酶联免疫(ELISA)使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
ELISA实验中的这些坑你别跳
ELISA实验中的这些坑你别跳1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定⽅法，即酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 。
ELISA技术经过40多年的历史演变，⽬前仍然是⽤于定量检测⼤分⼦抗原常⽤的⼀种免疫测定技术。
⽆论你是实验室⼩⽩还是PhD⼤拿，只要是进⾏与免疫学相关的研究，⼀定离不开ELISA这门⼜⽼⼜实⽤的技术。
然⽽，说起ELISA实验，每个⼈都有⾃⼰不同的观点，有⼼酸也有喜悦。
为此，索莱宝列出部分ELISA实验中的⼩诀窍，告诉你：这些坑以后不必再跳了，让你成为师妹眼中的暧昧。
师妹师兄，ELISA实验最近⽼是问题不断，快帮我⽀⽀招吧。
什么问题？师兄师妹太多了，空⽩板；整板阳性或跳孔；标曲好样本值没结果等等。
不要着急，让我看看你的实验步骤和⽅案。
师兄师妹这个试剂盒购⾃国内***⼚家，按照说明书操作的啊。
我前⼏天⽤过索莱宝公司⽜MMP-9 ELISA试剂盒（Bovine MMP-9 ELISA Kit），结果还不错。
针对你实验过程中的问题，需要注意的有以下⼏点：1、样本：⾸先需要确认商品化试剂盒说明书中所述检测样本类型，⾎清、⾎浆和细胞上清还是组织裂解液等，样本禁⽤叠氮钠作防腐剂，避免反复冻融；2、样本稀释倍数：根据预实验的不同稀释梯度来确定正式实验样本的稀释倍数。
⼀般情况下，为了消除复杂基质中⼲扰成分的影响，⾄少进⾏2倍因⼦稀释；3、为了试验结果的准确性，尽量每个样本都做双孔重复；数据分析采⽤4-相参数曲线拟合（4-pI或sigmoidal曲线拟合）；4、如出现空⽩板的结果，请重复试验，确认每个步骤均正确操作，每步加样准确⽆误；5、如出现整板阳或跳孔的结果，请重复试验，避免每个步骤可能引起的污染，确保正确⽆误的操作，特别是洗涤过程；6、如果标曲好但是样本值没结果，说明试剂盒和操作均没有问题，可能原因：⼀是样本中⽬标分析物的含量太低，低于试剂盒的检测限，建议可选⽤更⾼灵敏度的产品或其他的⽅法检测；⼆是实验处理的⽅案需要调整优化；三是实验处理对样本中靶标物的含量⽆影响。
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。
常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。
elisa操作过程中的注意事项
elisa操作过程中的注意事项Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，用于检测抗体或抗原的存在和浓度水平。
在进行Elisa实验时，有一些注意事项需要遵循，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将介绍Elisa操作过程中的注意事项，帮助您顺利完成实验。
实验前的准备工作非常重要。
确保所有试剂和设备都按照指示进行保存和储存，并检查它们的有效期。
此外，实验室应保持清洁整洁，并遵循良好的实验室操作规范，如佩戴实验手套和实验室外套。
在进行Elisa实验之前，需要准备样品和标准曲线。
样品的选取和处理要仔细进行，确保样品的纯度和稳定性。
如果需要进行稀释，应根据实验要求选择适当的稀释液，并按照比例进行稀释。
接下来，选择合适的酶标板进行实验。
酶标板的材质和孔数应根据实验要求进行选择。
在将样品和标准品加入酶标板孔中之前，应先进行预洗步骤。
预洗可以去除杂质和非特异性结合，从而提高实验的灵敏度和特异性。
在加入样品和标准品之前，要确保将酶标板孔标记清楚，并按照实验设计进行分组。
此外，为了避免交叉污染，每个孔要使用新的吸头或移液器头。
在加样过程中，要保持操作的准确性和稳定性，避免溅出或误操作。
加样完成后，将酶标板密封，并进行孵育步骤。
孵育温度和时间应根据实验要求进行调整。
在孵育过程中，要避免震动或移动酶标板，以免干扰反应。
此外，为了保持温度的稳定性，可以将酶标板放置在恒温箱中进行孵育。
孵育完成后，需要进行洗涤步骤。
洗涤的目的是去除非特异性结合物质，从而减少背景干扰。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数要根据实验要求进行调整。
洗涤过程中，要注意不要将吸头或移液器头碰到酶标板底部，以免损坏酶标板。
洗涤完成后，需要加入检测抗体或底物。
在加入检测抗体之前，要先进行适当的稀释，并确保检测抗体的纯度和活性。
加入检测抗体后，要进行二次孵育和洗涤步骤，以确保特异性结合和去除非特异性结合。
进行底物反应和读板步骤。
底物的选择要根据实验要求进行，常见的底物有TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二氨基联苯基三甲基苯并噻唑啉）和ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）。
ELISA试验中常出现的问题及解决方法
ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。
这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。
一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。
试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。
2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。
3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。
温育时间不足，温度过低都会影响显色。
4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。
5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。
6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。
二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。
1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。
2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。
3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。
重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。
ELISA试剂盒常见注意事项
ELISA试剂盒常见注意事项LISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。
但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。
2．试剂盒平衡3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4．加样5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。
ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。
zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。
因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。
6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
（2）温育温度的选择。 在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温 度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一 种则为43℃下45分钟。从免疫测定抗原抗体反 应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时 间最为完全，产物最稳定。如2－8℃下反应24 小时。较高的反应温度，由于分子运动的加快， 反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳 性样本测定没有问题，但对分子含量少的弱阳 性样本则有漏检的可能。因此，如须选择反应 条件，建议在临床ELISA测定中尽量使用较低 温度较长反应时间的条件。
而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着 水面，可使温度迅速平衡。让反应板飘浮在水面 上。就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可 提高测定的重复性。
洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着实 验的成败。ELISA就是靠洗涤清除残留在板孔中没 能与固相抗体（抗原）结合的物质，以及在反应过 程中非特异性的吸附于固相载体的干扰物质，以保 证ELISA测定的特异性。 洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯 载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂 既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水 溶液状态，从而脱离固相载体。 在实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式， 即手工和洗板机洗板。为保证微孔板的均一性使结 果准确可靠，最好选用洗板机洗板。若手工洗板， 要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要互相流动。流 水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤 效果较好。
3 加样本及反应试剂
4 温育
