叶绿体色素的提取
绿叶中色素的提取和分离实验原理
绿叶中色素的提取和分离实验原理
绿叶中色素的提取和分离实验：
1、提取：绿叶中的色素——研磨法。
称取、剪碎5g叶片，放入研钵中。
加入少许二氧化硅、碳酸钙、5mL丙酮。
快速、充分研磨。
根据叶绿体中的色素在有机溶剂（乙醇、丙酮等）中溶解的特性，用丙酮可将色素从叶片中提取出来（若用95％的酒精作溶剂，则应向色素提取液中加入无水碳酸钠，除去色素提取液中的水分。
若用丙酮作溶剂，则用量不宜过多，以2～5mL为宜，过多会影响色素浓度，过少不易过滤），过滤后收集滤液，将滤液收集到小试管中，及时用棉塞将试管塞紧备用。
2、分离：制备滤纸条，将干燥过的定性滤纸剪成6cm×lcm的条，一端剪去两角，距该端lcm处用铅笔画一条极细的横线。
用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀画一条细而直的滤液线，待干燥后再重复画2～3次（次数越多色素越多）。
实验原理：
1、色素提取原理：色素溶于有机溶剂而不溶于水，可用95%的乙醇、丙酮等有机溶剂来溶解色素，从而提取绿叶中的色素。
色素提取也可用水浴加热法，即把叶片剪碎后放在95%的乙醇中，进行隔水加热来提取。
一般地说，叶片加热到变成黄白色，叶片中的色素基本上被提取出来了。
2、色素分离原理：各种色素在层析液中溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散速度比较快，反之则比较慢，从而使各种色素相互分离开来。
叶绿体色素的提取分离理化质和定量测定
六、实验结果观察及计算
（1）实验结果观察描述
（2）计算组织中叶绿体色素含量
（用mg/g鲜重或干重表示）
公式
叶绿素的浓度（C） 提取液体积 稀释倍数
叶绿体色素含量=
样品鲜重（或干重）
七、思考题
（1）叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否 用这一吸收峰波长进行叶绿素a、b的定量分析？ 为什么？
叶绿素中镁可被H+取代而形成褐色去镁叶绿素。 去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素。 皂化反应： 叶绿素可与碱起皂化反应而形成醇（甲醇和叶绿 醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水--分开叶绿素 与类胡萝卜素。
2. 定量测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分 光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即可用 公式计算出提取液中各色素的含量。
四、 实验步骤
1. 提取叶绿素
研磨法 材料剪碎 加入有机溶剂
研磨、匀浆 过滤 提取液
研磨法提取光合色素
荧光现象
（2）纸层析分离现象观察
去镁叶绿素
（3）叶绿素荧光现象观察
（4）H+和Cu2+对叶绿素 中Mg2+的取代作用
（5）皂化反应现象观察
铜代叶绿素 绿黄色素分层现象
五、定量测定
（1）定量用叶绿素提取液制备 （2）分光光度计测定 （3）实验数据及其处理
（2）用不含水的有机溶剂如无水乙醇、无水 丙酮等提取植物材料，特别是干材料的叶绿体 色素往往效果不佳，原因何在？
（3）研磨提取叶绿素时加入CaCO3. 石英砂 各有什么作用？
Ca=12.72D663 - 2.59D645 （1） Cb=22.88D645 - 4.67D663 （2） 将Ca与Cb相加即得叶绿素总量（CT）： CT=Ca+Cb=20.2D645+8.05D663（3） 或：
叶绿素的提取与分析测定
植物叶绿体色素的分析一、实验目的：1、学会叶绿体色素的分离方法。
2、掌握叶绿素的定量测定。
一、3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。
二、实验原理：1、叶绿体色素的提取：（1）原理：叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。
叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。
（2）步骤：称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用2、叶绿体色素的分离：（1）原理：叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。
当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。
（2）步骤：1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。
2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封住层析缸,直立于暗处层析。
3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。
如图所示：3、叶绿体色素的性质（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。
浅谈叶绿体色素的提取,分离实验的基本原理
浅谈叶绿体色素的提取,分离实验的基本原理叶绿体色素是植物共同的分子，是植物叶片绿色色素的主要成分，在植物的基因组中占有非常重要的地位。
