酶联免疫斑点检测技术研究进展

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酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用

提供，脑脊液Ｔ — ＮＰＲ）平 ≥５０ｃｐｅ／ｌ断为阳ＢＤＡ（Ｃ水０ｏｉｍ判ｓ
性，５０ｃｐｅｍ判断为阴性。检测结果使用Ｐｉ５０软＜０ｏｉ／ｌｓｒｍ．ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组间率的比较采用卡方
特异性ｒ扰素（Ｆ —）平可以用于结核分枝杆菌感染的干ＩＮｒ水
断为阳性，抗原检测结果为阴性，果判断为阴性；有３种结所脑膜脑炎病例均常规行脑脊液ＡＡ、脊液Ｔ — ＮＰＲ）Ｄ脑ＢＤＡ（Ｃ
检测。脑脊液ＡＡ使用酶标法进行检测，据国内同行Ｄ根２００４年对脑脊液ＡＡ在结核性脑膜脑炎中研究的标准ＪＤ，脑脊液ＡＡ１８ＵＬ判断为阳性，８ＵＬ判断为阴性；Ｄ＞／＜／脑脊
液Ｔ —ＮＢＤＡ荧光定量聚合酶链反应试剂由达安基因有限公司
选非结核性脑膜脑炎病例均通过临床治疗转归及实验室检查最终确诊。
方法
所有病例均抽取乙二胺四乙酸（ＤＡ）凝血５ｍ，ＥＴ抗ｌ送
实验室行Ｅｉｏ检测。检测结果根据斑点数量设定，一反ｌｐｔｓ每
术在结核性脑膜脑炎中的应用价值。
临床资料
、
果
在７例结核性脑膜脑炎的诊断中，ｌｐｔ性者４３Ｅｉｏ阳ｓ５

免疫学检验技术的研究进展

细胞，产生ＣＫ或Ｉ。细胞下方的固相单克隆抗体就会捕获ＣｇＫ
１研究进展
１１荧光素标记抗体技术．
或Ｉｇ物质。细胞被清洗后，加入生物素化的第二抗体，抗体和ＣＫ
或Ｉ物质结合后，ｇ再加以酶做标记的生物素或亲和素反应，以酶流式荧光免疫微球分析技底物显色，阳性细胞就可形成直径约５～２０Ｔ大小不等的圆００ＩＩ
现代免疫学检验技术源于标记技术在免疫学中的应用。科
１．酶联免疫斑点技术．２２
酶联免疫斑点技术是一种用于测定
技的进步推动免疫检验技术的迅速发展，正从单一的免疫诊断
Ｂ细胞分泌免疫球蛋白、Ｔ细胞分泌细胞因子功能的分析技术，
定阳性ＴＢ细胞族群的产生则可以通过斑点直径的大小可以直、接反映。酶联免疫斑点技术既可用于分泌抗体的Ｂ细胞，也可用
于分泌各类ＣＫ的Ｔ细胞。联免疫斑点技术也是Ｔ细胞功能检酶测的标准技术，有较高的检测灵敏度日具。
技术向单细胞、多基因、微量化等方面发展。而哮喘、器官和骨髓
移植、自身免疫性疾病、变态反应、淋巴细胞和浆细胞的恶性肿瘤以及继发性和原发性免疫缺陷的临床诊断都客观要求免疫
学检验技术更加精确，且能够定量评价临床治疗的有效性。并
１．元素标记免疫检验技术．１３
元素标记免疫检验技术中的标

