第1章_色谱分离原理

R1 / 2

1 ( 2 t 1 / 2 ( 2 ) 2 t 1 / 2 ( 1 ) ) 2 t R2 t R1 t 1 / 2 ( 2 ) t 1 / 2 ( 1 )
R1 / 2 W2 W1 4 1.7 R 2t1 / 2( 2) 2t1 / 2(1) 2.35
Schematic of a simple liquid chromatographic separation
1.4.5 洗脱的普遍性问题 注意的问题：
1、改变流动相组成和配比；
2、程序升温； 3、改变检测器
1.5 谱带展宽
6.5.1 ～ 6.5.6
自学内容
1.6 分离度 resolution
分配色谱：K－分配系数 吸附色谱：吸附平衡常数
容量因子 k（capacity factor）或容量比 （capacity ratio）:
当溶质在两相中达到分布平衡时，溶质在固定相和流动相中 的量（质量、摩尔数）的比值。
ns csVs Vs k K nm cmVm Vm
色谱保留时间 （retention time）tR、流速（flow rate）u和保 留体积 （retention volume）VR的关系: VR = u tR 搞清楚：死体积V0、死时间t0、调整保留时间t’R、调整保 留体积V’R的概念！
1.1 概 述





色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett 发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的 柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被 分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理 论，发明分配色谱（1952年获诺贝尔化学奖）。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层 色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱 （HPLC）等。 20世纪50年代气液色谱的创立和发展具有划时代的意义， 催生了许多现代色谱方法。
超临界流体介绍

什么是超临界流体
达到或超过临界压力和临界温度的任何流体 • 超临界流体结合了气体和液体的特点，是理想的溶剂替代品 • 二氧化碳最适合用于超临界流体（超临界点：31.3℃，7.38MPa）
•

超临界流体的主要技术领域
超临界色谱（SFC） • 超临界萃取（SFE） • 超临界结晶
•
Path from liquid phase to vapor phase without encountering a phase transition
V 'R VR V0 u(t R t0 ) ut'R
ns V 'R t 'R VR V0 t R t 0 k nm V '0 t '0 V0 t0

Vm Vs
t R t0 (1 k )
k K/
相对保留时间
'
t R2 t R1
1 k2 1 k1
样品作为流动相或流动相 组成部分连续流经色谱柱
柱色谱的区带迁移模式
1.4 色谱保留值
1.4.1 基本关系
比移值（rate of flow）:
ux Rf u
溶质谱带平均移动速度 流动相流速
● Rf 值主要用于描述平面色谱的保留行为，是色谱定性的依据。
● Rf =0，溶质留在固定相不动，谱带不移动，ux = 0 ● Rf =1，溶质全部在流动相，ux = u
ux nm Rf u nm ns
溶 质 在 固 定 相 中 停 留时 间 分 数 的 ns u 1- x u nm ns
分布系数 K（distribution coefficient）: 当溶质在两相中达到分布平衡时，溶质在固定相和流动相中 的浓度比值称为分布系数。
cs K cm
1.2 色谱过程及其分类

色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸 附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使 各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过 固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分 以不同的速度移动而达到分离的目的。
慢
色谱分离
淋洗液
中等 快
Temporal course
以键合C18或C8为固定相，以水作为弱洗脱剂。以甲醇、乙腈和四氢呋 喃等有机溶剂为强洗脱剂，通过水和有机溶剂不同配比形成不同洗脱 强度的流动相。
在二元溶剂（甲醇+水）的反相色谱中，保留值方程：
lnk A CcB
容量因子
有机相浓度（甲 醇的浓度）
HPLC Column
• Must operate in high pressure – Usually constructed of metals • Typical dimensions – 10-30 cm long – 1-3 cm ID • Contains packing material which holds the stationary phase – Many types exist – Typical packing materials are 5-10 µm in diameter • Guard column used to extend life of main column
2
R2 L2 R 1
L1
2
1.7 分离时间
分离时间指物质对中第二个峰洗脱出来所需的时间，即tR2。 对于多组分混合物，分离时间为最后一个组分的保留时间。
(k 2 1) H t R 16R 2 u k2 1
2 3 2
tR
1.4.2 分子间的相互作用能
色谱分离中的一个重要的热力学参数是容量因子k，其大小在热力学上取 决于分配系数K，而K的大小又取决于溶质分子在两相间的相互作用能。 相互作用能有多种形式：色散能、诱导能、取向能、电荷间相互作用能以 及氢键等。
分子间的相互作用能的一般表达式:
2 E B1 A B2 A B3 H B4 0
Supercritical Region

主要应用领域
•
•
Pressure
制药 精细化工
Liquid Solid Gas Triple Point
Critical Point
Temperature
SFC技术特点
扩散速度更快 • 线速度更高 • 复平衡速度更快 • 更高的通量 粘度更低 • 压力降更小 • 流速更高 • 可实现多柱序列分离
Affinity ligand Enzyme
+
Matrix Spacer arm
Active-site-bound enzyme
2. Immunoaffinity chromatography
Antibody ligand Protein epitope
+
Matrix Spacer arm
Antibody-bound enzyme
L
pd
2 2 p
(1 k )
N 2 h 2
p
tm
N h
2
2
p
希望搞清 各项物理 意义！
t R t m (1 k )
(1 k )
亲和色谱(Affinity chromatography)
1. Substrate analogue affinity chromatography
2
2
k2 1 k 2
2
N 16R 1
2
2
2
N 16 R 1
2
k2 1 k 2
2
搞清各 项的物 理意义
R2 N 2 N1 R 1
定量描述相邻两组份在色谱柱内分离情况的指标。
R t R2 t R1 1 (W2 W1 ) 2 2( t R2 t R1 ) W2 W1
当色谱峰底宽交叠不易测量时，可以采用半高峰宽来代替峰 底宽计算分离度，称为半高峰宽分离度R1/2。 ∆t1/2 = t R2 t R1 W1/2
= Selectivity 选择性 受流动相和固定相的影响 受柱长和颗粒度的影响
N = Column Efficiency 柱效
k
= Capacity Factor 容量因子 受流动相、固定相、梯度斜率和延迟体积（梯度）的影响
选择性、柱效和容量对分离度的影响
选择性与颗粒大小无关
柱效
通常用一下方式表示： 理论塔板数：N
选择性因子

t 'R2 t 'R1

V 'R2 V 'R1
k2 k1
保留指数
lg k lg k n I 100 n lg k n1 lg k n lgV ' lgV 'n 100 n lgV 'n1 lgV 'n
k AV N 1 R 2 1 k AV 1 k AV k1 k 2 2
R与各种参数关 系的通用方程
N k2 k1 N ( 1)k1 R 2 k2 k1 2t m 2 k1 ( 1) 2
当色谱保留值较大，相邻色谱峰底宽相近时，则分离度近 似表示为：
第1章 色谱分离原理 Chromatography Principle
教学目的和要求
1、了解色谱过程和分类；
2、掌握色谱保留值的表达和计算（比移值、容量因子、 保留时间、保留因子、容量因子等）；