酶联免疫检测技术
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测是一种常用的生物技术方法，它结合了酶标记和免疫反
应的原理，可用于检测生物样品中特定分子的含量，如蛋白质、抗体、激
素等。
具体步骤如下：
1.准备样品：从生物样品中提取目标分子，例如血液、尿液、细胞等。
2.免疫反应：将一定浓度的目标分子加入到反应孔中，并加入与目标
分子特异性的抗体，使两者发生免疫反应。
3.洗涤：对反应孔进行洗涤，以去除未与抗体结合的杂质以及剩余的
抗体。
4.添加荧光标记的二抗：向反应孔中加入荧光标记的二抗，使其与已
结合的抗体形成复合物。
5.洗涤：对反应孔进行再次洗涤，以去除未结合的荧光标记的二抗。
6.酶标记：向反应孔中加入用酶标记的物质（如酶标记的抗体），使
其与已结合的荧光标记的二抗形成复合物。
7.洗涤：对反应孔进行最后一次洗涤，以去除未结合的酶标记化合物。
8.反应染色：向反应孔中加入染色物质，使其与酶标记化合物发生颜
色反应，形成分析结果。
最终，检测结果可以通过测量反应孔中染色物质的光密度或荧光强度
来评估样品中目标分子的浓度。
酶联免疫检测方法具有高灵敏度、高特异
性和高通量等优点，广泛应用于医学、生物工程、食品安全等领域。
酶联免疫检测试剂盒的原理和应用(广州培训)
袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露 在光线下。 9、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的 吸光度值小于个单位（OD450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
二、磺胺类药物等 ELISA检测方法 的介绍与注意事项
1、磺胺类药物ELISA试剂盒 2、氟喹诺酮类药物ELISA试剂盒 3、莱克多巴胺ELISA试剂盒 4、克仑特罗ELISA试剂盒 5、样本前处理与酶标分析注意事项
残留限量要求
磺胺类药物：在肌肉、肝脏样品中总量最高残留限量为100 g/kg 恩诺沙星、环丙沙星：在肌肉样品中最高残留限量为100 g/kg 莱克多巴胺：在猪肉样品中为不得检出。 克仑特罗：在猪肉样品中中为不得检出。
------农业部第235号文件
1、磺胺类药物试剂盒
试剂盒种类：磺胺三合一（SM2,SDM,SM1）、磺胺七合一(SMZ,SDZ,SMM,ST等)、 磺胺喹恶啉
的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点。在洗板过程中如果出现板孔干燥 的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即 进行下一步操作。
5、注意事项
6、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 7、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、
OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。 8、储存条件保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封
酶联免疫法国内外的技术发展
酶联免疫法国内外的技术发展酶联免疫法是一种常用的生物技术方法，被广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物开发等领域。
本文将对酶联免疫法的国内外技术发展进行介绍和分析。
一、酶联免疫法的基本原理酶联免疫法是一种利用酶和抗体相互作用的免疫学方法。
其基本原理是将待测物与标记有酶的抗体或抗原结合，形成特异性的抗原-抗体复合物。
通过酶的催化作用，可以将待测物定量转化为颜色、荧光或发光等信号，从而实现对待测物的检测和定量。
二、国内酶联免疫法技术发展在国内，酶联免疫法的技术发展取得了长足进步。
首先是检测方法的改进。
近年来，随着技术的发展，新的检测方法不断涌现，如发展了高灵敏度的酶标仪和多光子显微镜等设备。
这些新方法的应用，提高了检测的灵敏度和准确性。
其次是标记物的改进。
传统的酶联免疫法常用酶标记物是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），而近年来，越来越多的新型标记物被引入，如金纳米颗粒、荧光染料和荧光蛋白等。
这些新型标记物不仅具有更好的稳定性和灵敏度，还可以实现多重检测。
此外，还有一些新颖的酶联免疫法技术被开发出来，如电化学酶联免疫法和微流控酶联免疫法等。
三、国外酶联免疫法技术发展国外对酶联免疫法的研究和应用也非常活跃。
一方面，国外在酶联免疫法的基础上进行了许多改进，提高了其灵敏度和准确性。
例如，引入了放射性同位素标记物，使得检测的灵敏度大幅提高。
另一方面，国外还开发了一些新的酶联免疫法技术，如酶放大技术和磁性颗粒酶联免疫法。
这些新技术不仅可以提高检测的灵敏度和速度，还可以实现高通量和自动化。
四、酶联免疫法的应用领域酶联免疫法在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域有着广泛的应用。
在医学诊断中，酶联免疫法可以用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、感染性病原体和自身免疫性疾病相关的抗体等。
在生物学研究中，酶联免疫法可以用于研究蛋白质相互作用、细胞信号传导和基因表达调控等。
在药物开发中，酶联免疫法可以用于筛选药物靶点和评估药物的效力。
酶联免疫技术检测
结果
原理
类型
试剂 准备 对照 标本
1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相 抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与 固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗 涤除去其他未结合物质。 3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物 上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的 酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本 中受检抗原的量相关。 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有 色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