酶联免疫斑点试验

酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。

该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。

ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。

具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。

2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。

3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。

4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。

5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。

6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。

ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。

它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。

此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。

ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。

此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。

总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。

随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。

酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及其应用研究进展

者方面具有９％９的符合率。当比较ＴＴ方法和自Ｓ
建ＥＩＰＴ方法时发现，６的ＴＴ阳性受试者是ＬＳＯ３％ＳＥＩＰＴ阴性，２的ＴＴ阴性受试者是ＥＩＰＴＬＳＯ１％ＳＬＳＯ阳性。另外，８的ＥＩＰＴＭＴ阴性受试者是７％ＬＳＯ— ＰＥＩＰＴＢＧ阳性，这些人中大部分都接种过ＬＳＯ —Ｃ
胞中检出１分泌待检Ｃ个Ｋ的细胞，其灵敏度非常高。为其使用了识别Ｃ子中２不同表位因Ｋ分个的２种单克隆抗体，因而这种方法有着高度的特
异性［。过显色反应，５通］在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数，或通过ＥＩＰＴ分析系统对斑点ＬＳＯ
领域。本文介绍了ＥＩＰＴ的原理和特点，对ＥＩＰＴ的应用研究进展进行了综述。ＬＳＯＬＳＯ关键词：酶联免疫斑点（ＬＳＯ应用ＥＩＰＴ中图分类号：￥５．＋８２４３文献标识码：Ａ
进行计数，进行高通量筛选，率远远高于其他检效
测方法［。ＥＩＰＴ自创立至今２６ＬＳＯ］０多年来不断发
ＡｓｙＥＩＰＴ技术是利用预先包被好抗原或抗ｓａ，ＬＳＯ）体的微量板从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞或特异性细胞因子（ｙｏｉｅＣ）ｃｔｋｎ，Ｋ分泌细胞的免疫学检测技术。９３年，ｅｇｉｋ和Ｃｅｋｎｋ１８Ｓｄｗｃｔｚｒｉｓｙ嘲等根据酶联免疫吸附试验（ＬＳ）ＥＩＡ的基本原理结

酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展

作者单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室通讯作者：张宗德，电子信箱：ｚｄ１＠１３ｃｒｚ４７６．ｏｎ
结核病与胸部肿瘤２００８年第４期胞。ＥＩＰ简单、稳定、灵敏，不受细胞ＬＳＯＴ因子代谢等因素的影响，可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的情况，能够比较真实地反映体内细胞因子的水平，ＥＩＰ现已被运用于各种疾病诊断和ＬＳＯＴ科学研究中。ＴＴ应用的纯化蛋白衍生物（ｕｉｅＳ所ｐｒｉｄｆｐｏｉｄｒａｖｓＰｒｔｎｅｉｔｅ，ＰＤ）是存在于结核分枝杆ｅｖｉ
产生多种细胞因子发挥免疫效应，其中Ｙ干扰素（ＦＹ）是最为关键的细胞因子。因ＩＮ—
此，检￣ｌＮ— 水平或分泌ＩＮ— ｇＦＦＹ的效应Ｔ细胞的水平就可以判断是否存在结核感染。ＥＩＰＴ通过检测分泌细胞因子的细ＬＳ量夹，ＬＳＬＳＯＴ￣ＥＩＡ方法：
结核诊断技术，它是通过抗原特异性Ｔ巴细淋胞反应频率来检测结核感染患者的细胞免疫
功能。
１酶联免疫斑点技术的原理
结核病的免疫学机制主要是机体对结核
２９５
敏感度均为８％，健康成人中ＰＤ－ＬＳＯＴ０ＰＥＩＰ的敏感度为９％；英国健康成人中两种肽段８

ELISPOT技术简介及实验步骤

one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65

酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。

该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。

该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。

二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。

另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。

同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。

在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。

第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。

第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。

常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。

通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。

此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。

需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。

一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。

总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。

酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展

酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于农产品质量安全检测中的生物技术方法。

它通过利用抗原与特异性抗体的结合来检测目标物质的存在和浓度。

酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用研究一直处于不断发展的状态，下面将对其在不同农产品中的应用进展进行简要综述。

