实验四 沙门氏菌属(Salmonella)的检验

实验四沙门氏菌属（Salmonella）的检验

1 目的

1.1 理解沙门氏菌属生化反应及其原理

1.2 掌握沙门氏菌属血清因子使用方法

1.3 掌握沙门氏菌属的系统检验方法

2 原理

沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。

食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性平板分离沙门氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。本实验以蛋品为检测样品，以已知的沙门氏菌和大肠埃希氏菌为对照。

3 材料

3.1 菌种

沙门氏菌（Salmonella sp.）

大肠埃希氏菌（E.col.）

3.2 检样

冻肉、蛋品、乳品等。

3.3 培养基

缓冲蛋白胨水（BP）、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、SS琼脂、EMB琼脂、亚硫酸铋琼脂（B S）、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水、尿素培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、丙二酸钠培养基、氰化钾（KCN）培养基、ONPG培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、DHL琼脂、HE琼脂。

3.4 试剂

吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂，沙门菌A—F多价诊断血清，革兰氏染色液等。

3.5 器具

天平（称取检样用）、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、

金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。

4 流程

5 步骤

5.1 前增菌和增菌

沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基缓冲蛋白胨水（BP），进行增菌，使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。一般增菌时间为4h，增菌时间不宜过长，由于BP培养基中没有抑菌剂，时间太长了，杂菌也会相应增多。干蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌，其在加工过程中受到的损伤又较严重，因此应适当延长前增菌时间，一般为18～24h。

无菌操作称冻蛋取25g样品，加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀。在36±1℃培养4h（干蛋品需培养13～24h），移10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液，在42℃培养18～24h。同时另取10ml，加入100ml亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，在36±1℃培养18～24h。

鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，取半量，接种于100mLMM（或TTB）增菌液内，于42 oC培养24h；另半量接种于100mLSC增菌液内，于36±1 oC培养18～24h。

5.2 分离

取增菌液和混合液各1环，分别划线接种于一个BS平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。于36±1 oC培养18～24h（DHL、H E、WS、SS）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落。先观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。

5.3 三糖铁高层琼脂初步鉴别

将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜面，于36±1 oC培养18～24h，并根据表4-1初步判断是否可疑沙门氏菌。

表4-1肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果

斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种

－＋ ±＋沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌

＋＋ ±＋沙门氏菌Ⅱ、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌

－＋＋－沙门氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属

－＋－－伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠艾希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属

＋＋ ±－大肠艾希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌

注：+阳；－阴性；＋／－多数阳性，少数阴性。

5.4 生化试验

在接种三糖铁琼脂的同时，接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7. 2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1 oC培养18～24h，必要时可延长至48h，按表4-2判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它5种反应结果均可以排除。

表4－2 肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表

反应序号 H2S 吲哚 PH7.2尿素 KCN 赖氨酸脱羧酶判定菌属

A1 ＋－－－＋沙门氏菌属

A2 ＋＋－－＋沙门氏菌属(少见)爱德华氏菌

A3 ＋－＋＋－柠檬酸杆菌

奇异变形杆菌

A4 ＋＋＋＋－普通变形杆菌

B1 －

－－

－－

－－

－＋

－沙门氏菌属、埃希氏菌

甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌、志贺氏菌属

B2 －－＋＋－－－－＋－埃希氏菌

埃希氏菌、志贺氏菌属

B3 －－－－ ±＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各属

阴沟肠杆菌、柠檬酸杆菌属

B4 －＋ ±＋－摩根氏摩根氏菌、普罗菲登斯菌属

注：①三糖铁琼脂底层均产酸；不产酸者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。

②KCN和赖氨酸可选用其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。

③＋表示阳性；－表示阴性；±表示多数阳性，少数阴性。

5.4.1 反应序号A1

典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4-3可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。表4－3 沙门氏菌属生化鉴别表

PH7.2尿素氰化钾（KCN）赖氨酸判定结果

－－－甲型副伤寒沙门氏菌

（要求血清学鉴定结果）

－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ

（要求符合本群生化特性）

＋－＋沙门氏菌个别变体

（要求血清学鉴定结果）

注：＋表示阳性；－表示阴性。

5.4.2 反应序号A2

可先作血清学鉴定，如A～F多价O血清不凝聚时，补做甘露醇和山梨醇试验，按表4-4判定结果。

表4-4

甘露醇山梨醇判定结果

＋＋沙门氏菌靛基质阳性变种

（要求血清学鉴定结果）

－－爱德华氏菌

5.4.3 反应序号B1