单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
单克隆抗体的主要制备步骤
单克隆抗体的主要制备步骤
1. 购买解抗原，根据所需克隆抗体设计免疫原；
2. 免疫动物（如家兔），使免疫动物产生抗体抗原反应；
3. 收集动物血清，并从血清中抽取单克隆抗体；
4. 把抽取到的单克隆抗体配制成适合应用的格式（液体、粉末、悬浮液等）；
5. 对单克隆抗体进行纯化并测定其纯度；
6. 用ELISA等多种方法进行交叉反应性测定；
7. 进行稳定性、非特异性结合和抗原竞争的测定；
8. 制备单克隆抗体的回收量检测及吸附实验；
9. 最后进行细胞实验，确保单克隆抗体与细胞结合稳定和特异。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、前期准备工作1. 确定目标抗体：根据研究需求确定需要制备的单克隆抗体。
2. 筛选免疫原：选择适合的免疫原，如蛋白质、多肽、细胞等。
3. 动物选择：选择适合的动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
4. 免疫计划设计：设计出合理的免疫计划，包括免疫剂量、次数、间隔时间等。
二、免疫过程1. 免疫原制备：将所选的免疫原纯化或合成后进行检测和确认。
2. 免疫动物注射：将免疫原与佐剂混合后注射到动物体内，按预定计划进行多次注射。
3. 血清采集：在最后一次注射后采集动物血清，检测抗体滴度是否达到预期水平。
三、杂交细胞制备1. 细胞系选择：选择适合的细胞系如SP2/0或NS0等。
2. 细胞培养：将细胞系培养至稳定生长状态，并进行筛选和确认。
3. 细胞融合：将免疫小鼠脾细胞与SP2/0或NS0细胞进行融合，得到杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：利用HAT培养基对杂交瘤进行筛选，筛选出产生单克隆抗体的杂交瘤。
四、单克隆抗体制备1. 单克隆细胞培养：将单个杂交瘤细胞进行单克隆分离和培养。
2. 单抗酶标法检测：利用ELISA等技术检测单克隆抗体的特异性和亲和力。
3. 大规模培养：将筛选出的单克隆细胞进行大规模培养，得到足够多的单克隆抗体。
4. 纯化和鉴定：通过亲和层析、离子交换层析等技术对单克隆抗体进行纯化，并进行质量鉴定。
五、应用1. 体外实验应用：如ELISA、Western blotting等技术中作为检测试剂使用。
2. 体内实验应用：如流式细胞术、组织切片染色等技术中作为荧光标记或特异性结合试剂使用。
3. 临床应用：如治疗肿瘤、自身免疫性疾病等方面的治疗药物。
六、总结单克隆抗体的制备流程包括前期准备工作、免疫过程、杂交细胞制备、单克隆抗体制备和应用等环节。
其中，前期准备工作和免疫过程是制备成功的关键，而单克隆抗体制备需要经过多次筛选和鉴定才能得到高质量的单克隆抗体。
单克隆抗体在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景，对于推动科学发展具有重要意义。
单克隆抗体技术（文献综述）
文献综述—单克隆抗体技术的原理、发展与主要的实验步骤1. 单克隆抗体制备的基本原理经免疫的动物产生的致敏B淋巴细胞能分泌特异性的抗体，但这些细胞不能在体外长期存活；而骨髓瘤细胞则可以在体外大量地、无限地繁殖，但不能分泌特异性的抗体。
如果应用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与那些能分泌特异性抗体的细胞相融合，那么得到的杂交瘤细胞（hybridoma cell）将同时具有两种亲本细胞的特性：既能够象肿瘤细胞那样无限繁殖，又具有B淋巴细胞的不断分泌抗体的能力。
根据克隆选择学说，由于每个致敏的B淋巴细胞只能针对同一抗原决定簇产生同种的、完全一样的抗体，所以经过克隆化的杂交瘤细胞就能够分泌对某一抗原决定簇具有特异性的单克隆抗体。
这就是单克隆抗体制备的基本原理。
2. 单克隆抗体技术的诞生、发展和展望1975年，George Kohler 和 Cesar Milstein在Nature上发表了一篇文章，第一次描述了一种获得单克隆抗体的方法。
他们所创立单克隆抗体技术给免疫学乃至整个生物医学领域带来了一次巨大的革命。
Kohler 和Milstein 也因此而荣获1984年诺贝尔奖。
单克隆抗体技术诞生后，立即引起了许多研究者的注意，人们纷纷投入这一崭新领域的研究。
经过多年的发展，到二十世纪八十年代中期，单克隆抗体技术已日臻完善，单克隆抗体也开始广泛应用于生物医学研究和生物技术的各个领域，以及临床诊断和治疗的许多领域。
最初，单克隆抗体技术是以小鼠－小鼠杂交瘤为研究的中心而发展起来的。
由于小鼠源性的单克隆抗体在生产与应用中有其内在的缺点，八十年代后，小鼠－大鼠、大鼠－大鼠、小鼠－人以及人－人杂交瘤技术也被尝试并取得了不同程度的成功,有力地推动了单克隆抗体技术的发展和生物医学研究的深入。
尽管早有准备,单克隆抗体技术的影响之深远还是大大超出了人们的预想：在八十年代中到九十年代末的短短十多年中，为了满足临床诊断和治疗的需要，双特异性抗体技术及人－鼠嵌合抗体技术、人源化抗体技术、小分子抗体技术、植物基因工程抗体技术、抗体酶技术、抗体库(噬菌体显示）技术、外因鼠(XenoMouse)技术等基因工程抗体技术在经典单克隆抗体技术的基础上也被创立并得到了突飞猛进的发展。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程1.免疫原的制备和动物的免疫：在开始制备单克隆抗体之前，首先需要制备免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、多糖、细胞表面抗原等。