在农产品的有害微生物检测中，酶联免疫法是一种简便、快速、敏感和特异性较高的方法。

鲜活水果和蔬菜中常常会存在大肠杆菌和沙门氏菌等致病微生物的污染，这些微生物会引起食物中毒，威胁消费者的健康。

研究者通过制备适当的抗体，可以将酶联免疫法用于检测这些致病菌的存在和浓度。

通过 ELISA 可以在短时间内迅速筛测出微生物污染，并为农产品的质量安全提供及时保障。

在农产品的农药残留检测中，酶联免疫法也发挥了重要作用。

农药的过量使用或残留会对农产品和环境造成不良影响，对农产品中农药残留的监测和控制成为质量安全的重要环节。

酶联免疫法通过制备特异性抗体，可以快速、精确地检测农产品中的农药残留。

研究者利用酶标抗体的高特异性和敏感性，可以实现对不同种类农药残留的同时检测，极大地提高了检测效率。

在农产品的转基因成分检测中，酶联免疫法也有很高的应用潜力。

转基因农产品是通过基因工程技术将外源基因导入到作物中，以改善其特性或产量。

转基因农产品引起了广泛的争议，需要对其安全性进行严格的监管和检测。

酶联免疫法可以通过特异性的抗体对目标转基因成分进行筛查和定量分析，能够准确地检测转基因农产品的各种成分，以及评估其对人体健康和环境的潜在影响。

酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展丰富多样。

不仅可以应用于有害微生物、农药残留和转基因成分等的检测，还可以结合其他技术方法进一步提高检测的灵敏性和准确性。

随着科学技术的不断发展，酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用前景将更加广阔。

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Ｅ８ＧｏＦＺａｇＪＬｕＹｅａ．ａｙｉｏｔｙａｉ１］ａ，ｈｎＤ，ｉＰ，ｔ１Ａｎｌｓｆｓｍｅｈｌｔｎｏ
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ｖｒｔｏｎｈｍａｓｅｓｒｏＪＡ１ｃｌ：ｖｌｅｌｅａｒｌｏｕｎｏｔｏａｃｍａＳＳｅｌＮｏｅｃｌｓｕ
ｐｏｓａｅｃｎｃｒｒｗｔｂｕｓａｎｅｇｒｐｓｎｘｔａｔｒｔｔａｅｇｏｈｙｍｃｄｉａｅｋｉｅｒｃ
ａｄｒｓｅａｒｌｈｏｇｉｉｃｍｅｈｎｉＥ］ＣｎｅｎｅｖｒｔｒｕｈｄｓｎｔｃａｎｓＪ．ａｃｒｏｔｔｍｓ
Ｅ０ｅｅｌＨ，ａｒＭＲ，ａｍａｎＨ，ｔ１Ｓｇａｔｎ一１］ＢｎｋｉＪＢｅｍＢｕｎｅａ．ｉｎｌｒｓａ
（稿日期：０００ — ２收２１－７２）
