很低的比率向目 的基因中随机引入突变 ,构建突变库 ,凭借定向的选择 方法选出所需性质的优化酶 (或蛋白质 ) ,从而排除其 他突变体 。定向进化的基本规则是 ,“获取你所筛选的 突变体 ”[ 4 ] 。简言之 ,定向进化 = 随机突变 + 选择 。 与自然进化不同 , 前者是人为引发的 ,后者相当于环 境作用于突变后的分子群体 ,起着选择某一方向的进 化而排除其他方向突变的作用 。整个进化过程完全是 在人为控制下进行的 ,是酶分子朝向人们期望的特定 目标进化 。
大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制
大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制1. 引言大肠杆菌是一种重要的微生物，在生物技术和基因工程领域具有广泛的应用。
其组氨酸操纵子调控机制作为基因调控的重要范例，对于理解细菌的基因表达和调控机制具有重要意义。
本文将从深度和广度的角度对大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制进行全面评估，并提供有价值的文章。
2. 组氨酸操纵子的概念和作用组氨酸操纵子是一种典型的转录调控元件，能够在转录水平上精确调控与组氨酸合成有关的基因的表达。
在大肠杆菌中，组氨酸操纵子由一个调控基因trpR和一个操纵子构成，能够形成一个复杂的调控网络，对于细菌的存活和适应环境具有重要作用。
3. 组氨酸操纵子的结构和功能组氨酸操纵子在结构上具有多个调控位点，其与核酸酶切割位点等结构域相互作用，形成一个精密的调控网络。
组氨酸操纵子能够通过与具有特定结构的调控蛋白相结合，实现对与组氨酸合成相关基因的转录调控，使得细菌在不同环境条件下能够做出快速的反应。
4. 组氨酸操纵子的调控机制组氨酸操纵子的调控机制是一个复杂的过程，涉及到调控基因trpR和操纵子之间的相互作用，同时还受到环境条件和细胞内代谢状态的影响。
在不同的条件下，组氨酸操纵子能够实现不同基因的表达，从而实现细菌的生存与繁衍。
5. 个人观点和理解作为文章写手，我对大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制有着深刻的理解。
我认为这一调控机制不仅是基因调控的重要范例，同时也为我们理解细菌在复杂环境下的生存机制提供了重要的参考。
通过对组氨酸操纵子调控机制的了解，我们也能够更好地应用于生物技术和基因工程领域，为人类的生活和健康带来更多的益处。
总结大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制作为基因调控的重要范例，对于我们理解细菌的基因表达和调控机制具有重要意义。
其结构和功能、调控机制以及在生物技术和基因工程领域的应用，都为我们提供了丰富的知识和启发。
希望通过本文的介绍，读者能够更加深入地了解大肠杆菌组氨酸操纵子调控机制，并在相关领域有所收获。
利用家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ
ｐ ａ Ｂ ｃ Ｔ 载体， Ｆｓ ａＨ ｂ ｔ 大肠杆菌 Ｄ ５ ，Ｈ ０ ａＴ Ｈ ａ Ｄ １Ｂ ｃ ， Ｍ Ｂ Ｎ昆虫细胞 ， ｍ 由本实验室保存。 ａ Ｈ Ｉ， ｉ １ Ｂｍ Ｈｎ １ ｄ１
等限制性内切酶，４Ｄ Ａ连接酶 ， Ｔ Ｎ 质粒柱抽试剂盒 ，
费建明 １ 吴 岩 ，占鹏飞 １施 国方 １ 王文兵 ２ ， ， ，
（． １浙江省湖州市农业科学研究院 ， 浙江 湖州 ３ ３ ０ ；２ 江苏大学生命科学研究院， １０ ０ ． 江苏 镇江 ２２ １ ） １０ ３
摘
要 ： 厂天冬酰胺酶（－ ｓａａｉａｅＩ Ａ Ｐ 可以通过 降解 Ｌ 天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞 中蛋白质的正常合成 ， Ｉ Ｌ ａｐ ｒｇ ｓ ， ＿ Ｓ ） ｎ ， ＿ 导
致肿瘤细胞的死亡。 通过杆状病毒的 Ｂ ｃｔ －ａ 方法 ， ａ－ｏ Ｂ ｃ － 将大肠杆菌的 ａｐ 因在家蚕杆状病毒 中表达 ， ｓ基 其活性较原核表 达有 明显提高 ， 达到 ２ ０ ／ 。为利用家蚕生物反应器生产该蛋 白提供 了依据 。 ８０ ｍｇ 关键词： 家蚕 ； 多角体 ； － Ｌ 天冬酰胺酶； － 大肠杆菌
（． ｅｉ ｈ ｒ ＲｅｅｒｈＩｓｉ ｔ， ｚｏ ｃ ｄ ｍ ｇｉ ｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ， ｚｏ １ ０ ０ Ｃ ｉａ １ Ｓ ｒ ｕ ｕｅ ｓａｃ ｔｕｅ Ｈｕｈ ｕＡ ａ ｅ ｙｏ ｒ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｃｓ Ｈｕｈ ｕ３ ３ ０ ， ｈｎ ； ｃ ｎ ｔ ｆＡ ｃ ｕ ｅ
ｗｉｈ ｔ ｅ ｂａ ｕ ｖ ｒ ｃｔ ｃｓ ｓｅ ｔ ｈ ｃ ｌ ｉｕｓＢａ ｏ Ｂａ ｙ ｔ ｍ
ＦＥＩＪａ － ｉ ｇ． Ｕ ｎ， ｉｎ ｍ ｎ Ｗ Ｙａ ２ＺＨ ＡＮ ｅ ｇ ｆＰ Ｓ ｏ ｆ ｎ １Ｗ ＡＮＧ ｅ － ｉｇ Ｐ ｎ － ｅ ， ＨＩＧｕ － ａ ｇ， Ｗ ｎ ｂｎ
木聚糖酶基因的体外定向进化
木聚糖酶基因的体外定向进化杜文;王谦;王佳堃;刘建新【摘要】木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用.宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势.体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,利用基因的突变和重组,从体外改造酶基因,产生基因多样性,并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶.宏基因组技术与体外定向进化技术结合必将加速木聚糖酶的开发和产业化应用,推动半纤维类生物能源的利用.为此,本文就木聚糖酶基因的来源、宏基因组学在木聚糖酶基因开发中的应用、体外定向进化进行了系统的综述.【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2013(025)010【总页数】10页(P2202-2211)【关键词】木聚糖酶基因;宏基因组学;体外定向进化【作者】杜文;王谦;王佳堃;刘建新【作者单位】浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058;浙江大学奶业科学研究所,动物分子营养学教育部重点实验室,杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S852.2木聚糖是D-木糖通过β-1，4-木糖苷键连接而成的一种多聚五碳糖，是植物细胞壁中常见的半纤维素多糖，占植物碳水化合物总量的1/3，含量仅次于纤维素，是自然界中第2丰富的可利用资源［1］。
在饲料工业中，由于单胃动物缺少降解半纤维素的酶，因此木聚糖对单胃动物几乎没有营养作用，而且没有消化的纤维物质会增加食物的黏性，干扰消化酶的作用及营养的吸收［2］;反刍动物由于瘤胃微生物的存在，对木聚糖具有一定的降解能力［3］，但是，实际生产中仍需要补充外源酶制剂，进一步提高其对粗饲料的消化率［4-5］。
