酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
固相酶联免疫斑点技术
固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。
想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。
这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。
很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。
固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。
这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。
就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。
它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。
你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。
哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。
你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。
也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。
就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。
这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。
简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。
再说说检测的过程。
想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。
每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。
如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。
检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。
哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。
医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。
比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。
这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。
谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。
没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。
它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。
快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。
想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展
作者单位 ：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研 究室 通讯作者 ：张宗德 ，电子信箱 ：ｚｄ １＠１３ｃ ｒ ｚ ４ ７ ６ ．ｏ ｎ
结核 病与 胸部 肿 瘤 ２０ ０ ８年 第 ４ 期 胞 。Ｅ ＩＰ 简 单 、 稳定 、灵 敏 ，不 受细 胞 Ｌ Ｓ ＯＴ 因子 代 谢等 因素 的 影 响 ，可 在单 细胞 水 平 检 测 淋 巴 细胞 对 特 异 性 抗 原 的 反 应 能 力及 计 数 特 异性 抗 原 刺 激 下 分 泌 性 淋 巴细 胞产 生 的 情 况 ，能够 比较 真 实 地 反 映 体 内 细胞 因子 的 水 平 ，Ｅ Ｉ Ｐ 现 已被 运 用 于 各 种疾 病 诊 断 和 Ｌ Ｓ ＯＴ 科 学研 究 中 。 Ｔ Ｔ 应 用 的纯 化 蛋 白衍生 物 （ｕｉｅ Ｓ所 ｐ ｒ ｉｄ ｆ ｐｏ ｉｄｒ ａｖｓ Ｐ ｒｔｎ ｅｉ ｔ ｅ，Ｐ Ｄ）是 存在于结 核分枝 杆 ｅ ｖｉ
产 生 多 种 细胞 因子 发 挥 免疫 效 应 ，其 中 Ｙ干 扰 素 （Ｆ Ｙ）是 最 为 关键 的细 胞 因子 。 因 ＩＮ—
此 ，检 ￣ ｌＮ— 水 平或 分 泌ＩＮ— ｇ Ｆ Ｆ Ｙ的 效应 Ｔ 细 胞 的水 平就可 以判 断是 否存在 结核 感染 。 Ｅ ＩＰ Ｔ 通 过 检测 分 泌 细 胞 因子 的细 ＬＳ 量 夹 ， Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ ＯＴ ￣Ｅ Ｉ Ａ方 法 ：
结核 诊断 技 术 ，它是通 过抗 原特 异性Ｔ 巴细 淋 胞 反应 频 率 来 检 测结 核 感 染 患 者 的 细胞 免 疫
功能 。
１酶联免疫斑点技术的原理
结 核 病 的 免疫 学 机 制 主要 是 机 体 对结 核
２ ９５
敏 感度 均 为 ８ ％，健 康 成 人 中Ｐ Ｄ－Ｌ Ｓ ＯＴ ０ Ｐ Ｅ ＩＰ 的 敏 感 度为 ９ ％；英 国健 康 成 人 中两 种 肽 段 ８
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
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酶联免疫斑点技术
摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术
随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史
1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
2. ELISPOT技术的基本原理
2.2ELISPOT 检测原理.在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。
洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin) 标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase , AKP) 或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP) 标记的链亲和素结合。
经底物,如BCIP/ NBT孵育后, 在PVDF 孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。
通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。
2.2ELISPOT技术原理.ELISPOT的技术原理与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。
其实验设计是在96 微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin) 的单克隆抗体。
然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。
随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell ,PBMC) ) 分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。
一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌CK,此时局部(紧靠分泌细胞的周围) 分泌出的CK会被PVDF 薄膜上包被的特异性抗体捕获。
洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。
然后将未结合的酶洗除,再以AKP 或HRP 标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/ NBT) 使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。
斑点多少可以在ELISPOT读数系
统上进行自动化计数或在立体显微镜上进行人工计数。
当然也可以在96 微孔培养板上包被特异性捕获抗体来检测特异的CK分泌细胞。
3. ELISPOT技术的优缺点
3.1优点.(1) 侧重于细胞检测, 弥补了体液中CK 半衰期短的不足, 当体液中某CK 含量较低时, 用ELISPOT 法检测具有较高灵敏性。
(2) 既可检测自发分泌细胞, 又可检测抗原特异性CK 分泌细胞, 具有较高特异性, 并可观察药物治疗反应,且首次使对CSF 中T、B 细胞研究成为可能, 对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。
(3) 因新鲜标本来源的限制, 作者实验室用ELISPOT 法试测了经过程序冰冻冻存的外周血或CSF 单个核细胞的分泌功能, 发现与新鲜标本差异无显著性, 既可减少试剂浪费, 又可利于临床做回顾性或前瞻性研究。
3.2缺点.(1) 比ELISA 技术复杂而费时, 需严密控制实验条件, 操作人员需技术熟练, 并能对实验结果进行分析, 以减少实验偏差。
(2) 属半定量方法, 试剂比ELISA 价格贵, 当细胞产生大量CK时, 不宜选用ELISPOT , 而可选用ELISA。
4. ELISPOT技术的应用及展望
IFN-γ是由Thl细胞亚群分泌的一类细胞因子，能够促进CTL、NK细胞及巨噬细胞的活化和增殖，介导细胞毒效应，在抗病毒感染中发挥着重要作用。
目前检测NDV诱导特异性IFN-γ的方法主要是ELISA试验，但该方法只能定性检测培养上清中IFN-γ含量，而无法进行细致的免疫学机理研究。
酶联免疫斑点法(EHSPOT)是基于ELISA试验发展起来的，即可从单细胞水平检测抗体分泌细胞，又可以检测分泌量的一种细胞免疫学检测技术。
从脾淋巴细胞的浓度、培养时问、抗原刺激量等方面确立了检测NDV诱导特异性IFN-γ的ELISPOT方法，进而为新城疫细胞免疫的研究提供了一种更为准确、灵敏、特异的试验方法。
目前，ELISPOT法在全球尚未完全标准化，研究人员必须采用最佳匹配(best pair)的包被抗体和检测抗体、ELISPOT 板、形成斑点的底物及其显色时间等。
如果上述因素都能够标准化，就可以在许多研究领域中快速获得有可比性、更有价值的免疫学研究成果，从而为免疫学研究开辟新的研究思路和方法。
现在ELISPOT主要用于医学研究中。
对于疫苗研究，中国药品生物制品检定所
在《预防用DNA 疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》等规定中均指出，ELISPOT是检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法。
由于它具有诸多优点，可以预见该方法在免疫学研究、免疫监测、动物疫病监测、疫苗评估等多方面将会发挥极其重要的作用。