胶体金法与酶联免疫法相结合快速检测克伦特罗
应用胶体金免疫层析技术 更好地进行食品快速检测
食品检测FOOD INSPECTION食品安全问题一直是国家和社会关注的重点问题，因此，相关部门一定要高度重视食品安全检测，并注重新技术的引入，比如胶体金免疫层析技术。
胶体金免疫层析技术可以有效发挥食品检测的作用，更好地保障食品安全，提高人们的生活质量，促进社会的稳定发展。
一、胶体金及免疫层析技术的含义1.胶体金技术。
胶体金技术是指氯金酸在某种环境下的一种变化反应而形成的胶体溶液。
其反应过程首先要用的是还原剂，通常有白磷和柠檬酸钠等，在其作用下将氯金酸按相关要求聚合成固定大小的金颗粒，然后再由静电作用将其凝聚成稳定的胶体溶液。
胶体状态下的金颗粒具有高电子密度的特性，其密度一般能达到107个/mm2，呈圆形的斑点，颜色一般为粉红色，其大小肉眼刚好可见，在检测中常用作一种标记物，对实验结果的影响十分重大。
2.免疫层析技术。
免疫层析技术是一种免疫分析技术，主要是根据抗原和抗体的反应来进行检测。
通常包括两大类，一类是非竞争性免疫层析，一类是竞争性免疫层析。
非竞争性免疫层析技术主要针对一些大分子蛋白质的检测。
首先，将采用胶体金标记后的样品与等待检测抗原中的特异性抗体进行结合，这两类物质结合后会出现沉淀现象，此时需要注意将其沉积物放到结合区域中。
其次，将待检测的样品材料放到样品区位置，再利用毛细管将样品与结合区进行完全融合，其中，带有胶体金标记的样品材料会由于受到张力的作用而不断地向前移动。
此时，样品中已经存在的抗原物质便会自动与带有胶体金标记的样品相互结合，形成一种结合体物质。
紧接着，样品溶液会进行固相化，并在通过固相化后的第一层防线时将含有结合体物质抗体材料进行捕获，然后形成新的结合体复合物材料。
那些没有结合体材料的物质不会被捕获，它们会继续向前移动，然后那些结合体在通过下一道防线时会与另一种抗体结合，形成第三种结合体复合材料。
竞争性免疫层析技术主要针对一些单一抗原的小分子抗原适用，比如兽药残留的检测等。
酶联免疫法和胶体金法在艾滋病抗体检测中的应用
酶联免疫法和胶体金法在艾滋病抗体检测中的应用【摘要】目的研究比较艾滋病抗体检测中采用酶联免疫法和胶体金法的检测价值。
方法将2020年1月——2021年12月本疾控中心收治的75例初筛阳性待复查的血清样本作为主要研究对象，所有患者的血清样本均采取酶联免疫法和胶体金法两种方法进行检测，比较两种检测方法的检测阳性率，同时对比两种检测方法的操作时间和血清用量。
结果酶联免疫法的艾滋病抗体阳性检出率（96.0%）与胶体金法（93.33%）相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；酶联免疫法的操作时间[(84.53±5.56)min]长于胶体金法[(19.79±2.33)min]，差异有统计学意义（P＜0.05）；两种检测方法的血清用量[(60.28±4.18)μL、(60.17±4.39)μL]相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论在艾滋病抗体检测中，酶联免疫法和胶体金法均有较高的阳性检出率，但相比较而言，酶联免疫法的操作时间更长、操作步骤更繁琐，在实际工作中可根据现实情况选择更快速、准确的检测方法。
【关键词】酶联免疫法；胶体金法；艾滋病抗体；检测价值艾滋病是临床上较为常见的传染性疾病，是由人类免疫缺陷病毒感染所致的疾病，病毒会反复攻击患者的免疫系统，从而导致患者最终失去机体免疫功能，容易感染多种疾病，也增加了恶性肿瘤的发生风险[1]。
艾滋病病毒在人体中的潜伏期相对较长，最长可达到9年，而在疾病潜伏期，病毒也具有高度传染性，会造成更加严重的危害[2]。
因此，临床上要及时检出艾滋病抗体，对患者的病情进行确诊，并对其进行及早、针对性的治疗，一方面减轻患者的病症，延长患者的生存时间，另一方面避免传染给更多的健康人[3]。
胶体金法、酶联免疫法是用于艾滋病抗体检测的常用检验方法，此次研究将75例艾滋病抗体初筛阳性的患者血清样本作为主要研究对象，旨在进一步对比两种不同检验方法的检测价值，详述如下：1资料与方法1.1一般资料选取的研究对象是疾控中心在2020年1月——2021年12月收治的75例初筛阳性待复查患者的血清样本，75例患者中包括男49例，女26例；年龄最大者58岁，最小者27岁，平均年龄是（39.96±3.24）岁。