酶联免疫斑点检测技术研究进展
聂华综述，世勇审校（北省襄樊市中心血站郝湖４１０）４００
（１）：０３１８．１ —０
［］ＨａｉＲｔｎＢＲｓｅａｒｌｒｓａｅａｃｒｈｍｏｒ— ４ｒＩａａ．ｅｖｒｔ — ｐｏｔｔｃｎｅｅｐｅ，ｏＡｃｖｎｉｅｇｎ？Ｅ］Ｕｒｌｇｃｃｌｇ，０２７２３２７ｅｔｅｔＪ．ｏｉＯｎｏｏｙ２０，：２—２．ｖａｏ
ＲａｉａｏｌＭｅ２６，ｄｃｌＢｉｄ，００４１：１－２５３８３．
［１］冯骥良，巧莲．５温白藜芦醇以Ｃｓａｅ依赖和非依赖两种ａｐｓ方式导致Ｊｒａ细胞死亡Ｅ］细胞生物学杂志，０７２ｕｋｔＪ．２０，９
Ｅ３ＰｔｅＧＰｔｒｏＨ，ａｏｈｅａＴｈａｃｒ５ｏｔｒＡ，ａｔｓｎＩＷｎｇｏＥ，ｔ１ｅｃｎｅｅ．
ｐｅｎａｉｅａｅｅｖｒｔｏｓｃｖｅｔｄｔｈｅａｉａ — ｒｖｅｔｔｖｇｎｔｒｓｅａｒｌｉｏｎｒｅｏｔｎｔｃｎ—
ｃｒａｅｐｉｅａａｏｂｔｃｏｃｒｍｅｅ。ｇｎｔｃ — ｔｎｎｌｙｈｅｙｔｈｏＰ４５ｅｚｍｅ０ｎｙ
ａｏｐｏｓｓｉＨＴＩＶ一一ｎｆｃｅｃｌｉｅｏｓｃｉｅ — ｐｔｉｎ１ｉｅｔｄｅｌｎｓａｐｒｐｅｔｖａｌ
ＩｔＩｍｕｎｈａｍａｏｌ２０ｎｍｏｐｒｃ，１０，０：８２．１１ — ５
［］崔嵩，学峰，斌．ＦＫ１２刘吴Ｎ —Ｂ在肿瘤中的研究进展Ｅ］现Ｊ．
代肿瘤医学，０９，７１：３ — ３．２０１（）ｌ４１７［３１］ＥｔｏｓｉｈｄａＳ，ｄｒＳ，ｔａ．ｓｅａｒｌｂｏｋｒｖＺ，ｈｓｏｉＦｅｅｌｅ１Ｒｅｖｒｔｏｌｃｓ
［３黎永胜，军．２文白藜芦醇的药理作用研究进展［］医学综Ｊ．
述，０８，４３４９４１２０１（）：６ — ７．
ｃｌＪ．ｌｏ，０３１２９７９５ｅ［］Ｂｏｄ２０，０：８－９．ｌ
・
８・２
检验医学与临床２１０１年１月第８卷第１期
ＬｂＭｅａｄｃｉ！
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！：！：！
的发展，为进一步深入研究白藜芦醇抗白血病作用的分子机制
提供了条件。因此应很好的利用这～条件，进一步加强对白藜芦醇抗肿瘤分子机制的研究，白藜芦醇的临床应用提供更可为靠的依据。
Ｅ４１］李覃，桂香，伟，虎杖提取物白藜芦醇的抗白血病范王等．
作用及其可能的分子机制Ｅ］西安交通大学学报：学Ｊ．医
版，０８，９３：４ —４．２０２（）３０３５
ｌｒｍｃａｉｎｏｉｇｔｅＥＫ／５ａｃｄ［］ＦｅａｅｈｎｓｉｖｌｈＲＰ３ｃｓａｅＪ．ｒｅｍｓｎ
Ｅ］ＬｕＢＧａ８ｉＱ，ｏＹＹ，ｕＸ，ｔａＩｌａｉｆｕｆｌｅＮｉＦｅ１ｍｐｉｔｎｏｎｈｄｄ．ｃｏ
ｐｒｅｎｒｓｎｓｎｒｓｒｔｏｌｉｄｕｅｎｈｉｔｏｎｏ５ｏｔｉｅｐｏｅｉｅｖｅａｒｎｃｄｉｂｉｉｆＫ６２