木聚糖酶是能专一水解木聚糖为主体的低聚木糖和D-木糖的一类糖苷水解酶的总称［6］，主要包括:β -D-1，4- 内切木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanxylanohydrolase，E.C.3.2.1.8)、β -木糖苷酶(β-xylosidase，E.C.3.2.1.37)和β -1，4- 外切木聚糖酶(E.C.3.2.1.7)。
大肠杆菌的乳糖操纵子
为了确定这几种基因的关系， Jacob和Monod使用含有lacI、 lacZ、 lacY和lacA的F’-质粒创建了部分二倍体的大肠杆菌，并进 行了一系列互补实验，其中下图的两种突变对于操纵子模型的最终 建立起了负调控 乳糖操纵子的调控模型主要内容：
人们发现两类不能利用其他糖类的大肠杆菌突变体： 一类突变体的腺苷酸环化酶基因有缺陷，因此在任何情况下都不能合成cAMP；另一种突变体缺乏一
种能够与cAMP结合的蛋白，即cAMP受体蛋白CRP或CAP，这种突变体在加入外源的cAMP后也不 能利用乳糖。这说明cAMP是通过CAP起作用的。
01 乳糖操纵子的正调控
一旦高浓度的乳糖进入细胞，在细胞内残留的β-半乳糖苷酶
二、乳糖操纵子的负调控 催 化 下 ， 一 部 分 乳 糖 被 异 构 化 ， 变 成 别 乳 糖 。 而 别 乳 糖 作 为 别构效应物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的构象，使其不 能再与操纵基因结合，于是操纵子被打开；
RNA聚合酶与启动子结合，启动三个结构基因的转录，产生 lacZ、lacY和lacA的共转录物，但翻译却是独立地进行， 从而产生三种不同的酶；
02
通过科学家的不懈努力我们终于知道： CAP由2个相同的亚基组成，每1个亚基含有209个氨基酸残基，有2个结构域，1个在
N端，含有结合cAMP位点，另一个在C端，含有螺旋-转角-螺旋，负责与DNA结合。 CAP必须与cAMP结合以后才有活性，一般只要结合一个cAMP就完全被激活。当 cAMP与CAP结合以后，CAP的构象发生变化，致使其C端的螺旋-转角-螺旋采取合适 的取向，从而能够识别DNA上的结合位点。
大肠杆菌的乳糖操纵子是第一个被阐明的操纵子。早在20世纪50年代， Jacob和Monod就开始研究大肠杆菌的乳糖代谢，集中研究乳糖对乳 糖代谢酶的诱导（introduction）现象：如果供大肠杆菌生在的培养基 中没有乳糖，那么细胞内参与乳糖分解代谢的三种酶，即β-半乳糖苷酶 （β-galactosidase）、乳糖透过酶（lactosepermease）和巯基半乳 糖苷转乙酰酶很少，如每个细胞的β-半乳糖苷酶的平均含量只有0.5~5 个。可是一旦在培养基中加入乳糖或某些乳糖的类似物，则在几分钟内， 每个细胞中的β-半乳糖苷酶分子数量骤增，可高达5000个，有时甚至 可占细菌可溶性蛋白的5%~10%。与此同时，其他两种酶的分子数也 迅速提高。由此可见，新合成的β-半乳糖苷酶、透过酶和乙酰化酶由底 物乳糖或其类似物直接诱导产生，乳糖及其相关类似物被称为诱导物。
大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究
大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究徐卉芳1,2) 张先恩2)3 张治平2) 张用梅2)(1)中国科学院微生物研究所,北京100080;2)中国科学院武汉病毒研究所,武汉430071)A.E.G.CASS(Biochemist ry Depart ment,I m perial College of Science,Technology and Medici ne,South Kensi ngton,L ondon S W72A Y,U K)摘要 大肠杆菌碱性磷酸酶(E.coli alkaline phosphatase,EAP,EC3111311)是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶.采用易错聚合酶链反应(error prone PCR)的方法,在原有高活力突变株的基础上,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化,经两轮error prone PCR,获得催化活力较亲本D101S突变株提高3倍、较野生型酶提高35倍的进化酶42186,并对该酶的催化动力学特征进行了分析.进化酶基因的DNA测序表明42186含两个有义氨基酸置换:K167R和S374C,二者既不位于底物结合位点,也不位于酶的金属离子结合位点.关键词 定向进化,易错聚合酶链反应,大肠杆菌碱性磷酸酶,催化活力学科分类号 Q58,Q81 近年来,以连续易错聚合酶链反应(error prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling)为基础的体外分子定向进化策略,为蛋白质工程的发展提供了一个颇具前景的新方法[1～3].该法无需事先了解蛋白质的三维结构信息,而是在实验室模拟自然进化的过程(突变、重组和筛选),配合适当的选择压,使基因发生适应性突变,在短时间内完成目的特性或功能的进化.迄今为止,研究者们已用该法进化了各种各样的酶特征,找到并发现了许多合理设计(rational design)所不能预测到的突变[2～5].大肠杆菌碱性磷酸酶(EAP)是一个非特异性磷酸单酯酶,催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类化合物.当有磷酸受体(如: Tris或二乙醇胺)存在时,它还可以催化磷酸基团的转移反应[6,7].EAP是一个同源二聚体金属酶,每个单体由449个氨基酸、两个Zn2+和一个Mg2+组成.分别位于两个单体上的两个活性中心相距3nm,可以看作是由Asp1012Ser1022Ala103催化三联体、3个金属离子和它们的配体、一些水分子以及Arg166组成[6].作为所有碱性磷酸酶的模型, EAP是研究最透彻的碱性磷酸酶,大量点突变阐明了许多氨基酸的结构功能[7].与哺乳动物碱性磷酸酶相比,EAP具有很高的热稳定性,但相对活力较低.以往定点突变研究表明:D101S是活性最高的突变株之一[8～10],我们以前的研究结果也证明,在最适反应条件下该突变株的活力是野生型的9～10倍[10].经对不同来源、不同催化活力的AP氨基酸序列比较表明[6]:它们的活性中心序列是高度保守的,特别是Asp1012Ser1022Ala103催化三联体.因此,探讨非活性三联体区域的氨基酸突变是否会提高EAP催化活力是令人感兴趣的.在本研究中,我们以D101S为亲本,试图采用体外分子定向进化的策略来提高其催化活力.通过两轮error prone PCR随机突变,结合双重筛选方法,成功地获得了活力提高的变异株.对它们催化动力学的分析,为进一步了解EAP的反应机理提供了新的线索.1 材料与方法111 菌株、质粒及主要试剂大肠杆菌SM547(Δ(phoA2proC),phoR,tsx:: T n5,Δlac,gal K,leu,Str r)和质粒p EK48(含野生型EAP基因phoA)系K antrowitz教授惠赠,质粒pEK48/D101S(含D101S突变酶基因)系本实验室构建[10].