克伦特罗ELISA快速检测方法
克伦特罗ELISA快速检测方法克伦特罗属于-兴奋剂类药物，可以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长。
8.3 当板间差异性大时，可能原因是板与板之间孵育时间相差太大，板与板之间洗涤不一致，移液枪使用不当，温度不同等。
克伦特罗属于-兴奋剂类药物，可以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物生长。
目前由于多起克伦特罗中毒事件且出现了死亡案例，因此被禁止使用。
克伦特罗ELISA快速检测试剂盒与经典色谱法相比，具有操作过程简单、样品处理快捷，可同时分析多个样品，分析时间短、成本低、灵敏度高且对环境污染小等优点。
1 原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
2 试样的准备2.1 对于尿样可直接用于检测，或者样品比较浑浊时，可适当离心。
当尿样冷冻时，应将尿样回温再测。
2.2 饲料样品要按照说明书的处理步骤进行。
当然，为保证样品充分被提取，可适当延长涡旋时间、离心时间及离心转数。
3 试剂的准备3.1 不同批次的试剂盒不能混用，因为抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。
3.2 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。
ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的应为新鲜的和高质量的。
自配的缓冲液应用pH计测量较正。
3.3 从冰箱中取出的实验用试剂应待温度与室温平衡后使用。
试剂盒中本次实验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
3.4 检测过程中应尽量保持室温20~25℃，避免在通风口操作，温度过低、过热或蒸发都会影响检测数据的准确性。
同样不应再阳光直射下实验，防止过热或蒸发带来影响。
4 加样4.1 在ELISA中一般有4次加样步聚，即加标本或样品、酶结合物、底物、终止液。
加样时应将所加物加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡，当有气泡时可用干净的枪头小心刺破。
4.2 加标准及样品时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中，每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。
四种常见瘦肉精检测方法比较分析
四种常见瘦肉精检测方法比较分析作者：裴小英来源：《国外畜牧学·猪与禽》2014年第10期摘要：本文对“瘦肉精”常见四种检测方法进行了阐述，对比分析其应用优缺点，为“瘦肉精”检测及监管提供借鉴，以期更好的维护公共卫生安全。
关键词：瘦肉精；胶体金免疫层析法；酶联免疫吸附法；高效液相色谱法；色谱质谱串联法中图分类号：S851 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）10-0065-01“瘦肉精”是一类药物的统称，主要是肾上腺类、β激动剂、β-兴奋剂[1]。
我国所说的“瘦肉精”是指克伦特罗，对大多数动物具有促生长作用，增加动物的瘦肉量，提高饲料转化率，使动物及其肉品提早上市而降低成本、增加利润。
据报道，使用“瘦肉精”的生猪平均每100 kg可多获利40～60元。
但人食用了含有较高残留量的“瘦肉精”动物产品后，会出现心跳加快、头晕、心悸、呼吸困难、肌肉震颤、头痛等中毒症状。
同时“瘦肉精”还可通过胎盘屏障进入胎儿体内产生蓄积，从而对子代产生严重的危害[2]。
“瘦肉精”残留对人体危害的典型案例就是西班牙克伦特罗牛肝中毒事件。
我国政府早在1997年《关于严禁非法使用兽药的通知》（农牧发【1997】3号）文件中明确禁止“瘦肉精”在饲料和畜牧生产中使用。
然而，近几年国内屡屡出现非法使用“瘦肉精”饲喂食猪、羊、牛等牲畜事件，严重危害了社会公共卫生安全。