制备免疫原的常用方法包括化学合成、原核表达系统、真核表达系统等。
制备好免疫原后，将其与适当的佐剂混合，然后通过注射等方式将免疫原引入到实验动物体内。
通常使用小鼠、大鼠或兔子作为免疫动物。
2.脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立：在免疫过程中，免疫原会刺激机体产生大量的抗体。
当机体免疫反应达到一定水平时，需要从免疫动物体内获取脾脏，获得含有抗体产生细胞的脾细胞悬液。
将脾细胞与能激活脾细胞的细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合，形成混合瘤细胞。
3.杂交瘤细胞的筛选和鉴定：将混合瘤细胞进行稀释，分装到96孔板中，使每个孔中只包含一个细胞。
这样每个孔中的细胞都是一个潜在的单克隆细胞。
随后，每个孔中的细胞在培养基中进行培养，以使细胞形成单个克隆。
根据杂交瘤细胞产生的特定抗体，可以使用ELISA等方法进行筛选和鉴定，以确定具有所需抗体的杂交瘤细胞。
4.单克隆抗体的生产和纯化：将筛选出来的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，并定期收集培养上清液以获取单克隆抗体。
为了提高单克隆抗体的纯度和浓度，通常需要对培养上清液进行多次纯化。
典型的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
综上所述，单克隆抗体的制备流程包括免疫原的制备和动物的免疫、脾细胞的获取和混合瘤细胞的建立、杂交瘤细胞的筛选和鉴定，以及单克隆抗体的生产和纯化等几个主要步骤。
每个步骤都需要精确操作和耐心等待，但最终可以获得高纯度和高特异性的单克隆抗体，这在生物医学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程主要分为以下几个步骤：
1. 免疫原制备：首先需要准备免疫原，即待检测的抗原物质。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类等各种生物分子。
在免疫原制备的过程中，需要注意选择合适的纯度、稳定性、活性等因素，并对其进行适量的处理和加工，以确保其具有较好的免疫原性能。
2. 动物免疫：将免疫原注入到动物体内（如小鼠、兔子等），让其自身免疫系统产生抗体。
免疫的方式可以是皮下、腹腔或肌肉注射等，不同的免疫方式会对抗体的种类和数量产生影响。
此外，需要注意控制免疫过程中的免疫原剂量和免疫频率，以免对动物造成损伤。
3.细胞融合：在免疫后，从免疫动物的脾脏等免疫器官中抽取免疫细胞（主要是B细胞）和肿瘤细胞进行细胞融合（如用聚乙二醇等），以形成杂交瘤细胞。
由于肿瘤细胞具有无限增殖能力，可以保证后续获得足够的单克隆抗体。
4.筛选单克隆：在进行细胞融合之后，需要进行筛选并获得单克隆抗体。
筛选包括对细胞培养物中的单克隆进行筛选和鉴定，主要有免疫荧光筛选、酶联免疫吸附测定、流式细胞术等方法。
在筛选过程中，需要对单克隆进行鉴定，包括对其亲和力、特异性、精确度等性质进行测定。
5.大规模生产：最后，需要进行大规模单克隆抗体的生产。
通常
采用的是培养杂交瘤细胞，以获得足够的单克隆抗体。
在培养过程中，需要注意细胞培养条件和产物提取方法，以保证单克隆抗体的质量和
效能。
总之，单克隆抗体的制备过程相当复杂且耗费时间，需要经过多
个环节的把控。
最终获得的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可
以被广泛应用于生命科学、医药等领域。
单克隆抗体制备的原理和基本流程
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3.细胞融合及单克隆抗体的制备
(3) 细胞融合： 50%PEG(400~1000), pH8.0, 37oC, 2min
3.融合细胞的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
4.抗体的检测
常用方法：
要求： ➢ 简便、快速、敏感; ➢ 在短时间内能检测大量样品
+3.6ml M
150ul/孔
E、F、 G、H
调细胞浓度为1-5х103cell/ml 取100个cell于7.2ml完全培养液 (M)中
2个cell/孔
1个cell/孔
0.5个cell/孔
6.杂交瘤细胞的鉴定
染 色 体 核 型 分 析
大规模培养——批量生产单克隆抗体
常用的大规模培养方法：
动物接种法 转瓶培养法
溶液能产生最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。
PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿 需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过 程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有 轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋 白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间 形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促 使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动 性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液
中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过 溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶 极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的主要步骤
单克隆抗体的制备主要分为以下几个步骤：
首先，选定合适的抗原并进行免疫，采集含有抗原特异性淋巴细胞的动物脾脏。
运用免疫规划原则，通过周期性注射抗原刺激动物的免疫系统生成大量特异性B
淋巴细胞。
其次，通过粘膜炎症急性期反应融合技术，将抗原特异性B淋巴细胞和肿瘤细胞进行融合，得到的细胞即为混源杂交瘤细胞。
然后，对获得的杂交瘤细胞进行筛选，挑选出能稳定分泌目标抗体的杂交瘤克隆。
利用ELISA、FACS等方法，能对杂交瘤筛选进行优化。
接着，研究人员会对所选克隆进行鉴定，了解其分泌的抗体与抗原的亲和力。
结合测序和质粒制备，进一步明确杂交瘤克隆的免疫学特征。
随后，利用无菌操作技术进行体外扩增和冻存，保证抗体质量的稳定。
最后，通过体内成瘤或者体外不系细胞培养的方式进行大量抗体生产，然后提取，纯化单克隆抗体。
密集摇瓶和生物反应器培养技术是临床试验阶段常用的抗体生产策略。
单克隆抗体的研究和生产是一个复杂且需要精细操作的过程，旨在通过这些步骤高效、可靠地生产出具有特异性的单克隆抗体。
对于抗体药物研发、生物技术、诊断试剂等领域，具有不可替代的重要价值。
小鼠单克隆抗体的制备
小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。
这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。
1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。
将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。
免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。
2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。
可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。
3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。
在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。
存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。
5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。
提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。
小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。
但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。
此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。
因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。
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HAT培养基
+
HAT培养基中的氨基蝶呤为叶酸 拮抗剂，故所有细胞的DNA合成主要 途径被阻断，只能由辅助途径合成 DNA。
未融合的瘤细胞因缺乏HGPRT 和TK，不能合成DNA，即不能 生存而死亡。
未融合的B细胞不能在体外长期生存 而自然死亡
只有融合的杂交瘤细胞从B细胞 中获得了HGPRT和TK，又能在体 外培养繁殖，因而存活。
4. 制备单克隆抗体的技术流程
（一）杂交瘤技术流程
（二）技术要点
①制备免 疫脾细胞
②筛选骨 髓瘤细胞
③细胞 融合条件
✓同一般血清的制备 ✓采用脾内直接免疫
融合前应经过含有特殊 成分的培养基筛选，防 止细胞发生突变恢复 HGPRT或TK的活性。
无菌、温度、瘤细胞与 脾细胞的比例、50%PEG
④选择 阳性克隆
（2）放射免疫显像：将放射性标记 物与McAb连接 ，注入患者体内可进 行放射免疫显像，以诊断早期肿瘤的 小转移灶，或用于术前定位及术后追 踪观察。
第五节 基因工程抗体技术