限制性内切酶、T aq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自T akara公司;生色底物52溴242氯2 32吲哚磷酸盐(BCIP)、对硝基酚磷酸二钠盐(pNPP)和荧光底物42甲基伞形酮磷酸(42 methylumbelliferyl phosphate,42MUP)购自Sigma公司.Q2Sepharose TM Fast Flow阴离子交换柱购自 3通讯联系人. T el:027*********,E2mail:x.zhang@ 收稿日期:2002206207,接受日期:2002206228Pharmacia公司.PCR引物由上海生工公司合成. DNA测序由上海博亚生物工程公司完成.112 方法11211 Error pronephoA基因片段:选取质粒p EK48/D101S的phoA基因中700～1830bp片段,进行error prone PCR介导的定向进化实验,该1113kb片段编码EAP第119位氨基酸至C端的序列,远离活性中心Asp1012Ser1022 Ala103的编码区.在限制性酶切位点Bss HⅡ和Bst EⅡ两端设计引物,上游引物:5′2AACCTA2 TAACGGCGCGCTGG23′,下游引物:5′2CA GG A2 GGTCA TACGCTGTTG23′.Error prone PCR反应体系:50μl体系中含1×T aq DNA聚合酶缓冲液、012mmol/L dATP和dGTP、1mmol/L dCTP和dTTP、3～7mmol/L Mg2+、0105～0115mmol/L Mn2+、上下游引物各0175μl、质粒DNA模板012μl、Taq DNA聚合酶013μl.其中Mg2+和Mn2+的浓度被调整,可以得到不同突变频率的文库,选取底物平板上活性突变子占文库70%左右的突变频率.Error prone PCR循环条件:94℃1min,56℃1min,72℃115min,25个循环; 72℃7min.11212 突变文库的构建和筛选:上述error prone PCR产物纯化后,经Bss HⅡ2Bst EⅡ双酶切,与同样双酶切的质粒载体p EK48/D101S相连接,转化大肠杆菌SM547细胞.文库成员在LB+Amp+ BCIP平板上生长16～18h后,能够表达活性EAP 的突变子将呈现蓝色.选择蓝色克隆,接种到每孔含200μl LB+Amp液体培养基的96孔板中,每孔对应于每一特定转化子.37℃,摇床培养约20h 后,每孔各取15μl等份,加入另一含100μl 110mol/L(p H1010)Tris2HCl缓冲液的新鲜96孔板的对应孔中,在自动微量酶标分析仪(TECAN Sunrise,Austria)上测595nm处吸光度,作为细胞密度值.然后每孔加入100μl5～10mmol/L的底物pNPP溶液,检测405nm处产物pNP的吸光度值,反应一般进行3～5min,反应过程中记录5个数据点,每隔40s记录一次.对每个突变子,比较它们的A405/A595比率,找出那些具有最高活力/细胞密度比值的克隆子,对这些克隆子再进行至少3次类似的筛选实验,最后得出的潜在阳性克隆最终在蛋白质水平上进行比较验证.11213 EAP的提取和纯化:酶的提取纯化参照文献[11].蛋白质浓度测定用Bio2Rad方法[12],以牛血清白蛋白做标准曲线.11214 酶活力及酶催化pNPP水解的动力学参数: EAP催化活力的测定参照文献[13].以pNPP做底物,检测产物pNP在405nm处的吸光度.在0105mol/L Tris2HCl缓冲液中测定EAP的水解酶活力,在110mol/L Tris2HCl缓冲液中测水解和转移酶活力的总和.酶活力单位(1U)定义为25℃下,每分钟催化产生1μmol pNP所需的酶量. 11215 酶对荧光底物的活性:EAP对荧光底物42 MUP的催化反应在自动微量荧光分析仪S pectraFluor (TECAN,Austria)上检测.反应体系:110mol/L pH10105的T ris2HCl缓冲液100μl含1mmol/L底物,加入2～4μl待测酶液后,震动混匀,于激发波长360nm,发射波长465nm条件下检测产物42MU 的荧光发射强度.催化活力以每微克酶蛋白每秒钟水解产生的42MU相对荧光单位数(RFU)表示. 11216 野生型和突变型EAP的热稳定性:参照文献[14]方法.11217 溶液p H对酶活力的影响:25℃条件下,分别在不同pH的110mol/L T ris2HCl(含2mmol/L MgCl2)缓冲液和不同pH的0105mol/L T ris2HCl (含2mmol/L MgCl2)缓冲液中测定酶催化pNPP水解的活力.11218 金属离子对酶活力的影响:待测酶液对p H714,0101mol/L Tris2HCl缓冲液透析,除去酶溶液中游离金属离子.然后,在测活体系中加入不同浓度的金属离子溶液,分析它们对酶活力的效应.2 结果与分析211 E rror prone PCR条件的确定调整error prone PCR反应体系中Mg2+和Mn2+的浓度,可以得到不同突变频率的片段多样性文库,我们选择Mg2+浓度为3～7mmol/L、Mn2+浓度为0105～0115mmol/L进行实验,检测转化平板上能表达活性EAP的克隆子(蓝色克隆)所占比例,选取该比率在70%左右的error prone PCR条件作为接下来进化实验的建库条件,因为这个活性克隆比例大致相当于每个基因2～3个碱基替换(相应于1～2个氨基酸置换)的突变频率[15].本研究所得适宜随机突变条件为:Mg2+浓度为7mmol/L,Mn2+浓度为0105mmol/L.Error prone PCR的电泳结果如图1所示.Fig11 E rror prone PCR to amplify the1113kb phoAfragment of plasmid pEK48/D101S1:standard PCR control;2:error prone PCR with7mmol/L Mg2+and011mmol/L Mn2+;3:error prone PCR with7mmol/L Mg2+and0105mmol/L Mn2+;4:error prone PCR with 5mmol/L Mg2+and0115mmol/L Mn2+;5:DL5000marker.212 E rror prone PCR突变文库的构建及筛选在优化的error prone PCR条件下,以D101S 为亲本产生第一代随机突变文库.对其中约3000个预选择的活性转化子进行活力/细胞密度筛选实验.其中8个被作为潜在的高活力突变株选出,重复筛选验证后,得到活力最高的22834突变子,其A405/A595的平均约是亲本D101S的2倍.这个细胞被用来作为下一轮error prone PCR进化的亲本.在第二代随机突变文库中,约4500个预选择的活性转化子被筛选,其中有78个高A405/A595比率的克隆子被获得,对这些克隆子进行重复筛选,获得了4个稳定的高活性克隆子,其中,42186活力最高,A405/A595的平均是亲本D101S的415倍. 213 高活力进化酶基因的测序为了确定进化酶基因中的突变情况,我们对筛选到的两个高活力酶变异株进行了DNA测序.