在对于畜产品质量安全监控过程中，检测则成为最重要的环节之一，目前常用“瘦肉精”检测方法主要有四种，即胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法及色谱质谱串联法。
这四种检测方法在实际应用中各有其优缺点，本文结合“瘦肉精”监管工作实际，予以对比分析。
1 胶体金免疫层析法（GICT）胶体金免疫层析法是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术[3]。
检测卡含有被事先固定于NC膜检测区（T）的抗原和控制区（C）Ⅱ抗以及固定于结合垫上的金标抗体。
酶联免疫吸附法（ELISA）检测猪肉中盐酸克伦特罗
BB 0×100%百分吸光度值（%）=酶联免疫吸附法（ELISA ）检测猪肉中盐酸克伦特罗薛金英（山东省诸城市畜牧兽医管理局山东诸城262200）盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精）为一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。
当其应用量达到治疗量的5～10倍时，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此俗称为“瘦肉精”。
在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种和生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质，同时也造成食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。
当人们食用盐酸克伦特罗残留的产品后会出现一系列的中毒症状。
动物源性食品药物残留问题逐渐引起人们的重视。
本法用于定量、定性检测猪肉中盐酸克伦特罗的残留。
1试验原理采用间接竞争ELISA 法，在微孔板上包被抗盐酸克伦特罗检测抗原，样品中的盐酸克伦特罗将和酶标板上的盐酸克伦特罗检测抗原竞争结合盐酸克伦特罗抗体，盐酸克伦特罗检测抗原结合的盐酸克伦特罗抗体再与同时加入的酶标二抗结合，洗涤后，用TMB 底物系统显色，微孔板吸光值与样品中盐酸克伦特罗含量成负相关，与标准曲线比较再乘以浓度比值即可得出盐酸克伦特罗在样品的实际含量。
2试验方法（稀释倍数为4倍）称取1.0g （±0.05g ）均质样品于50mL 聚苯乙烯离心管中，加入1mL 0.1M 盐酸，再加入2mL 提取工作液，充分振荡混匀5min ，4000rpm （20～25℃）离心10min 。
取1mL 上清液加入约25μL 1M 氢氧化钠调节pH 至6.5～7.5之间，充分振荡混匀，取50μL 用于分析。
如果上层中存在白色脂肪层，取样时应避开。
试剂准备：将10×浓缩洗涤液和蒸馏水（或去离子水）按1∶9充分混匀，即为1×洗涤液。
编号：将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。
胶体金免疫层析法定量检测猪肉中克伦特罗
胶体金免疫层析法定量检测猪肉中克伦特罗李超辉;陈雪岚;郭亮;许恒毅;刘文娟;赖卫华;熊勇华【摘要】建立了基于T/C比值的胶体金免疫层析法快速定量检测猪肉中克伦特罗残留的新方法.胶体金免疫层析试纸条的定量检测线性范围为0.1～1.5 ng/g,检测猪肉中克伦特罗残留的最低检测灵敏度为0.19 ng/g.比较了5种猪肉组织样本中克伦特罗的简便提取方法,其中采用0.02 mol/L,含2.8％ NaCl的HCl溶液抽提猪肉样品2次的提取方案,克伦特罗的平均回收率达到76.7％,变异系数为7.4％.实际样本加标回收实验显示,加标量为0.5、1.0、2.0及3.0 ng/g时,胶体金试纸条检测回收率分别为(60.4±12.8)％,(70.24±4.2)％,(75.9±4.9)％,(71.1±5.0)％.与传统ELISA方法比对,结果显示2种方法具有较好的相关性(R2=0.9136).以上实验结果证实,基于T/C比值法的胶体金免疫层析试纸条可用于猪肉组织样品中克伦特罗的快速及定量检测.