温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个 因素。 ELISA属于固相免疫测定，要使液相中的抗原或抗 体与固相上的特异性抗体或抗原完全结合，必须在 一定温度条件下反应一定的时间。一般温育所需时 间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。 最为常用的温度有37℃和室温(20－25℃)，其次是 43℃和2－8℃，目前国内ELISA商品试剂盒的反应 温育时间通常为37℃30－60分钟。 关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：
酶联免疫吸附实验常见问题分析
酶联免疫吸附实验常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。
单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。
对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。
目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。
因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。
Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。
移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确使用和维护。
关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。
Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。
尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。
通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。
Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。
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酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
1、仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；
◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；
◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择
◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简
单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项
3.1 均质
组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。
蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。
水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振荡提取
将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。
3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。
3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。
②再加入适量的提取剂，重新振荡。
注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。
3.4 浓缩
由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。
即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。
浓缩方式：
氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。
注意：
3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。
3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。
3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。
3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。
3.5 净化
经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似
的杂质。
将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。
在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。
比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。
实例：
A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。
注意：
(a)二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在下层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适量的下层吹干。
(b)在用加样器吸取下层的有机相时，正常操作往往取量不准确，此时最好用带有刻度，且刻度较准确的玻璃管来定量。
(c)上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控制取样的准确性。
(d)在振荡过程中要注意安全。
二氯甲烷在振荡的过程中，如果离心管密封性不是很好，往往容易爆开；在进行振荡时，不要让离心管口对准自己或者其他人，避免溅到自己或者他人身上。
(e)试剂盒在使用前充分回温很必要，如回温不充分该项目曲线受影响较明显。
B、硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题
硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-内酰脲(AHD)在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评，其中需要注意以下几个问题。
代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。
需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均匀后，其pH应在1-3之间，否则不利用水解代谢物。
在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。
由于部分样本的缓冲能力不同，所以需对其pH进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也容易出现假阳性。
添加回收的几种误区：
呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤：
水解-----衍生化-----提取
(1)采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收。
如德国拜发和我公司AOZ试剂盒中的第6个标准点
4.05ppb，AMOZ试剂盒中的第6个标准点8.1ppb。
因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失去了实际参考价值。
（2）完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收。
因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期，会存在潜在的不稳定因素，而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点，不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，因此也有一定的局限性。
最好的评价方案：采用经LC-MS-MS确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评价。
这也是实验室所出数据可信度最具说服力的关键点。
4、酶标分析过程中的注意事项
样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。
它要求加样的准确性和洗板的一致性。
在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。
4.1常见加样方式
A、吸一打二
B、吸二打一
在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：
a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡
b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。
在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：
A、加样的过程中漏加或者重加；
B、加样的过程中忘记更换吸头；
C、样本的重加或者漏加；
D、忘记记录样本的加样顺序。
4.2常见的洗板方式
A、洗板机洗板；
B、多道孔加样器洗板；
C、多孔吸头洗板；
在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。
4.3 甩板
快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。
4.4拍板
轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。
4.5 显色
值得注意的是，并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。
防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测灵敏度（OD值在2.5-3.0之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。