结果表明:22834中新增突变为t1468a,对应于氨基酸置换S374C;42186中新增突变为:t1468a, a848g和g1170t,所对应的氨基酸置换为S374C和K167R(g1170t为无义突变).可见,两个进化酶中的氨基酸置换都是由单碱基替代造成的.214 野生型和突变型EAP的提取和纯化EAP纯化采用Q2Sepharose Fast Flow阴离子交换层析.经调整洗脱盐梯度为野生型酶0～011mol/L NaCl、突变酶为0～0115mol/L NaCl和洗脱液流速为112ml/min,各酶均得到理想的纯化效果(图2).Fig12 SDS2PAGE analysis of the purif ied enzymes1:low molecular mass protein marker;2:wild2type enzyme;3:D101S enzyme;4:22834enzyme;5:42186enzyme.215 酶催化pNPP水解的动力学特征表1总结了野生型EAP和突变酶的催化动力学参数.在以pNPP为底物且有磷酸受体存在的条件下(110mol/L Tris2HCl),42186进化酶的比活是130211U/mg,比亲本D101S提高了3倍,比野生型EAP提高了约35倍.从表1还可以看出:与亲本D101S相比,进化酶变异株均有一个低的K m值,表明它们具有较高的底物亲和力.这个结果是可以预料的,因为突变文库的筛选被设计在较低的底物浓度(5～10mmol/L)条件下进行,因此赋予EAP一个通过提高底物亲和力来提高其催化活性的机会.事实上,在D101S突变酶中,尽管它的k cat值提高了11倍,但由于其K m值显著升高,该酶的催化效率(或k cat/K m比率)与野生型相比实际上降低了313倍.而进化酶42186的催化效率则比亲本D101S提高了412倍,也是野生型酶的113倍.216 进化酶对荧光底物的活性为了检查EAP变异株对其他磷酸单酯底物的活性,我们选择了较为常用的荧光底物42MU P作为检测对象.结果表明,所有EAP变异株对该底物都有较强的催化活性(表1).进化酶对42MU P 的活力也显著高于野生型和D101S亲本酶.其中42186的活力分别是野生型和D101S的4116和214倍.T able 1 Kinetic parameters of the wild 2type and mutant enzymesEnzyme Specific activitypNPP/U ・mg -142MU P/RFU ×103・μg -1K m /μmol ・L-1k cat /s -1k cat /K m/s -1・μmol -1・Lwild 2type 3715±2114196615±8162914±11601442D101S 41518±76198612238319±1021632514±6012011362283453914±461314412210314±511342211±36120120142186130211±361320318176917±21016101818±281401576 All reactions are performed in p H 10105,110mol/L Tris 2HCl buffer at 25℃.RFU :relative fluorescence unit.217 野生型和突变酶的热稳定性各待测酶液稀释至10mg/L ,分别于25℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、98℃下温育25min ,然后取样置于冰上25min ,取一定量酶测酶活性(图3).从图3中可以得出野生型酶的T 50值为95℃,突变酶D101S 、22834和42186的T 50值分别为82℃、78℃和78℃.与亲本D101S 相比,进化酶变异株22834和42186的热稳定性稍有降低,但它们仍然具有比通常嗜中温微生物所要求的热稳定性高得多.另外,22834与42186的T 50值差异不明显,鉴于22834中唯一多出的氨基酸置换是S374C ,所以推测此氨基酸置换是导致进化酶热稳定性有所下降的主要原因.Fig 13 Thermostabilities of wild 2type EAP and mutantenzymes●———●:wild 2type ;■———■:D101S ;▲———▲:22834;○———○:42186.218 pH 对酶活力的影响为了检测溶液p H 对酶活力的影响,我们分别测定了不同p H 条件下,酶在0105mol/L Tris 2HCl 缓冲液和110mol/L Tris 2HCl 缓冲液中的活力变化情况.结果见图4.从图4a 中可以看出:所有突变酶均在p H 1010附近表现最大水解酶活力,而野生型酶在p H 815附近有最大活力.进化酶中,42186的p H 2活力曲线形状与D101S 的相似,即在所有测试p H 范围内,其水解酶活力都明显高于亲本D101S 的对应值;而22834进化酶的p H 2活力曲线在p H 710～815范围内时上升缓慢,当p H >815后,活力线呈陡峭上升.图4b 代表了各EAP 水解酶和转移酶活力的总和随p H 变化的趋势.由图4b 可知,野生型酶最大活力表现仍在p H 815附近.而42186酶在p H <815时,活力提高的幅度较小,p H >815后,活力提高幅度明显上升,p H 10左右达最大值.在所有两种情况下,第一代变异株22834在p H <910时,活力都与D101S 相差无几,随着p H 的升高其活力提高的程度才明显表现出来.分析以上结果,与我们设定的筛选条件是在Fig 14 The effect of pH on the activity of wild 2type EAP andmutant enzymes(a )the activity in 0105mol/L Tris 2HCl buffer ;(b )the activity in 110mol/L Tris 2HCl buffer .●———●:wild 2type ;■———■:D101S ;▲———▲:22834;○———○:42186.p H1010条件下进行有关.同时也说明,定向进化能够产生确切匹配于实验所设定的选择压改进性突变.219 金属离子对酶活力的影响由于EAP为含Zn2+和Mg2+的金属酶,我们也检测了添加这两种离子对野生型和突变酶活力的影响.结果表明:Zn2+对酶有抑制效应,当Zn2+浓度为0～015mmol/L时,对野生型EAP的抑制程度为10%,对22834为27%,而D101S和42186在这个浓度范围内无明显激活或抑制效应.Mg2+对酶有轻微激活效应,当Mg2+浓度为5mmol/L 时,对各酶株的激活程度依次为:野生型23%, D101S28%,2283417%,421864%.浓度继续提高,激活作用基本保持恒定.3 讨 论311 定向进化实验设计和突变文库的构建定向进化能够快速鉴定适应性突变,以最小的序列变化产生大的表型差异,从而使氨基酸序列差异与蛋白质功能差异之间的真正相互关系变得明朗,相当大地简化了序列比较、分析工作.本研究采取合理设计和定向进化相结合的方法,在已有高活力突变株的基础上,进一步改进EAP催化活力,成功地获得了若干高活力突变株.