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2013(039)004【总页数】6页(P167-172)【关键词】克伦特罗;胶体金试纸条;猪肉【作者】李超辉;陈雪岚;郭亮;许恒毅;刘文娟;赖卫华;熊勇华【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌,330047;江西师范大学,江西南昌,3110323;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌,330047;江西中德生物工程有限公司,江西南昌,330029;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌,330047【正文语种】中文克伦特罗(clenbuterol，CLE)是一种β-肾上腺素受体激动剂［1］，作为饲料添加剂用于畜牧生产，能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉生长，提高瘦肉率，俗称“瘦肉精”［2-3］。
克伦特罗酶免疫定量检测试剂盒 说明书
ELISA kit for quantitative detection of Clenbuterol概述：克伦特罗(Clenbuterol)属于一类β-兴奋剂，具有改进脂肪型动物体内肉与脂肪的比例的作用，亦可促进动物生长。
但同时，此药物还会使非横纹肌松弛，人体摄入后可引起心跳、心率不正常等副反应，甚至可导致心脏病。
因此在我国，克伦特罗在畜牧业上的使用是被严格禁止的。
本试剂盒利用竞争酶联免疫法对生物样品中的克伦特罗进行定量分析。
适用于动物尿液、血清、内脏等物质中克伦特罗的快速检测。
由于ELISA法的高通量与简便快速，适合大量样本的定量筛查，自样本加入至结果读出，不超过60分钟，检测灵敏度为0.1ppb。
一、简要原理试剂盒所提供的微孔板上包被有抗体，然后将校准品或样本中的克伦特罗与酶标记的克伦特罗加入微孔中后，两者可竞争结合克伦特罗抗体，洗去未结合的酶标记克伦特罗。
加入底物后，在酶作用下，底物溶液会显蓝色，加入终止剂后，溶液由蓝转为金黄色。
在450nm波长光下测吸光度，吸光度高低与校准品或样品中克伦特罗的含量呈反比，根据校准品的读数作出校准曲线，并利用校准曲线计算出样品中克伦特罗的含量。
二、试剂盒组成1.酶标96孔易折板(抗体已包被)……………………………………………………………………… 96孔2.克伦特罗校准品(0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb)…………………………… 1 套3.11×浓缩酶标记物…………………………………………………………………………1瓶4.底物溶液…………………………………………………………………………1瓶5.酶标稀释液………………………………………………………………………1瓶6.50×浓缩洗涤液……………………………………………………………………1瓶7.终止剂……………………………………………………………………………1瓶8.其他（说明书、自封袋、封板膜）…………………………………………………………………1套2-8℃贮存，有效期一年三、实验需要但试剂盒不提供的试剂和仪器1.试剂…………50mM盐酸溶液…………氯化钠…………50mM PH7.0 PBS (配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml 蒸馏水中)…………2M 氢氧化钠溶液…………异丙醇和乙酸乙酯2.仪器…………微孔板酶标仪…………涡旋振荡器或超声波粉碎仪或摇床…………离心机及离心管…………20μl、200μl、1ml移液器…………氮吹仪或旋转蒸发仪ELISA kit for quantitative detection of Clenbuterol四、待测样品处理方法1.尿液新鲜尿液可直接测定，如尿液混浊，则离心取上清进行检测。
(KJ201706)动物源性食品中克伦特罗 莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法
附件6动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201706）1范围本方法规定了动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于猪肉、牛肉等动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速测定。