基因工程抗体又称重组抗体，是指应用 NDA重组及蛋白工程技术对编码抗体的基 因按不同的需要进行改造和装配，经导入 适当的受体细胞后重新表达的抗体。
根据抗原的性质及所需单克隆抗体的功能， 常用方法有RIA、ELISA、免疫荧光等，鉴定 抗体的特异性、亲和力 、纯度等。
⑤克隆化
克隆化的目的是为了获得单 一细胞系的群体。要尽早进 行、反复筛选。因初期杂交 瘤细胞不稳定，有丢失染色 体的倾向。反复克隆可获得 稳定的杂交瘤。常用有限稀 释法，按每孔一个细胞接种 在培养皿中。
容易得到，可根据需要进行选择。如选择 人IgG1或IgG3的恒定区可使嵌合抗体保留 其介导抗体依赖性细胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC） 和增强激活补体的能力,如果抗体只是用于 激活和阻断受体时，可选择人IgG2或IgG4 恒定区。
1．抗体V区基因的克隆 准确获得抗体可 变区基因是制备嵌合抗体的关键所在。
鼠源单抗VL和VH基因可通过以下两种方 法获得：
从该细胞的RNA或mRNA中扩 增所需的V区基因。
2．抗体C区的选择
抗体恒定区基因的序列相对恒定，比较
收集对数增长期细胞
融合（PEG）
接种于微孔营养板，在HAT培养基中培养
阳性孔再次克隆化
检测抗体
收集上清收获抗体
克隆扩大培养
接种小鼠腹腔收集腹水
杂交瘤细胞冻存于液氮
三、单克隆抗体的应用
1. McAb的优点： 特异性强 纯度高 效价高 无血清交叉反应 可大量生产且稳定性好
2. McAb的应用
酶免疫 荧光免疫
目前临床上使用的单克隆抗体和多克 隆抗体均为动物源性抗体，具有免疫原性， 在反复使用时常会诱导机体的免疫应答而 产生抗抗体，这大大限制了异源性抗体在 人体内的应用。随着基因工程技术的发展， 人们逐渐可根据需要制备各种特异性的抗 体，通过降低抗体的免疫原性，获得更佳 的生物学活性。
目前基因工程抗体技术主要包括两部 分内容：
高的融合率 骨髓瘤 细胞应 该具备 的条件
本身不
合成Ig
与B细胞融合 后形成稳定的 杂交瘤细胞， 能无限增殖传 代和分泌特异 性抗体缺乏次 黄嘌呤-鸟嘌呤 转换酶 （HGPRT）和 胸腺嘧啶激酶 （TK）
2. 细胞融合的方法 融合剂融合法
聚乙二醇
（PEG） （最常用）
溶血卵磷脂 仙台病毒
3. 选择性培养基的作用原理
放射免疫
免疫组化
医学检验
诊断试剂
试剂盒 （1）病原微生物抗原、抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子测定
蛋白质 的提纯
McAb 作为配体，用于 分离纯化相应抗原
肿瘤导向治疗和 射免显像技术
（1）导向治疗作用：用McAb或连 接药物、毒素的McAb治疗肿瘤， 称“免疫导弹”。目前在动物实 验中已获满意效果。
① HAT培养基是一种筛选B细胞 杂交瘤的选择性培养基，含有：
次黄嘌呤（H） 氨基蝶呤（A） 胸腺嘧啶（T）
②细胞DNA生物合成途径
辅主助要途途径径
氨基酸
核苷酸 叶酸 DNA
次黄嘌呤+胸腺嘧啶
HGPRT TK
DNA
③ HAT培养基作用原理
细胞类型 正常培养基
TK缺陷细胞
+
HGPRT缺陷细胞 +
杂交瘤细胞
一是应用DNA重组和蛋白工程技术对已有 的单抗进行改造，包括人源化抗体、小分 子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白 等的制备；
二是用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。
一、人源化抗体
（一）嵌合抗体 嵌合抗体（chimeric antibody）又称人-鼠嵌合抗
体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单抗功能性V 区基因，经基因重组与人抗体C区基因连接成嵌 合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染 宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体分子。 嵌合抗体保留了单抗对抗原的特异亲和性，又 含有人抗体C区的成分及其功能。
第四节 单克隆抗体
一、单克隆抗体的概念及特点
概念：
指由B细胞杂交瘤产生
的, 只识别抗原分子上一种
抗原决定簇的抗体分子
特点：
理化性状高度均一、生
物活性单一、只与一种抗原
表位发生发应、具有高度的
特异性
二、杂交瘤技术的原理及流程
克隆：
由一个细胞进行无性
分裂增殖，形成的均 一细胞集团。
由一个B 细胞杂交瘤 单克隆抗体： 细胞分裂增殖，形
成的单克隆所产生 的抗体。
1. 杂交瘤技术的原理：
分泌抗 体能力
B细胞杂交瘤
致敏B细胞 骨髓瘤细胞
融合
B细胞杂交瘤பைடு நூலகம்
无限繁 殖能力
免疫 脾细胞
骨髓 瘤细胞
是经过抗原诱导活化 的脾细胞，主要是 B 淋巴细胞，它具有分 泌抗体的能力。
是 B 细胞系恶性肿 瘤，具有在体外长 期增殖的特性。
与B细胞有较
⑥单克隆抗体 的制备
大量生产分体内和体外
两种方法，目前以体内 法为主。先给小鼠腹腔 注射降植烷，造成无菌 性腹膜炎，7天后将杂交 瘤注入小鼠腹腔，10—14 天后从小鼠腹腔获得高 浓度的单克隆抗体。
免疫小鼠（融合前3—4周）
骨髓瘤细胞
强化免疫（融合前3—4天）
融合前2—4周复苏培养
取脾制成细胞悬液(融合当天）