在随机突变实验中,一个要考虑的重要因素是突变频率.对定向进化来说,合适的突变频率是每个基因2～5个碱基替换[1].我们选用的error prone PCR程序,简单、快速,而且最重要的是其突变频率可被确切控制[16].Zhao等[15]曾提出一个简单而有意义的评估文库总突变率的方法,即检测文库群体中活性克隆所占组分,他们对枯草杆菌蛋白酶error prone PCR文库的调查发现:65%的活性克隆相应于012%的突变频率.尽管不同的酶对不同的突变频率有着不同的活力分布谱,但检查文库中活性克隆的组分仍不失为一个方便的突变频率高低的指征.本研究通过调整PCR反应体系中Mn2+和Mg2+的浓度,选择活性克隆子占突变文库约70%时的反应条件,有效地筛选到了高活力目标突变子.312 突变文库的筛选突变文库构建好后,是否有一个高效、灵敏的筛选方法将是定向进化实验成功与否的关键所在.就这方面来说,肉眼可见的生色反应是最佳的.本研究中,我们建立了底物平板活性预选择加微孔板活力定量比较的双重筛选方法,有效地扩大了筛选库容量,降低了筛选强度.同时,由于是分别在两个不同的磷酸单酯底物上进行筛选,也保证了EAP的底物非特异性.如对荧光底物42MU P的活力检测表明,进化酶对它的催化活力也显著高于野生型和亲本酶.这种双重筛选方法也可适用于其他具有生色底物的酶,或能够在固体培养基上催化底物产生可见溶解环的酶,如:磷酯酶、蛋白酶、脂酶等.总之,筛选条件要能准确地反映所需目的性能.313 氨基酸置换效应的分析由热稳实验可知,S374C突变是导致进化酶热稳定性降低的主要原因.结构分析表明,Ser374位于EAP的两亚基界面处.可以推测,该突变在引起活力提高的同时,对二聚体酶分子结构的稳定性造成了一定的影响.另外,L ys167与Arg166相邻,后者起着固定底物磷酸组分的作用.K167R突变增加了该处正电的静电环境,有利于底物连结和过渡态复合物的稳定,便利底物水解.Sun等[17]报道,活性中心周围正静电环境的增加有助于降低由Zn1所稳定的一个水分子的p K a值,这个水分子是作为亲核基团攻击共价E2Pi复合物的.当其p K a 值降低时,在碱性p H下,就有更多的亲核羟基产生,从而有利于其攻击共价E2Pi复合物形成非共价E・Pi复合物,表现为水解酶活力的提高.314 金属离子的影响据报道EAP催化过程中,Mg2+起重要调节作用,Mg2+在M3金属结合位点的连结和其正八面体配位的几何形状,对EAP催化活力的最大表现都是非常重要的[18].我们的结果表明:不同EAP 变异株,受Mg2+激活的程度不同.进化酶受激活的份数低于野生型酶和D101S亲本,可能是由于进化酶中Mg2+结合力有所增加,内源Mg2+含量较多.至于每个酶分子平均结合几个Mg2+,有待进一步研究探讨.参 考 文 献1 Arnold F H.Directed evolution:creating biocatalysts for the future.Chem Eng Sci,1996,51(23):5091～51022 徐卉芳,张先恩,张用梅,等.体外分子定向进化研究进展.生物化学与生物物理进展,2002,29(4):518～522Xu H F,Zhang X E,Zhang Y M,et al.Prog Biochem Biophys, 2002,29(4):518～5223 Stemmer W P C.Rapid evolution of a protein i n vit ro by DNA shuffling.Nature,1994,370(4):389～3914 Oue S,Okamoto A,Yano T,et al.Redesigning the substrate specificity of an enzyme by cumulative effects of the mutations ofnon2active site residues.J Biol Chem,1999,274(4):2344～23495 Miyazaki K,Wintrode P L,Grayling R A,et 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D101S as parent was directed.Through two cycles of error prone PCR,coupled with a sensitive screening method,an evolved variant42186was obtained.Its catalytic activity was32fold higher than that of D101S parent and352fold more active than wild2type EAP.The kinetic analysis indicated that the evolved enzyme exhibits a higher substrate binding ability and a higher catalytic efficiency than the D101S parent enzyme.DNA sequence revealed that42186contains two amino acid substitutions,K167R and S374C,both of which locate neither the substrate2binding sites nor the metal2binding sites of EAP.K ey w ords directed evolution,error prone PCR, E.coli alkaline phosphatase,catalytic activity 3Corresponding author.Tel:86227287641492,E2mail:x.zhang@ Received:J une7,2002 Accepted:J une28,2002。
多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达研究
多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达研究摘要：真核生物的许多蛋白富含二硫键。
由于大肠杆菌细胞质中含有二硫键还原酶，利用大肠杆菌生产具有生物活性的重组二硫键蛋白充满挑战。
近年来，SHuffle菌株、超氧化性细胞的相继问世，利用分子伴侣或引入二硫键从头形成体系，使多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达成为可能。
简要概述了野生型大肠杆菌细胞周质和经遗传改造的工程茵细胞质中二硫键的形成机制，并着重介绍了近年来重组二硫键蛋白表达策略的最新研究进展，对利用大肠杆菌反应器生产富含二硫键蛋白起指导意义。
关键词：二硫键蛋白：大肠杆菌；Dsb蛋白；分子伴侣；巯基氧化酶；超氧化性细胞蛋白质在细胞的各种生命活动中扮演了重要的角色，如信号传导、免疫应答、细胞粘附等。
20世纪70年代，DNA重组技术的应用，使蛋白质能在多种宿主细胞中表达[1]。
总体上，高产率重组蛋白的获得比较困难且不可预计，尤其是目标蛋白存在翻译后修饰，如形成二硫键。