2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。
样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇进行定性判定。
3试剂与材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
3.1试剂3.1.1甲醇：色谱纯。
3.1.2氢氧化钠。
3.1.3磷酸二氢钾。
3.1.4磷酸氢二钠。
3.1.5盐酸。
3.1.6氯化钠。
3.1.7氯化钾。
3.1.8三氮化钠。
3.1.9乙二胺四乙酸二钠。
3.1.10三羟甲基氨基甲烷，即Tris。
3.1.11乙酸乙酯。
3.1.12磷酸二氢钠。
3.1.13氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.2）4g，用水溶解并稀释至100mL。
3.1.14缓冲液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）0.3g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.5g，溶于约800mL水中，充分混匀后用盐酸（3.1.5）或氢氧化钠溶液（3.1.13）调节pH至7.4，用水稀释至1000mL，混匀。
4℃保存，有效期三个月。
3.1.15展开液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）2g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.44g，氯化钠（3.1.6）8g，氯化钾（3.1.7）0.2g，三氮化钠（3.1.8）0.5g，乙二胺四乙酸二钠（3.1.9）1.0g溶于约500mL水中，充分混匀后用水稀释至1000mL。
3.1.16Tris缓冲液（pH9.0，1mol/L）：称取Tris（3.1.10）121.14g，溶于约700mL水中，充分混匀后加入盐酸（3.1.5）调试pH至9.0后用水定容至1000mL。
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胶体金法与酶联免疫法相结合快速检测克伦特罗苏存举,陈福生3,高志贤3①,苗颂②,刘楠①,冯屹(华中农业大学食品科技学院,武汉430070) 摘要:目的研究胶体金免疫层析法(GIC A)与酶联免疫吸附法(E LIS A)相结合,以建立对饲养、屠宰、流通各环节的畜尿克伦特罗(Clenbutero1,C L)定性和定量检测的方法。
方法用柠檬酸三钠还原氯金酸,制备20nm粒径的胶体金,胶体金标记单抗后喷涂到玻璃纤维膜上,特异性抗原(C L2BS A)以线状包被在硝酸纤维素膜上,制成快速检测试纸条。
用E LIS A进行定量。
结果对G C2MS不确定的36份阴性样品和24份阳性样品用GIC A方法检测,其阴性符合率为97%,阳性符合率为96%。
同样样品用E LIS A方法检测,其符合率为100%。
最低检测限为5.0ng/m L;用GIC A法只需在试纸条上滴加4～5滴样液5～10min就可出结果;在2个月的随机抽查中,试纸条的检测结果没有变化。
结论本方法准确性高、稳定性好,操作过程简单,适合于作现场大规模、高通量检测。
因此本方法具有广泛的应用及推广价值。
关键词: 胶体金; 克伦特罗; 酶联免疫吸附法 中图分类号:R155.5 文献标识码:A 文章编号:1001-5248(2008)03-0176-04 克伦特罗(Clenbutero1,C L)俗称“瘦肉精”,是β2肾2上腺受体激动剂。
在家畜养殖中加入C L可以提高瘦肉率或者加速动物的生长。
C L作为药物使用时可以治疗哮喘等疾病,但是如果用作家畜生长调节剂,其剂量通常是治疗疾病剂量的5～10倍,这样就可能残留于食品中而引起人体的不良反应,主要包括心跳过快和四肢肌肉颤动等中枢神经中毒后的失控症状,甚至导致死亡〔1〕。
目前已有多种方法用于对C L的残留分析,主要包括酶联免疫检测法(E LIS A)、高效液相色谱法(HP LC)、气相色谱2质谱联用法(G C2MS)、液相色谱2质谱联用法(LC2MS)等,主要是依靠特殊仪器进行分析,不能适应市场监督需要快速、简便、价廉的要求。
而E LIS A分析法操作简便、检测快捷、灵敏度高、特异性强,适用基层日常应用〔2〕。