类型
试剂 准备 对照 标本
结果
原理
结合物用的抗原和抗体
类型
制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其
试剂 准备 对照 标本
他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结 合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应， 实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总 的要求是抗原必须是高纯度的。
结果
封闭
原理
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质
类型
试剂 准备 对照 标本
溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填
这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附
。
常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1% 明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？
2.2.4 竞争法测抗体
原理
类型
试剂 准备 对照 标本
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。
ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。
在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。
最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。
首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。
之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。
最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。
在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。
通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。
4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。
该抗体与样品中的目标物竞争结合。
接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。
5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。
随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。
6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。
首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。
目标抗原与抗体特异性结合。
接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。
酶联免疫标记技术
酶联免疫标记技术酶联免疫标记技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用于检测生物样本中特定蛋白质、抗体、荷尔蒙、抗原等的定量和定性方法。
该技术利用酶与抗原-抗体复合物相互作用的原理，通过酶的催化作用将底物转化为可检测的产物，从而实现对目标分子的检测和测量。
ELISA技术通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等不同类型，但它们的基本原理相似。
以下是酶联免疫标记技术的基本步骤：1．包被阶段（Coating）：将要检测的抗原或抗体吸附在固体表面上，如微孔板的底部或壁上。
2．阻断阶段（Blocking）：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白、鱼胶等）阻断未被包被的表面，以减少非特异性结合。
3．结合阶段（Binding）：将待测样本加入到包被的微孔板中，目标分子与包被的抗体或抗原发生特异性结合。
4．洗涤阶段（Washing）：使用缓冲液洗去未结合的样本成分，以减少背景干扰。
5．检测阶段（Detection）：加入与目标分子特异性结合的检测抗体，形成抗原-抗体复合物。
6．洗涤阶段（Washing）：再次使用缓冲液洗去未结合的检测抗体。
7．酶标记阶段（Enzyme Labeling）：加入与检测抗体特异性结合的酶，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
8．底物加入阶段（Substrate Addition）：加入底物，酶催化底物产生可检测的产物。
9．测量阶段（Measurement）：使用光度计或荧光测量仪器测量产物的光学密度或荧光强度，从而定量目标分子的浓度。
ELISA技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本较低等优点，因此在医学诊断、生物医学研究、药物开发等领域被广泛应用。
酶联免疫胶体金法
酶联免疫胶体金法（enzyme-linked immunogold assay，ELIGA）是一种常用的免疫试验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
它结合了酶标技术和胶体金技术的优点，具有高灵敏度和高特异性的特点。
酶联免疫胶体金法的原理是将与特定抗原或抗体结合的胶体金标记物用作检测信号。
标记的胶体金微粒具有良好的稳定性和可视性，能够在光学显微镜下观察到。
该方法主要包括以下步骤：
1. 样品处理：对待检样品进行处理，如提取目标抗原或抗体。
2. 固相吸附：将处理后的样品加入固相吸附物（如酶标板、膜片等），使目标物质固定在上面。