真核生物内的二硫键蛋白普遍存在，对人类基因组的预测表明，大约30%的蛋白定位于内质网，而其中一半数量含有二硫键[2]。
二硫键可在构象上固定多肽链的骨架或改善其热动力学稳定性，以抵抗高温、强酸、强碱等伤害。
因此，二硫键蛋白常被分泌到细胞外或锚定于细胞膜，它们适于作为治疗药物（如胰岛素、抗体）或制药产业的靶标蛋白[3]。
工业化生产及科学研究也需要大量的活性蛋白。
真核细胞（酵母、昆虫、中国仓鼠卵巢细胞）表达二硫键蛋白，时间长且花费大，而无细胞表达体系难以实现扩大化生产。
大肠杆菌是目前首选宿主菌之一，因其具备生长快、操作简单、产量高等特点备受人们青睐[3]。
大肠杆菌中二硫键蛋白的形成定位于细胞周质，但蛋白产率低。
而大肠杆菌细胞质缺乏真核蛋白表达所需的翻译后加工机制，因此多数二硫键蛋白在细胞质中形成包涵体。
蛋白包涵体只能通过变性、复性等过程获取一定比例的活性蛋白，且方法繁琐、产率低下、通用性不强。
因此如何改善大肠杆菌细胞的表达环境以获得高产率的活性二硫键蛋白，是科学家们致力于解决的难题。
大肠杆菌适应性进化及其分子机制
大肠杆菌适应性进化及其分子机制大肠杆菌是一种常见的肠道微生物，通常被认为是健康肠道的标志性菌种。
然而，当这些细菌暴露于不利环境中时，大肠杆菌会表现出惊人的适应性，以适应环境的变化。
在生物学中，这种现象被称为适应性进化。
适应性进化是指生物体在环境压力下进行的遗传和表现性变化，以增强其适应力。
大肠杆菌的适应性进化显然具有广泛的应用前景，因此对其分子机制的研究得到了广泛关注。
相对于其他类型的进化，适应性进化的特点是速度快、可靠性高，并且通常是由基因突变引起的。
在大肠杆菌中，适应性进化往往表现为克服抗生素或其他毒性化合物的能力。
这种进化是通过一些机制实现的，包括水平基因转移、突变、选择和表现型可塑性等。
大肠杆菌的适应性进化往往由基因突变引起，最常见的突变类型是点突变。
与拟南芥和果蝇等其他生物不同，大肠杆菌的基因组非常小，但是它们可以通过快速获取突变来适应新环境，这进化速度快的原因之一。
然而，大肠杆菌的基因组大小与其他重要的生物学因素也有关系。
水平基因转移也是大肠杆菌进行适应性进化的重要机制。
这是一种通过细菌与细菌之间的接触直接将 DNA 传递给另一个细菌的过程。
这种传递通常发生在生长密集的环境中，例如病院、动物肠道、处理污水的基因库等。
水平基因转移可以快速传递适应新环境的基因突变，从而加快适应性进化的进程。
不过，水平基因转移通常发生在高级生物，如人类疾病、疾病变异和抗生素耐药的原因。
在这些情况下，通过水平基因转移获取抗药性对人类极为危险，因此应该加强对这一现象的研究。
选择也是大肠杆菌进行适应性进化的重要因素之一。
这项研究的核心是理解环境选择的影响。
在自然环境中，大肠杆菌必须战胜生活在同一环境下的其他细菌，接受各种不同的压力，如毒素、贫乏的营养补给和极端温度。
经过选择后，大肠杆菌可以通过适应新的环境，在新领域中生存并繁殖。
此外，表现型可塑性也是大肠杆菌进行适应性进化的重要机制。
表现型可塑性是指细菌在不同环境下表现出不同的特征。
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摘要大肠杆菌操纵元otsBA的定向进化研究海藻糖[Trehalose, ?－Ｄ－ｇｌｙｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－?－Ｄ－ｇｌｙｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ ]，是一种非还原性二糖，由二分子葡萄糖以(?????-1→1 糖苷键连结而成[2]。
它通常作为应激代谢物而广泛存在于生物体内。
近年来因其对生物大分子的非特异性的保护作用而倍受人们关注[10]。
在微生物体内，海藻糖的体内合成主要通过三种途径。
第一种是通过转糖苷键作用将麦芽糖结构转变为海藻糖结构，这一过程由海藻糖合酶（Trehalose Synthase）[15]或麦芽寡糖基海藻糖合酶(Maltooligosyl trehalose synthase， MTSase) /麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyl trehalose trehalo- hydrolase， MTHase)酶系[17]催化完成。
第二种途径由海藻糖磷酸化酶（Trehalose phosphorylase）（EC 2.4.1.64）[18]催化，它能可逆的将葡萄糖及葡萄糖-1-磷酸转化成海藻糖和磷酸。
第三种海藻糖合成途径为绝大多数微生物所采用，它通过一个双酶体系——海藻糖-6-磷酸合成酶(Trehalos-6-phophate synthase) / 海藻糖-6-磷酸水解酶(Trehalos-6-phophate phosphatase)[19]酶系完成。
海藻糖-6-磷酸合成酶将高能糖化合物UDP-Glucose的葡糖基转移到葡萄糖-6-磷酸上合成海藻糖-6-磷酸，再由海藻糖-6-磷酸水解酶水解掉磷酸生成海藻糖。
在大肠杆菌(E.coli)中，该酶系由位于基因组42min的操纵元(operon)otsBA 编码[47]。
该操纵元全长2.1kb，基因otsB位于上游编码海藻糖-6-磷酸水解酶，而基因otsA位于otsB下游编码海藻糖-6-磷酸合成酶。
二者间有23nt 的重叠。
鉴于该酶系在工程学领域的意义及其基因一级结构的特殊性，我们对该操纵元进行定向进化改造。
定向进化作为一种新的蛋白质工程策略，近年来被广泛应用于提高酶的活性及改善酶的性质[26]。
目前，利用该方法已取得了许多令人满意的结果，包括Crameri等对对硝基苯酯酶的研究[38]，Beaudry等对核酶方面的研究[43]，Shao等对枯草杆菌蛋白酶E的研究[34]，以及本实验室对天冬氨酸酶的定向进化研究[44，45]。
在以上研究工作中，通过对酶基因随机的体外突变和重组，构建了一个突变库。
然后，通过特定的条件对突变库进行筛选。
这期间我们不需要了解酶的高级结构和催化机制。
而且，与自然界的分子进化过程类似，我们可以通过一次操作获得多种不同的结果。
我们需要指出的是，以上各酶都是由单个基因编码的。
而生物体是复杂的整体，对一些涉及细胞正常代谢途径的酶，很难通过对一个基因的改造而造成表型的改变。
对操纵元otsBA来说，我们将面临同样的问题。
我们可能通过对TPS或TPP进行随机突变或其它遗传学操作，但我们无法在体内调节海藻糖-6-磷酸生成和水解的平衡。
但如果我们将两个基因一起进行进化和筛选，我们则可能找到两个酶达到最佳配合时的情况。
我们称之为协同进化(Co-evolution)。
这样一来，我们就可以将两个基因放在一起考虑，而不必顾忌当一个酶达到最佳状态时是否会对另一个酶产生不利的影响。
而且由于我们将两个酶作为一个整体，所以我们也不需要分析每一个酶的性质。
我们首先克隆的E. coli操纵元otsBA并如Zhao et al. [35]所述进行易错PCR来对该操纵元随机突变。
引物使用POTS1 (GTGCGAGCTCATGT CTGTAAAGCGCGTTCTGCG)和POTS2 (GTGAGGTCGACGTGCTGTT AGTTCCACTTAGG)，其中下划线部分分别对应限制性酶切位点Sac I和Sal I。
