高产林可霉素链霉菌的筛选及发酵条件的优化

高产林可霉素链霉菌的筛选及发酵条件的优化邓加聪;施潇蕊;曾德样;张文森;徐慧诠;唐慧华;郑虹【摘要】采用平板划线,摇瓶复筛等方法从福清近海海域泥土中分离筛选到一株林可霉素产率较高的链霉菌株6204;采用单因素试验和正交设计试验,从葡萄糖添加量、磷酸二氢钾条件两及金属离子对菌株6204产林可霉素影响,并对其发酵条件进行优化.结果表明,最适的发酵条件为葡萄糖添加量10.0％,镁离子质量浓度0.10g/L,磷酸二氢钾添加量0.020％,在此优化发酵条件下,菌株6204产林可霉素的含量可达3 907.738 μg/mL,与优化前相比较,林可霉素的含量提高了1 823.082 μg/mL.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2015(034)011【总页数】4页(P99-102)【关键词】链霉菌;选育;林可霉素;发酵条件;优化【作者】邓加聪;施潇蕊;曾德样;张文森;徐慧诠;唐慧华;郑虹【作者单位】福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院,福建福清350300;福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院,福建福清350300;福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院,福建福清350300;福建师范大学福清分校朗姆多果酒研究所,福建福清350300;福建师范大学福清分校朗姆多果酒研究所,福建福清350300;福建师范大学福清分校朗姆多果酒研究所,福建福清350300;福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院,福建福清350300【正文语种】中文【中图分类】TQ925林可霉素是林肯链霉菌（Streptomyces lincolnensis）发酵产生的一类抗生素，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）等革兰氏阳性菌具有较强的拮抗作用。

在医药方面，主要用于呼吸道、皮肤及软组织感染等疾病的治疗，由于其疗效稳定、不良反应小、使用安全，作为青霉素的替代药逐渐被应用于临床中［1］。

目前对于产林可链霉菌的研究，国内研究主要集中于菌种选育［2-4］、培养基优化［5-6］，或采用基因工程的方法对产林可菌株进行工程菌的改造［7-10］，以期提高菌株产林可的产量。

在菌种选育方面，孟娜等［2］采用硫酸二乙酯和紫外复合诱变方法，得到一株遗传性能良好的突变株，其林可霉素效价可达到4 082U/mL，比出发菌株提高了107%；李静仁［3］以林可霉素产生菌L92为出发菌株，采用氯化锌、紫外线和硫酸二乙酯三重诱变，获得高产菌株L-96，其摇瓶效价较出发菌株提高了50.2%。

在培养基优化方面，薛正莲等［5］采用响应面法对链霉菌SL-98-2-8的发酵培养基进行优化，得到最佳的发酵条件为淀粉2.1%，玉米浆0.33%，葡萄糖8.5%，豆饼粉2.53%，磷酸二氢钾0.022%，在此条件下，林可霉素的含量为3 700 μg/mL，比优化前提高了12%；钟益清［6］通过罐上工艺改进对林可霉素发酵进行研究，使林可霉素的生物效价从无补料的3 851μg/mL提高到7 421 μg/mL。

陈林［7］以链霉菌N9为出发菌，增加林可霉素的甲基化基因orf25、orf12，调控基因orf22或整个生物合成基因簇IE8拷贝数的遗传改造，林可霉素A产量分别提高5.52%、13.75%、6.24%、17.3%。

薛正莲等［8］用紫外线和激光对林肯链霉菌原生质体进行复合诱变，得到一株林可霉素高产菌株SL98-2-8-116，其摇瓶效价可达3 629 μg/mL，较出发菌株提高了18.3%。

国外学者研究主要在于林可霉素的合成途径，KAMENIK Z等［11］用高效液相色谱对林可霉素发酵过程的中间体进行检测，进而推知跟林可霉素合成有关的关键步骤和中间体，对其进行改进，提高林可霉素的产量。

本研究从福清近海海域泥土中，分离筛选出一株林可霉素产量较高的菌株链霉菌6204，并采用单因素试验及正交试验对其发酵条件进行优化研究，得到该菌株产林可霉素的最适发酵条件，提高链霉菌6204林可霉素的产量，为林可霉素的后期纯化和研究应用提供一定的基础。

1.1 材料与试剂1.1.1 实验菌株链霉菌（Streptomyces）：分离于福清近海海域泥土。

1.1.2 化学试剂玉米浆粉、黄豆饼粉：市售；林可霉素注射液（2 mL/0.6 g）：购自福清永惠医药超市；可溶性淀粉、葡萄糖、硫酸氢二钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化钠等试剂（均为分析纯）：国药集团药业股份有限公司。

1.1.3 培养基平板培养基/斜面培养基：可溶性淀粉20 g/L，KNO31 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5g/L，黄豆饼粉5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，琼脂粉18g/L，pH 7.2～7.3，121℃灭菌15 min。