叶绿体色素的提取和分离实验是植物生理学研究中常见实验，它们的研究对于深入解析植物叶片绿色色素的组成、形成机制以及植物的适应和演化有重要的意义。
本文简要介绍叶绿体色素提取、分离实验的基本原理以及实验步骤。
一、叶绿体色素的提取1.提取用植物组织植物细胞是由多种组织结构的嵌套形式组成的，而叶绿体这种特殊的细胞构造，它们除了在细胞质和细胞核里贮存着叶绿素外，还处于细胞子室内、细胞膜之间，因此叶绿体色素的提取，必须从整个植物细胞体内提取。
2.提取步骤a)取植物组织消化，加入蛋白酶消化液，消化温度保持在37℃，消化完成后，用离心机将悬浮液离心分离；b)将悬浮液和脉粗滤；c)用离心机将滤液离心，并将残留物清除；d)用硫酸钠缓冲液将离心液中的叶绿体色素进行沉淀分离；e)最后，用离心机将沉淀液离心，取得叶绿体色素提取液。
二、叶绿体色素分离实验叶绿体色素分离实验是以“四维定律”为基础的，四维定律指的是溶解物的溶解度与温度、酸度、配体浓度等四个维度的变化而发生变化。
以下是叶绿体色素分离实验的实验步骤：1.温度调节将叶绿体色素提取液加入50mL的萃取液中，将温度调节到10°C，保持温度稳定后，用离心机将其离心十分钟；2.酸度调整将离心液加入室温的硫酸铵溶液中，搅拌均匀，然后再次利用离心机离心，将叶绿体色素沉淀出来；3.配体浓度调整将离心液和硫酸铵溶液加入50mL的氯化钠溶液中搅拌均匀，然后将其再次离心，至此叶绿体色素被沉淀出来，即可获得叶绿体色素的分离液；最后，用离心机离心冷却至温度达到最低，来增强叶绿体色素的沉淀，以达到纯度高的目的。
综上所述，叶绿体色素的提取、分离实验步骤比较复杂，从植物组织的提取、细胞色素的悬浮液提取、细胞色素的滤液提取、通过改变温度、酸度、配体浓度的方法对叶绿体色素的分离实验，至此，叶绿体色素的提取和分离实验基本原理就介绍完了。
叶绿体色素的提取理化性质与含量测定
2.4 叶绿素含量的计算
1）叶绿素a、b分别在665nm和649nm波长处（95%乙醇提取）有最大的 吸收峰，同时在该波长处叶绿素a，b的比吸收系数K为已知，我们即可以 根据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：
Ca=13.95A665 – 6.88 A649 Cb=24.96 A649 – 7.32 A665 CT =Ca + Cb= 18.08 A649 + 6.63A665
浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速 分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。
叶绿素的理化性质
1）吸收光谱 红光区：640~660 nm；篮紫光区：430~450 nm 。 2）荧光现象 叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。 3）皂化反应 叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶
3ml提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）603℃mi水n 浴 冷却 + 3ml苯（摇匀） + 3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀） 静置，观察分层现象。
下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）； 上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 对照：另取3ml 叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和2ml 蒸馏水观察与皂化 的叶绿素有何不同？ （结果与分析3）
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×稀释倍数×提取液体积] /样品鲜重
比较两种方法所得的实验结果。 （结果与分析5）
5. 结果与分析
详见实验步骤（结果与分析1-6）
6. 注意事项
1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行， 研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。
2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。 3）分光光度计的正确使用。
叶绿体中色素的提取和分离
生物体内的主要能源物质是: 糖类 生物体内主要的储能物质是: 脂肪
生物体进行生命活动的直接 能源物质: ATP 最终能量来源: 太阳的光能
能量之源——光与光合作用
太阳光中有能量，我 们制造出太阳能电池板 可以捕获其中的能量并 转化为电能。 绿色植物也能捕获 并转化太阳光中的能量， 那么，绿叶中通过什么 物质或结构捕获并转化 光能呢？
小鼠
存活。
结论： 植物能够净化因燃烧或呼吸而变混浊的空气。
结论1： 普利斯特利的实验 只有在阳光照射下
才能成功
结论2： 植物体只有绿叶才能更 新空气。
结论： 淀粉是光合作用的产物之一。
极 细 光 束
黑暗中
光照下
结论： 叶绿体是植物进行光合作用的场所 光合作用需要在光下进行 光合作用中释放氧气
O2
光合作用的过程
学习目标： 1．了解光合作用的探索历程 2. 掌握光合作用的过程
1