然后，PCR产物混合物直接通过由我们设计的新的DNA改组方法——Shuffling PCR进行重组。
Shuffling PCR方法的主要思想是缩短延伸反应时间，并使截断的PCR产物在下一循环中作为引物随机结合模板库中的模板（Fig.16）。
与Stemmer [36]的Shuffling方法不同，Shuffling PCR方法中改组与扩增都是在一步PCR操作中完成。
这样使点突变的重排更加快速和高效。
该方法对序列的长短也无限制。
用易错PCR产物为模板，用POTS1和POTS2为引物按以下步骤进行Shuffling PCR：95℃ 60s, 50℃ 60s, 72℃ 20s, 10cycles → 95℃ 60s, 52℃ 90s, 72℃ 20s, 20cycles → 95℃ 60s, 53℃ 90s, 72℃ 30s, 50cycles, 然后于 72℃保温10min。
最终的PCR产物与pUC18连接。
我们通过紫外诱变构建了一株海藻糖利用缺陷型菌株，E.coli DEF3 (tre-)。
我们将其作为重组质粒的宿主菌，以消除菌体对海藻糖利用造成的影响。
含重组质粒的菌株通过蓝白斑方法进行筛选。
将阳性菌株转印到TS培养基平板（0.5% 胰化蛋白胨, 0.5% NaCl 和2% 琼脂）上，当菌落长至直径1mm左右时，将平板于室温浸在0.5M 的三氯乙酸中5 min，然后加入0.4ml 5% 的苯酚溶液和2ml硫酸。
菌落呈现由棕至黑的不同颜色，从中选择显色较深的菌落进行研究。
以上述方法对大约4,000个菌落进行了筛选，共有15株表现出较对照高的海藻糖含量（Table. 4）。
其中E.coli TS7海藻糖产量超过野生型操纵元otsBA 3.7倍的突变体。
该突变体海藻糖产量较E.coli DH5?高12.3倍。
蛋白质电泳分析表明 (Fig.13)，突变体与野生型操纵元在E.coli中表达量接近，证明海藻糖含量的提高主要是酶活性提高的结果。
进一步的薄板层析证明了海藻糖为细胞唯一储备的糖类。
对E.coli 操纵元otsBA进行定向进化可能遇到的另一问题在于使酶活提高的进化潜能是有限的。
由于其碱基数目确定并已经历漫长的自然选择过程，决大多数进化可能已被淘汰。
为提高其进化潜力，我们在shuffling PCR时引入与之有54%同源性的酵母S. cerevisiae的tps1 cDNA序列作为模板之一。
由于序列的同源性，截断的PCR产物将可能于下一循环中与外源模板结合并在延伸过程中加入外源序列。
我们定义这种进化方式为杂合进化(Hybrid-evoluton)。
通过杂合进化和筛选，我们得到10个海藻糖含量较高的突变株(Table. 5)，其中突变体E. coli TS22海藻糖产量超过野生型操纵元otsBA 1.6倍，较E.coli DH5?高5.3倍。
筛选效率往往是决定定向进化成功与否的关键。
但是到目前为止，尚没有快速而灵敏的方法来检测菌体海藻糖含量。
这严重的限制了我们对整个突变库的研究。
虽然如此，我们仍分别通过协同进化和杂合进化得到了海藻糖含量提高12.3倍和5.3倍的突变体。
这证明了方法的可行性。
我们没有得到活力更高的突变体的另一个原因可能在于高浓度的海藻糖是环境压力的一种信号，大量的海藻糖的存在使细胞整体代谢水平降低。
以上工作证明了协同进化和杂合进化作为定向进化方法的一部分，是有效的进行蛋白质工程和分子进化的工具。
对E. coli操纵元otsBA的进化结果不仅为工业化生产海藻糖提供了合适的基因工程菌，同时，也表明我们所设计的两种新的定向进化方法——协同进化方法和杂合进化方法的成功，我们对DNA进行改造手段更加丰富。
同时，以上事实在理论上证明了进化上已趋保守的基因仍具有强大的进化潜力。
基因和基因组的稳定性是相对的，环境的变化方向将决定进化的方向。
关键词：海藻糖；定向进化；协同进化；杂合进化；otsBA；tps1；Shuffling-PCRＧＧＴＡＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＣＴＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＡＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＴＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＡＧＣＣＴＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＴＴＡＴＴＡＡＧＡＣＡＴＡＧＡＡＣＴ １ ＡＴＧＡＣＴＡＣＧＧ ＡＴＡＡＣＧＣＴＡＡ ＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧ ＡＣＣＴＣＧＴＣＴＴ ＣＡＧＧＧＧＧＴＡＡ ＣＡＴＴＡＴＴＧＴＧ ６１ ＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡ ＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴ ＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴ ＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡ ＧＴＡＣＧＧＧＡＣＡ ＧＴＡＣＧＡＧＴＡＣ １２１ ＧＣＡＡＴＧＴＣＧＴ ＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴ ＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧ ＴＴＧＧＡＡＧＧＧＴ ＴＧＡＡＧＡＡＧＡＣ ＧＴＡＣＡＣＴＴＴＣ １８１ ＡＡＧＴＧＧＴＴＣＧ ＧＡＴＧＧＣＣＴＧＧ ＧＣＴＡＧＡＧＡＴＴ ＣＣＴＧＡＣＧＡＴＧ ＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡ ＧＧＴＧＡＧＧＡＡＧ ２４１ ＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧ ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡ ＴＧＣＣＧＴＡＣＣＣ ＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡ ＧＣＧＡＴＧＡＡＡＴ ＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡ ３０１ ＣＡＣＴＡＣＡＡＣＧ ＧＧＴＴＣＡＧＴＡＡ ＴＴＣＴＡＴＴＣＴＡ ＴＧＧＣＣＧＴＴＡＴ ＴＣＣＡＴＴＡＣＣＡ ＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧ ３６１ ＡＴＣＡＡＴＴＴＣＧ ＡＣＧＡＧＡＡＴＧＣ ＧＴＧＧＴＴＧＧＣＡ ＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧ ＣＡＡＡＣＣＡＧＡＣ ＧＴＴＣＡＣＣＡＡＣ ４２１ ＧＡＧＡＴＴＧＣＴＡ ＡＧＡＣＴＡＴＧＡＡ ＣＣＡＴＡＡＣＧＡＴ ＴＴＡＡＴＣＴＧＧＧ ＴＧＣＡＴＧＡＴＴＡ ＣＣＡＴＴＴＧＡＴＧ ４８１ ＴＴＧＧＴＴＣＣＧＧ ＡＡＡＴＧＴＴＧＡＧ ＡＧＴＣＡＡＧＡＴＴ ＣＡＣＧＡＧＡＡＧＣ ＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡ ＣＧＴＴＡＡＧＧＴＣ ５４１ ＧＧＧＴＧＧＴＴＣＣ ＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣ ＡＴＴＣＣＣＴＴＣＧ ＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴ ＡＣＡＧＡＡＴＴＴＴ ＡＣＣＴＧＴＣＡＧＡ ６０１ ＣＡＡＧＡＧＡＴＴＴ ＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴ ＴＴＴＧＡＧＴＴＧＴ ＧＡＴＴＴＡＧＴＣＧ ＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣ ＡＴＡＣＧＡＴＴＡＴ ６６１ ＧＣＡＡＧＡＣＡＴＴ ＴＣＴＴＧＴＣＴＴＣ ＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧ ＧＴＧＣＴＴＡＡＣＧ ＴＧＡＡＴＡＣＡＴＴ ＧＣＣＴＡＡＴＧＧＧ ７２１ ＧＴＧＧＡＡＴＡＣＣ ＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴ ＣＧＴＴＡＡＣＧＴＡ ＧＧＧＧＣＣＴＴＣＣ ＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴ ＣＧＡＣＧＴＧＧＡＣ ７８１ ＡＡＧＴＴＣＡＣＣＧ ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡ ＡＡＡＧＧＡＡＴＣＣ ＧＴＡＣＡＡＡＡＧＡ ＧＡＡＴＣＣＡＧＣＡ ＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡ ８４１ ＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧ ＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴ ＣＡＴＡＧＴＴＧＧＴ ＧＴＣＧＡＣＡＧＧＣ ＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴ ＣＡＡＡＧＧＴＧＴＧ ９０１ ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＴ ＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴ ＧＧＡＡＧＴＧＴＴＴ ＣＴＧＡＡＣＧＡＧＣ ＡＴＣＣＡＧＡＡＴＧ ＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧ ９６１ ＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧ ＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣ ＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴ ＣＧＴＧＧＡＧＡＴＧ ＴＧＧＡＡＧＡＧＴＡ ＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡ １０２１ ＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧ ＴＣＡＡＴＧＡＧＴＴ ＧＧＴＣＧＧＴＡＧＡ ＡＴＣＡＡＣＧＧＴＣ ＡＧＴＴＣＧＧＴＡＣ ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＣ １０８１ ＧＴＣＣＣＣＡＴＣＣ ＡＴＴＴＣＡＴＧＣＡ ＣＡＡＧＴＣＴＡＴＡ ＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧ ＡＧＣＴＧＡＴＴＴＣ ＧＴＴＡＴＡＴＧＣＴ １１４１ ＧＴＧＡＧＣＧＡＴＧ ＴＣＴＧＣＴＴＧＧＴ ＣＴＣＧＴＣＣＡＣＴ ＣＧＴＧＡＴＧＧＴＡ ＴＧＡＡＣＴＴＧＧＴ ＴＴＣＣＴＡＣＧＡＡ １２０１ ＴＡＴＡＴＴＧＣＴＴ ＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡ ＡＡＡＧＡＡＡＧＧＴ ＴＣＣＴＴＡＡＴＣＣ ＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴ ＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣ １２６１ ＣＣＧＣＡＣＡＡＴＣ ＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴ ＧＣＴＡＴＴＡＴＴＧ ＴＡＡＡＴＣＣＴＴＧ ＧＡＡＣＡＣＣＧＡＴ ＧＡＴＣＴＴＴＣＴＧ １３２１ ＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡ ＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧ ＡＣＴＴＴＧＴＣＣＧ ＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡ ＡＧＡＡＧＴＴＡＡＣ ＴＧＧＧＡＡＡＡＡＣ １３８１ ＴＴＴＡＣＡＡＡＴＡ ＣＡＴＣＴＣＴＡＡＡ ＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧ ＣＣＴＴＣＴＧＧＧＧ ＴＧＡＡＡＡＴＴＴＣ ＧＴＣＣＡＴＧＡＡＴ １４４１ ＴＡＴＡＣＡＧＴＡＣ ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣ ＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴ ＣＣＴＣＴＧＣＣＡＣ ＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡ ＴＧＡＡＣＴＣＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＡＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＡＣＴＣＡＣＡＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＧＴＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＴＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣ （ｂ） Fig.7 Sequence analysis of recombinant plasmid pTPS15. (a) chromatograms and（b）derived sequence4.3海藻糖利用缺陷型菌株的构建如3.5.1方法对E. coli DH5??进行紫外诱变。