种子培养基：葡萄糖15 g/L，可溶性淀粉20 g/L，玉米浆粉16 g/L，黄豆饼粉15 g/L，（NH4）2SO41.6 g/L，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

基础发酵培养基：葡萄糖100 g/L，玉米浆粉1 g/L，黄豆饼粉26 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 5 g/L，NaNO38 g/L，CaCO38 g/L，pH 7.0，121℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备NRY2102C恒温振荡器：上海南荣实验室设备有限公司；LDZX-50BI立式自动电热压力蒸气灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；SPX-150B-2生化培养箱：南京艾赛特科技有限公司；SW-CJ-IFD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；THZ-C台式恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；DHG-9076A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；H1850R高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法1.3.1 链霉菌牛奶冻干管的稀释涂布称取1 g近海海泥，加入100 mL无菌蒸馏水，静置30 min，充分混匀后，用无菌蒸馏水稀释至梯度为10-2、10-3、10-4，充分混匀后，取0.2 mL稀释液涂布于平板培养基，30℃倒置培养15～20 d，挑取颜色白、菌落大的单菌落，接种于试管斜面，培养后，4℃冰箱保存备用。

1.3.2 林可霉素高产菌株的筛选将挑取到的单菌落接种于试管斜面活化；接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min振荡培养72 h；按10%接种量将种子液接种于装液量为100 mL/250 mL发酵培养基中，30℃、150 r/min振荡培养96 h，发酵液4℃、8 000 r/min离心5 min，测定上清液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

1.3.3 链霉菌6204的活化及种子液的制备4℃保存的链霉菌6204接种于试管斜面活化；接种于种子培养基，30℃、150r/min振荡培养72 h。

1.3.4 单因素试验（1）葡萄糖添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响改变基础发酵培养基中葡萄糖的含量，葡萄糖添加量分别为2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，30℃、150 r/min振荡培养96h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

（2）金属离子对链霉菌6204产林可霉素的影响在基础发酵培养基中分别添加0.20g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

（3）磷酸二氢钾添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响在基础发酵培养基中添加不同含量（0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）的磷酸二氢钾，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

1.3.5 发酵条件优化正交试验根据单因素试验结果，以林可霉素含量作为评价指标，采用3因素3水平设计正交试验，其因素与水平见表1。

1.3.6 林可霉素含量的测定采用紫外分光光度法［12-13］测定溶液中林可霉素的含量。

林可霉素的含量及相对效价计算公式如下：2.1 牛奶冻干管的稀释涂布将链霉菌牛奶冻干管进行稀释涂布，从分离平板上筛选出17株菌落大且颜色白的单菌落，接种于试管斜面，菌株编号为：6101、6102、6201、6202、6203、6204、6205、6301、6302、6303、6304、6305、6401、6402、6403、6404、6405。

2.2 高产林可霉素链霉菌菌株的筛选将挑取到的单菌落接种于发酵培养基，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液的林可霉素含量并计算其相对效价。

结果见图1。

由图1可知，不同菌株产林可霉素效价各不相同，其中林可霉素含量最高的菌株是链霉菌6204，该菌株发酵液中林可霉素的含量达2 773.07 μg/mL，相对效价为100%。

因此，选用链霉菌6204进行下列的发酵试验。

2.3 单因素试验结果2.3.1 葡萄糖添加量对链霉菌6204产林可霉素的影响改变基础发酵培养基中葡萄糖的添加量，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

结果见图2。

由图2可知，菌株林可霉素的含量随着葡萄糖添加量的增加呈先增后降的趋势，当葡萄糖添加量为7.5%时，发酵液中林可霉素的含量达到最大，为2 481.48μg/mL，相对效价119.04%。

葡萄糖的添加量过低会影响菌体的生长，而过高又会出现葡萄糖效应，进而影响林可霉素的生产合成。

因此，基础发酵培养基中葡萄糖的最适添加量为7.5%。

2.3.2 金属离子对链霉菌6204产林可霉素的影响在基础发酵培养基中加入0.20 g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振荡培养96 h，测定发酵液中林可霉素的含量并计算其相对效价。

结果见图3。

据文献报道［14-15］，发酵培养基中添加一定量的金属离子，对菌株产林可霉素具有一定的影响。

由图3可知，金属离子对菌株产林可霉素的影响顺序如下：Mg2+＞Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+，不添加任何金属离子的对照（CK）组对比，添加有Mg2+、Fe3+、Cu2+的发酵培养基中，林可霉素的相对效价均＞100%，其中添加有Mg2+的发酵培养基中，菌株6204产林可霉素的量可达2 471.56 μg/mL，相对效价为118.56%。

与CK相比，林可霉素的产量提高了18.56%。

因此，基础发酵培养基中最适添加0.20 g/L金属离子Mg2+。