酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
固相酶联免疫斑点技术
固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。
想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。
这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。
很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。
固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。
这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。
就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。
它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。
你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。
哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。
你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。
也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。
就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。
这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。
简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。
再说说检测的过程。
想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。
每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。
如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。
检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。
哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。
医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。
比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。
这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。
谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。
没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。
它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。
快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。
想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值目的探讨酶联免疫斑点法（ELISPOT）在涂阴肺结核患者中的诊断价值。
方法将2016年5月～2017年3月期间我院收治的346例肺结核患者，其中A 组涂阴肺结核患者（180例）、B组为非涂阴肺结核患者（166例），两组均采用ELISPOT检测肺泡灌洗液、外周血液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，之后绘制出两组患者的工作特征曲线（ROC），并计算出曲线下的面积；将A组肺泡灌洗液做结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌，比较诊断价值与阳性率。
结果A组、B组患者的血液ELISPOT 检测的特异性分别为84.44%（152/180）与90.96%（151/166）；肺泡灌洗液ELISPOT 检测的特异性分别为92.78%（167/180）与94.58%（157/166）（P>0.05）；A组、B组患者的肺泡灌洗液ELISPOT检测的ROC曲线下面积分别为0.938与0.869，差异有统计学意义（P＜0.05）；涂阴肺结核的肺泡灌洗液ELISPOT 检测的阳性率为91.67%（165/180），而结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌的阳性率分别为34.44%（62/180）、15.56%（28/180）、31.67%（57/180）（P＜0.05）。
结论在涂阴肺结核患者的临床诊断中，应用ELISPOT 检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，检测效率高、敏感性与特异性强，可作为涂阴肺结核的诊断方法予以推广。
[Abstract] Objective To discuss the value of ELISPOT in Diagnosis of Smear negative pulmonary tuberculosis. Methods 346 cases with TB from May 1 2016 to March 2017 year in our hospital were selected as objects.The group A was smear negative pulmonary tuberculosis patients （180 cases），and the group B was non smear negative pulmonary tuberculosis patients （166 cases）.Bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood IFN-y T levels of two groups were detected by ELISPOT.The curve of the two groups （ROC）was drew，and AUC was calculated.Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture in bronchoalveolar lavage fluid of group A were done.Diagnostic value and positive rate were compared. Results Specificities of ELISPOT for blood in group A and group B were 84.44%（152/180）and 90.96%（151/166）；Specificities of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 92.78%（167/180）and 94.58%（157/166）（P>0.05）.AUC of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 0.938與0.869 （P＜0.05）；The positive rate of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in smear negative pulmonary tuberculosis was 91.67%（165/180），and the positive rate of Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture were 34.44%（62/180），15.56%（28/180），31.67%（57/180）（P＜0.05）. Conclusion In the clinical diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis patients，application of ELISPOT detection of IFN-y T levels in bronchoalveolar lavage fluid is of high detection efficiency，and high sensitivity and specificity，which can be used as a method for diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis to be promoted.[Key words] Smear negative pulmonary tuberculosis；Enzyme-linked immunosorbent assay；Bronchoalveolar lavage fluid；Diagnostic value我院应用该技术来检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，并与其它检测方法进行了比较，旨在探讨ELISPOT在涂阴肺结核患者中的诊断价值，现报道如下。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
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酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。