光合作用的概念:
光合作用是指绿色植物通过叶绿体,利 用光能,把二氧化碳和水转化成储存能 量的有机物,并且释放氧气的过程。 2 光合作用反应式: CO2 + H2
*O 光能 叶绿体
有机物 + *O2
在光合作用的探索历程中， 有几个比较重要的突破性实验？ 分别有什么发现？在探索过程中 最杰出的科学家是谁？
光合作用的过程
阅读课本P:103—106,填写下表
项目
光反应
叶绿体的类囊体薄膜上 光、色素、酶，水 H2O
酶
暗反应
叶绿体的基质上 酶，水，ATP, [H]，C5
场所 条件
物质变化
[H]+O2 ↑
酶
ADP+Pi+能量
提取叶绿体色素的方法
提取叶绿体色素的方法解析：提取叶绿体色素的方法一、准备工具大试管、台秤、研钵、剪刀、量筒、漏斗、分液漏斗、软术寒、烧杯、滤纸、小试管、分兆计、酒精灯、吸耳球、移液管、电吹风、毛细管95%乙醇、CaCO3、石英砂、汽油、苯、KOH、甲醇、乙酸铜、盐酸二、步骤1. 称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片，或芹菜、油菜等其他植物的新鲜绿叶5 g，剪碎放人研钵中，加入乙醇5 ml、少许CaCO3，中和细胞中的酸防止Mg，从叶绿素中心释放，和石英砂,研磨成勻浆,再加入适量的乙醇20~25 ml，然后用漏斗过滤，即得叶绿体色素液。
2. 若用千拒肥排粉时，则称取1g 干粉放人小烧杯中，加95%乙醇20~30 ml 提取,并随时搅动。
待乙醇呈深绿英露色时,滤出浸提液备用。
取准备好的滤纸条(2cmX20cm)，将其一端剪去两侧，中间留一个长约1.5cm,宽约0.5cm的窄条。
3. 用毛细管吸取叶绿体色素提取液点于滤纸的下端窄条的上方中央，注意一次所点溶液不可过多，如色素过淡,用电吹风吹千后再重复1~2次。
4. 在大试管中加入汽油5~10ml，或其他层析液，如石油醚:丙酮苯体积比为20 :2 :1的混合溶液，然后将滤纸条上端固定在软术塞上，插人试管内，使窄条进入溶液中，色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，盖紧软木塞,直立于阴暗处，或试管外套一黑纸套。
5. 经0.5~1h后，观察分离后色素带的分布。
最上端橙黄色的是胡萝卜素,其次为叶黄素，再下面蓝绿色为Chl a,最后的黄绿色为Chl b。
6. 取叶绿体色素提取液少许于1支试管中，用反射光和透射光观察提取液的颜色有何不同，反射光下观察到的提取液颜色即为叶绿素产生的荧光颜色。
取叶绿体色素提取液少许，分装于两支试管，光对叶绿素的破坏作用中，一支放在黑暗处(或用黑纸套包裹)，另一支放在强光下(阳光下)，经过2~3h后，观察两支试管中溶液的颜狠敏色有何不同。
叶绿体色素的提取与分离实验
3、用纸层析法将色素进行分离，在滤纸条上出现最宽旳一 条色素带旳颜色是（ ） A、橙黄色 B、黄色 C、蓝绿色 D、黄绿色
类胡萝卜素 50
叶绿素b 叶绿素a
0
波长
二、捕获光能旳色素和构造
（一）捕获光能旳色素
色素
叶绿素a （蓝绿色）
叶绿素 叶绿素b
（黄绿色） 含量约占3/4
类胡萝卜素
叶黄素 （黄色） 胡萝卜素 （橙黄色）
含量约占1/4
吸收可见 旳太阳光
类胡萝卜素主 要吸收蓝紫光
叶绿素主要吸收 红光和蓝紫光
课堂检测
1、在叶绿体色素旳提取和分离试验中在滤纸条上扩散速度 最快旳色素是（ ） A、叶绿素a B、叶绿素b C、胡萝卜素 D、叶黄素
分别在A、B、C三个研钵中加入2克菠菜，经研磨、提取得到三种颜色旳溶液： 深绿色、黄绿色（或褐色）、几乎无色。注：“+”表达加，“—”表达不加。
处理
二氧化硅（少许） 碳酸钙（少许）
95%乙醇（10ml） 蒸馏水（10ml）
ABC +++ —+ + + —+ —+ —
（1）A处理得到旳溶液颜色是 黄绿色 ，原因是__叶__绿__素_被__破__坏__________
（6）色素分离旳成果：相邻色素带间距最宽旳是 他们旳颜色是 橙黄色 和 黄色 ，主要吸收 蓝紫
胡萝卜素 和 叶黄素 ， 光。
（ D）
A、安装红色透光薄膜 B、安装蓝紫色透光薄膜
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定
Ⅰ提取与分离
实验日期：2011.10.22
实验者：XXX
同组姓名：XXX
一、实验目的：
1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理:
叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂:
1.新鲜的菠菜叶片。
2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂。
3.研钵，漏斗，滤纸，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板。
四、实验步骤:
（一）色素提取液的制备
1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎（越碎越好），放
入研钵中。
2.向研钵中加入少量CaCO3，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，
再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml
体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色