胶体金免疫层析法(GIC A)解决了以往在现场不能进行快速和定性检测的难题。
因此,基金项目:国家科技支撑计划(2006BAK02A09)天津市科技攻关基金项目课题(N o.06VFG ZSH02200)作者简介:苏存举(1981-),男,硕士研究生。
从事食品安全快速检测研究。
3通讯作者①军事医学科学院卫生学环境医学研究所②山东大学将E LIS A和GIC A相结合应用于C L筛选检测已成为各地开展C L检测工作的主要技术手段。
1 材料与方法1.1 材料 氯金酸为上海化学试剂厂产品;克伦特罗标准品为Sigma公司产品;克伦特罗单克隆抗体为浙江台州金芯生物工程公司产品;硝酸纤维膜(NC)、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC背板均为美国Mill2 pore公司产品;克伦特罗检测试剂盒为江苏微生物研究所产品;其他试剂为国产分析纯。
1.2 仪器 紫外可见光分光光度计,Du2530型, Beckman公司;透射电镜,H27500型,日本HIT ACHI 公司;原子力显微镜,SPM29500型,日本岛津公司;磁力恒温搅拌器,79.3型,上海市曹行无线电元件厂;点膜机,Bio2Dot公司;普通离心机,TG L21613型,上海安亭科学仪器公司;纯水制备装置,AS D型,军事医学科学院卫生装备研究所。
1.3 方法1.3.1 胶体金的制备 按照文献〔324〕采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金颗粒〔5〕。
取0.01%氯金酸水溶液100m L,用恒温电磁搅拌器加热至沸腾,一次性加入l%柠檬酸三钠水溶液2.52m L,再加热20min,至溶液呈酒红色,室温冷却,4℃保存。
用Beckman Du2530分光光度计对胶体金在可见光范围400～600nm进行扫描,发现其主峰宽度较小,表明制备的胶体金颗粒较均匀(λmax为520nm)。
1.3.2 抗体的标记与纯化 取20nm胶体金的溶液10m L,用0.1m ol/L的K2C O3溶液将pH调至9.0左右,4000r/min离心20min,弃沉淀。
将适量单抗溶液逐滴加人胶体金溶液,搅拌后静置30min,再逐滴加入1.1m L经微孔滤膜过滤的10%BS A,搅拌15min,4℃过夜。
标记后的抗体溶液于4000r/min 离心20min,弃沉淀,然后10000r/min离心1h,弃上清,沉淀用l m L胶体金保存液重悬,分装后4℃保存。
1.3.3 结合抗原的制备 采用重氮化法:称取1mgC L,加入200μL1m ol/L HC1和500μL蒸馏水,连续3次加入0.2m ol/L NaNO220μL,间隔为20s。
将混合液置于4℃下轻微搅拌1h,加入(NH4)2S O4终止反应(30μL,1.5mg)。
将重氮化的C L缓慢滴入到BS A溶液(4.5mg BS A溶于0.5m L0.1m ol/L磷酸盐缓冲液,pH值为8)中,滴加中不断用1m ol/L NaOH溶液调节pH值使其维持恒定。
将反应生成的橙黄色反应液置于4℃下轻微搅拌过夜。
将偶联反应后的反应液移入透析袋中,置于0.01m ol/L磷酸盐缓冲透析液(pH值为7.4,0.15m ol/L NaC1)于4℃充分透析。
将透析后的偶联产物C L2BS A分装、冷冻储存备用,避免反复冻融。
C L的最大吸收波长为296nm,BS A的最大吸收波长为278nm,偶联蛋白液的最大吸波长在C L和BS A标准液的最大吸收波长之间,为280.5nm。
1.3.4 GIC A试纸条的制作 测试条由玻璃纤维膜,硝酸纤维膜(NC膜),加样纸,吸收纸4部分组成。
将玻璃纤维膜裁成6mm的细条,然后放入含1%BS A,1%T ween220的P BS液中浸泡30min,37℃烘干,最后将胶体金探针灌注已处理好的玻璃纤维膜上,真空干燥备用。
在NC膜上用点膜机将C L2 BS A和羊抗兔IgG喷成2条线,经真空干燥后,采用1%BS A、0.01m ol/L P BS封闭2h,以0.01m ol/L P BS洗涤,再真空干燥。
30mm吸水纸、25mm NC 膜、6mm玻璃纤维膜、15mm加样纸,由顶部依次粘于PVC板上,裁成细条备用。