［６ＨａａｈｂｒＹｍａａＹ，ａａａ，ｔａＲｅｖｒ— １］ｙｓｉａａＴ，ａｄＮｋｙｍａＳｅ１ｓｅａ．
ｔｏｎｒｌｉｄｕｃｓｏｗｎｅｅｄｒｇｕｌｔｏｎｎｕｒｖｎｅｐｒｓｉｎｎａｉｉｓｖｉｉｇｘｅｓｏａｄ
［］ＣｉＨｅｔｌ２０，５２３２５Ｊ．ｈｎＪｍａｏ，０４２；９ — ９．
ｃｌｐｏｉｒｔｎ［］ｉｈｍＢｏｈｓＲｓＣｍｍｕ，ｅｒｌｅａｉＪ．Ｂｏｅｉｐｙｅｏｌｆｏｃｎ
２０，９１：７ — ８２Ｏ１３７８７．
ｄｏａｃＲｅ２０４５９５５．ｉｖｓｓ，００，７：４ — ５
［７ｕａＺＤｖｄＨＳＲｓｅａｒｌｎｕｅｐｐｏｉｉｅ — １］ＳｓｎＪ，ａｉ．ｅｖｒｔｏｉｄｃｄａｏｔｓｎ — ｓｓ
ｈａｅｎａｕｅｙｐｂｌｓｉｌｕｍｉｃｌｓｂｙｍｏｌ — ｎｃｄｉｃｔｌｍｈｏａｔｃｅｋｅａｅｌｄｕａ
【键词】酶联免疫吸附测定；免疫印迹法；实验室技术和方法关Ｄ：０３６／．ｓｎ１７ — ４５２１．１０３文献标志码：文章编号：６２９５（０１０ —０２０ＯＩ１．９９ｊｉｓ．６２９５．０１Ｏ．４Ａ１７～４５２１）１０８ — ３
Ｒｅ２０ｓ，０７，６７：３ — ０８９６８４５．
ｓｒｔｎｆｃｏ — ｐａｉｈｂｔｒｌｅａｉｎ，ａｓｓｃｉｉａｔｒＮＦＫａｐＢ。ｎｉｉｓｐｏｉｒｔｏｃｕｅｐｏｆＳｐａｅａｒｓ，ｎｎｕｅｐｐｏｉｆｍｙｌｉｅｋｍｉ－ｈｓｒｅｔａｄｉｄｃｓａｏｔｓｓｏｅｏｄｌｕｅａ
［９马泳泳，进．１］黄白藜芦醇诱导Ｋ５２Ａ６／Ｏ２凋亡与ｍｄｌｒ基因表达的关系［］现代中西医结合杂志，０８１（）Ｊ．２０，７４：
４８ — ８７４９．
［３吴剑锋，佐君．ＡＫ／Ｔ９沈ＪＳＡＴ信号通路及其与肿瘤侵袭、转移的关系［］Ｃｅｉ，０９２（）１６１９Ｊ．ｈｍＬｆ２０，９２：７ — ７．ｅ
ｉｅｌｕｎｌｎｔｒｅｋｉｂｅａｕｃｄｅｉｔｏｆｈｎｕｃｅｒｒｎ－ｔ—ｎｄｅａｔｖａｉｎｏｔｅｉｌａｔａ —
［３ＨｕｓｎＴ，ｒｅＤＨｕｓｌｇＳｅａＩｈｂｔｎｏ１ｄｏＳＨａｔＫ，ｒｔＤ，ｔ１ｎｉｉｏｆｌｎ．ｉ
参考文献
ｄｃｒａｄａｔｖｔｒｒｎｃｉｔｎｒｔｉｓｎｌｕｅａｕｅｎｃｉａｏｔａｓｒｐｉｐｏｅｎｉｅｋｍｉｓｏ
［３Ｂｏｄ２０，０：９０２５．Ｊ．ｌ，０３１１２４ — ９４ｏ
ｒ１Ｉ，ａｇＷ，ｅ，ｔａ．ａｕｔｎｏｎｉｅｋｍｉ１］ＴＷｎＣｈｎＨｅ１Ｅｖｌａｉｆａｔｌｕｅａｉｏ —
ｅｅｔｆｒｓｅａｒｌｙｍｏｕａｉｇＳＴＡｉａｎ［］ｆｃｏｅｖｒｔｄｌｎＡ３ｓｎｌｇＪ．ｆｏｂｔｇｉ
ＣＰＢＩ３ＢＣｎｅ，０２８：７ — ７．ＹＩ１Ｊ．ｒａｃｒ２０，６７４７８－Ｊ
ｇｎｏｄｌＴｃｌｌｋｍｉｃｅｔｅａｙ］ＮｕｒｅｔｒａｕｔｅｅｅａｈｍｏｈｒｐＪ．ｔｆｌｕＥ