3. 阻断：用适当的阻断液封闭非特异性吸附位点，减少假阳性反应。
4. 孵育：加入特异性原抗体或特异性标记的抗原，使其与固相上的目标物质结合。
5. 清洗：通过洗涤的方式去除未结合的物质，减少背景干扰。
6. 标记：加入胶体金标记物，使其与特异性抗体或抗原结合。
7. 可视化：使用适当的显色底物，使得胶体金变成颜色或形成可见沉淀。
8. 停止反应：加入停止液或停止酶作用，使反应停止。
9. 分析：使用光学显微镜或分光光度计等设备对结果进行观察和分析。
酶联免疫胶体金法广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程领域，可用于检测病原微生物、肿瘤标记物、抗体、激素等生物分子的存在和定量分析。
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上？ – 酶免疫组织化学技术有何优点？
天津医科大学 李会强
实验三 酶联免疫试剂盒的研制
（设计性实验）
实验目的
• 熟悉酶联免疫试剂盒研制要点 ➢ 抗原纯化与抗体制备 ➢ 制备酶标记抗原（或抗体） ➢ 方法选择与设计 ➢ 筛选抗体（抗体匹配） ➢ 优化反应条件
实验相关知识简介
• 理论知识
酶联免疫吸附试验
• 本实验以双抗的基本 原理。
实验原理
• 双抗体夹心法
筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接 于固相载体制备酶标反应板；另一种标记过氧化物酶制备 酶标抗体。测定时，待测抗原分别与固相抗体和酶标抗体 结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物。
结果判断
• 绘制标准曲线
– 采用Logistic曲线拟合 – 剂量反应曲线
注意事项
• 准确使用微量加样器
• 所有试剂需平衡至室温 • 加入试剂或标本后需轻轻振荡 • 洗涤过程要标准化
实验讨论
• 问题:
– HBsAg定量分析的临床意义？
– 酶联免疫吸附试验的注意事项？ – 如何检测抗-HBsAg？
– 洗涤充分 – 湿盒中反应，防止干片
• 镜检时，注意区分特异和非特异
结果分析
采用高倍镜观察计数。将待检载破片置 普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色， 计数200个细胞，计算CD3+细胞的百分比。
实验讨论
• 思考题：
– 酶免疫组织化学技术的影响因素有哪些？ – 在酶免疫组织化学技术中，为何不直接将酶蛋白标记在抗体分子
实验材料
• ELISA试剂盒
预包被抗体酶标反应板 系列标准品抗原 酶标抗体（抗HBsAg-HRPO） 质控血清 显色底物 终止液 浓缩洗液
实验方法
• 制备酶标板
– 包被 – 封闭
• 实验准备
– 标本编号 – 所有试剂平衡至室温 – 稀释洗液
实验方法
• 操作步骤
– 加标准品或待测样本，37℃温浴30 min； – 洗涤3~5次，加酶标记抗体； – 37℃温浴30 min； – 洗涤3-5次，加显色液A和显色液B； – 室温15 min，再加入终止液; – 读取A450nm
A值
0.054 0.330 0.456 0.779 1.231 1.726 2.397
实施策略
• 两种方式拟合
– 四参数Logistic曲线拟合 – Logit-log 直线回归
总结与讨论
• 问题：
– 直线回归有几种常用方式？说明各自特点。 – 曲线拟合有几种常用方式？说明各自特点。 – 如何评价剂量反应曲线拟合方式？
• 二抗（桥联抗体）：
兔抗鼠Ig
实验方法
• 分离外周血单个核细胞
采用密度梯度离心法分离
• 制片 • 免疫反应
– 加一抗，37℃ 60 min – 洗涤玻片3次 – 同时加桥联抗体和PAP复合物， 37℃ 30 min – 洗涤玻片3次 – 加底物显色 – 镜检
注意事项
• 制片时，细胞均匀，密度适中 • 免疫反应过程中，
– 线性回归法
– logistic曲线拟合
实验相关知识简介
• 理论知识
– 基本变量 分析物浓度和信号强度
– 免疫分析的特殊性 待测物浓度影响反应速率 曲线拟合方式影响测定结果
实验要求
• 题目：
– 根据所给数据，绘制标准曲线或得出数学模型。
CEA浓度 （ng/ml）
0
10 20 50 100 200 400
• 本实验以辣根过氧化物-抗辣根过氧化物免疫组 化技术检测成熟CD3+ T细胞为例，对这一技术的 原理和操作流程进行验证。
实验原理
• 要点：
– 特异性抗体识别抗原 – PAP复合物的放大效应 – 桥联抗体连接作用
实验材料
• 一抗（识别抗体）：
抗CD3抗体
• PAP复合物：
过氧化物酶 抗-过氧化物酶
总结与讨论
• 问题：
– 研制酶联免疫试剂盒需做哪些准备工作？ – 如何根据待测物质特性选择合适反应类型？ – 双抗体夹心法如何进行抗体匹配实验？ – 理想剂量反应曲线应具备哪些条件？
天津医科大学 李会 强
实验四 定量酶免疫分析中标准曲线的
数学模型
（设计性实验）
实验目的
• 掌握常用标准曲线数学模型
酶联免疫检测技术
实验一 酶联免疫吸附试验
（验证性实验）
实验目的
• 验证酶联免疫吸附试验的基本原理
➢ 掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理 ➢ 掌握酶联免疫试剂盒的基本组成 ➢ 熟悉酶联免疫操作方法
实验内容简介
• 酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，
有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原 夹心）、间接法、竞争法、捕获法。
• 相关技术
– 蛋白纯化 – 酶标记化合物制备 – 酶标反应板制备
实验要求
• 题目：
假设需采用酶联免疫法测定某种肿瘤标志物，设计实 验如何制备酶联免疫试剂盒？
• 要求：
– 设计实验方案，绘制技术路线图 – 说明重要实验内容和实验方法
实施策略
• 重要环节：
– 纯化抗原和制备抗体 – 方法学选择与设计 – 抗原抗体选择 – 抗体匹配（双抗体夹心法） – 确定工作浓度 – 优化反应条件
天津医科大学 李会强
实验二 酶免疫组织化学染色技术
（验证性实验）
实验目的
• 验证酶免疫组织化学技术的原理
➢ 掌握PAP-酶免组化法的检测原理 ➢ 熟悉PAP-酶免组化技术操作要领
实验内容简介
• 酶免疫组织化学技术集抗原抗体结合的特异性、 酶免疫分析的敏感性和组织化学技术的直观性特 点为一体，常用于细胞鉴定、抗原定位、病理组 织观察等方面。