2 结果2.1 制备所得胶体金颗粒的特征 采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒均一,颗粒的平均直径为(20±3)nm。
均一的颗粒为胶体金探针的制备打下良好的基础,并且对试纸条检测线产生可目测的强烈信号至关重要。
2.2 制备胶体金探针的最优化条件 胶体金探针的制备主要是通过范德华力和相互之间的疏水作用力的介导作用使得胶体金吸附在抗体表面。
抗体用量是影响标记结果的一个重要因素,用量较标记所用量低时,会产生游离的胶体金,而高于所要求的含量则会影响到最终检测的灵敏度。
抗体最佳用量可以采用Mey氏稳定化试验测定。
用0.1m ol/L的K2C O3将胶体金溶液pH调至8.0左右然后取试管8支,分别加入1.0m L胶体金溶液。
将抗体稀释后,各取等体积不同浓度稀释液分别加入上述试管中,另设一不加抗体的对照管。
放置10min,在各管中加入0.1m L10%NaCl,混匀后静置2h。
观察各管中胶体金溶液变化,未加抗体及加入抗体不足的溶液颜色由红变蓝,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持不变。
标记蛋白量即为最低稳定胶体金溶液不变色的蛋白量的基础上再加20%。
本试验的抗体量在15μg/m L时溶液则保持不变,所以本实验最佳标记蛋白量为18μg/m L。
2.3 GIC A试纸条的初步检测 将C L标准溶液滴加45滴在样品垫上,静置5～10min后观察NC膜的显色情况。
阴性结果分别在控制线(C)位置和检测线(T)位置呈现2条红色条带(图12A),阳性结果只在控制线(C)位置呈现1条红色条带(图12B)。
图1 阴性(12A)和阳性(12B)结果图2.4 试纸条检测限的确定 试纸条检测C L标准溶液浓度在5.0ng/m L及以上时,检测线位置无红色条带出现,结果为阳性;而C L标准溶液浓度分别为0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5m ol/L 时,在检测线位置上有明显的红色条带出现,结果视为阴性。
通过以上数据表明该试纸条的最低检测限为5.0ng/m L 。
2.5 稳定性试验 试纸条放在4℃、室温20～25℃条件下密封保存,每隔5d 随机抽取5根试纸条进行检测,分别用4.5ng/m L 和5.0ng/m L C L 标准溶液检测,共检测12次,总共60根试纸条。
所有试纸条对4.5ng/m L C L 标准溶液的检测结果都为阴性,试纸条出现2条红色条带;而对5.0ng/m L C L 标准溶液检测结果都为阳性,试纸条只出现1条红色条带,检测结果说明试纸条重复性较好,4℃、室温20～25℃条件下2个多月的时间密封保存对试纸条的灵敏度无明显影响,一致性好。
2.6 胶体金的鉴定 所制备的胶体金溶液pH 为8.0;在紫外分光光度计上扫描,λ=520nm ,OD 520=1.031;透射电镜(TE M )下观察无菱形、三角形金颗粒(图2),测得平均粒径为20nm 。
2.7 重复性试验 从3个批次的试纸条中随机抽取5根,分别对5.0ng/m L 和4.5ng/m L C L 标准溶液进行检测。
5根试纸条对5.0ng/m LC L 标准溶液检测结果都为阳性结果,对4.5ng/m L 标准液检测结果都为阴性,结果说明不同批次的试纸条重复性较好。
2.8 GIC A 的准确性试验 对G C 2MS 确定的36份阴性样品和24份阳性样品用GIC A 方法检测,其阴性符合率为97%,阳性符合率为96%。
高于市售试纸条的符合率(95%),同样的样品用E LIS A 检测其样品符合率为100%。
2.9 E LIS A 的标准曲线 E LIS A 方法对C L 的检测可以产生很好的线性关系,对C L 可以方便、快速、准确的定量。
在基层日常生活中可以通过E LIS A 和GIC A 相结合的方法对C L 残留开展大规模、高通量的检测。
图2 胶体金颗粒透射电镜图3 讨论 本试验采用了适合小分子检测的竞争结合法,其原理是将特异性的物抗原(C L 2BS A )固定在NC 膜上检测线处,金标抗体吸附在结合垫上,待测样品加到样品垫并通过毛细作用向上层析,溶解金标抗体并一同向上泳动。
当其到达固定抗原的检测线位置时,样品中如果含有药物,固定的抗原将和样品中的药物共同竞争金标抗体上有限的抗原结合位点,样品中药物的含量越高,检测线处固定的抗原与金标抗体结合的越少。