素提取液。
提取液应尽量避光保存。
因提取量较大，可用于其他相关实验
（即用于后面的理化性质的验证）。
（二）叶绿体色素的分离
1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，
距下边缘1cm处用毛细管划线，自然风干后划第二次，重复操作3~4次，
确保划的滤液细线颜色足够深，使分离结果更加明显。
2.取已经加入适量展开剂的层析缸，把硅胶预制板带有色素的一端放入，使
其下端浸入展开剂中，但注意液面不可超出滤液细线。
迅速改好层析缸盖
减少展开剂的挥发对人体产生的不良影响。
注意观察展开剂的扩散过程，
当各种色素得到较好分离，且展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时，
取出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
注意要迅
速，否则展开剂前沿很快会挥发消失，且前沿和各个色素带的位置均会有
微小变动。
3.测量出前沿和各个色素带距离原点的距离并记录。
五、实验结果与分析（以图辅助以文字展示）:
.
自上而下分别为：胡萝卜素，叶绿素a，叶绿素b，叶黄素。
各自到原点的距离：
展开剂前沿：8.50cm
胡萝卜素：8.10cm ，Rf=0.95
叶绿素a：6.70cm ，Rf=0.79
叶绿素b：6.30cm ，Rf=0.74
叶黄素：5.90cm ，Rf=0.69
事实上实验中不止看到了这四种色素带，在它们下面还有一些分离出来的色素带，但是不在本实验的讨论范围中，故不予考虑。
Ⅱ理化性质
一、实验目的：
验证叶绿体素的理化性质。
二、实验原理：
1.叶绿素可与碱起皂化反应产生的盐能溶于水中，因此可用此法分离叶绿素和类胡萝
卜素。
2.叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时
可发射出红光量子因而产生荧光。
3.叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，
而类胡萝卜素则较稳定。
4.叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜成为铜代叶
绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的
浸渍标本。
三、实验材料与试剂：
1.新鲜菠菜叶片。
2.叶绿素提取与分离实验中剩余的叶绿素提取液。
3.小试管，试管架，水浴锅（60℃和90℃各一个），10ml移液管，洗耳球，三角瓶。
4.体积分数为95%的乙醇，笨，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜
溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。
四、实验步骤：
（一）光对叶绿素的破坏作用
取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用乙醇稀释一倍。
其中一支放在直射阳光下，另一只用锡纸包严，40min后对比观察颜色有
何变化。
（二）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
1．取1支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。
2．片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。
若溶液不分层，则用
滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时静置。
（三）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
1．取2支试管，第一支加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。
第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴，摇匀，
观察溶液颜色变化情况。
当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水
浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。
2．取新鲜菠菜叶片两小片（能塞进小试管即可），放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至
颜色不再变化为止。
（四）荧光现象的观察实验前
取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下照射，比
较溶液的透射光与反射光颜色有何不同。
五、实验结果与分析（以图辅助以文字展示）：
（一）光对叶绿素的破坏作用
（二）皂化作用（绿色素与黄色素的分离）
有明显的分层现象，上层显黄色，下层显绿色。
（三）H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
绿色→→→→黄色→→→→绿色
（四）荧光现象的观察
实验前（左边光
照）
利用另外一支试管取未用锡箔纸包的
叶绿素溶液进行对比如图，右边为光照
后的叶绿素溶液
实验后（由于实验过程中包锡箔纸
的试管不慎打翻导致现在这样）
反射光明显是红色的
明显透射光是绿色的。