植物离体培养育种案例
春兰根状茎离体培养
园! ! 艺! ! 学! ! 报
"# 卷
! ! 综上所述，番茄秧苗在运贮过程中由于环境条件的剧烈变化而导致质量不同程度下降，秧苗生理 以及内源激素各项指标的变化，与秧苗质量下降显示出高度的一致性，说明在运贮中产生的“ 胁破 性衰变” 是生理性的，其具体表达为水分胁迫加重、光合系统受损、根系活力下降等。本试验结果 表明，用 $% $&’ 富里酸溶液喷施叶片处理后，所有测定指标均显著优于未喷施处理，尤其可减小水 分蒸腾量，减轻叶片中叶绿体受伤害程度，并且促进根系发育，从而缓解秧苗运贮中的水分胁迫，减 缓生理衰变。在本试验条件下，可以认定富里酸处理是运贮中保持番茄秧苗质量的有效技术。 参考文献：
关键词：春兰；根状茎；离体培养 中图分类号：C IE! ! 文献标识码：0! ! 文章编号：$F("Q"F"U（ #$$F ） $&Q$H$IQ$( 国兰一般以茎尖和侧芽为外植体，经类原球茎途径获得再生植株，但外植体来源有限，且对母株伤害极大。本研 究以春兰（ ,1#<42(# +-/*4%+44） 成年植株的根状茎作为外植体，通过诱导不定芽（ 器官型途径） 成功地再生出了完 整植株。此方法简单，快繁周期短，遗传性稳定。 供试材料为四川本地的线叶春兰盆栽成年植株，于 #$$& 年 " 月 (# 日采其根状茎，用 $% (’ B@K5# 溶液消毒后， 切除根状茎的两端，剪成 (% F /= 左右的节段，接入添加不同激素组合的 VC 或 ( W #VC 培养基中，并附加 $% #’ 活性炭 （ 0K） ，在生根培养时添加 (F’ 椰汁，在（ #F X # ） Y 、光照 (& A W 9、光照强度 # $$$ 5Z 下培养。每处理接种 (# 个外植 体，重复 # 次。 结果表明，培养 I$ 9 后，在茎节部位长出 # G " 个小的白色突起，一周后转变成绿色小芽（ 图版，( ） ，( W # VC [ #% $ =@ W ) IQ\0 [ $% F =@ W ) ]00 [ $% #’ 0K 最利于芽的诱导，诱导率为 "H% F’ 。待芽长到 ( /= 左右时经切割进行增 &$ 9 后小芽基部有 ( G # 个白色小点，一周后转为绿色再生新芽（ 图版，# ） 。随着培养时间的延长，新芽数 殖培养， 有所增加。在 ( W # VC [ $% # =@ W ) ]00 [ #% $ =@ W ) IQ\0 [ $% #’ 0K 培养基上丛芽长势最好，增殖率较高（ #IH’ ） ，而 在 ( W #VC [ $% " =@ W ) ]00 [ "% $ =@ W ) \0 [ $% #’ 0K 培养基上，芽的增殖率下降，芽生长不良且有明显的分泌物产生 和一定频率的褐化。无根苗经 #F 9 生根培养后，有的小苗基部长出 ( G # 个淡绿色小圆点，即开始根的分化，($ 9 后 。在 ( W #VC [ #% $ =@ W ) ]00 培养基上的生根效果较好，添加 (F’ 的椰汁对苗高有极大 形成 ( G # /= 的根（ 图版，" ） 的促进作用。当试管苗长至 F G I /= 时，移栽在以苔藓为基质的塑料盆中，浇透水，再用塑料薄膜覆盖保湿。( 个月 后成活率达 E$’ 以上，植株生长发育良好（ 图版，& ） 。
凤 梨 科 植 物 的 离 体 培 养
凤梨科植物的离体培养(综述)洪燕萍林顺权林庆良福建农林大学亚热带果树研究所福建福州350002摘要本文主要从快速繁殖育种探索和种质保存三个方面介绍凤梨离体培养研究的进展并简要介绍其他凤梨科植物离体培养的研究概况在此基础上对一些问题进行探讨并提出展望关键词凤梨凤梨科离体培养快速繁殖育种种质保存中图分类号 S688.3; Q943.1 文献标识码A 文章编号1009-7791(2001)02-0070-05In vitro culture of pineapple (a review)HONG Yan-ping, LIN Sun-quan, LIN Qing-liang(Institute of Subtropical Fruits, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian China) Abstract: In vitro culture of pineapple is focused on different respects, such as establishing practicable rapid propagation systems from different explants, breeding new cultivars from variant clones, hybrids or transgenic plants and preservating germplasm.The advances in study of isolated culture of pineapple are introduced and plant culture invitro of other species belong to Bromeliaceous is described, some problems and perspectives of this field are also discussed.Key words: pineapple; Bromeliaceae; in vitro culture; rapid propagation; breeding; germplasm preservation凤梨科植物有60 个属2 000 多个种其中凤梨属主要作为水果种植剑凤梨属铁兰属等近十个属作为观赏花卉种植凤梨属有个种具经济栽培价值的只有凤梨一种(Ananas Comosus)[1] 凤梨是世界第三大热带水果除食用外其蛋白水解酶已被应用于皮革制造食品工业医药卫生等领域[2] 生物技术的应用也集中于此本文主要从快速繁殖育种探索和种质保存三个方面介绍凤梨离体培养研究的进展1 快速繁殖Aghion 和Beauchesue[3]首次报道以凤梨冠芽为材料进行快速繁殖此后国内外陆续报道了一些不同外植体的快速繁殖如冠芽裔芽腋芽果实叶片幼胚等1.1 芽的离体培养凤梨的快速繁殖主要以冠芽为外植体各种芽灭菌后置于添加不同生长调节剂的培养基中经愈伤组织或芽形成小植株Wakasa 等[4]以休眠腋芽小冠芽小裔芽进行培养在MS + 肌醇100mg/L 以下培养基添加物单位均为mg/L + 3%蔗糖基础上添加NAA 2.0 和2001,30(2):70-74.Subtropical Plant Science第2 期洪燕萍等凤梨科植物的离体培养综述﹒71﹒BA 2.0 得到球状体(一类特殊愈伤组织) 转至仅含BA 2.0 的培养基上长成苗再移至不含激素的培养基上生根Mathews 等[5]将腋芽置于MS + NAA 1.8 + IBA 2.0 + KT 2.1 中进行固体培养8 10 周后获得增殖芽将芽转至液体培养基MS + NAA 5.4 + IAA 5.1 + KT 2.1 中震荡培养促进增殖,再转到MS + NAA 0.18 固体培养基上生根Zepeda 等[6]将腋芽置于MS + 25%CW(椰乳)液体中转动培养(1r/5min) 并隔2 周将外植体转移到1/2 MS + 25%CW 中进行中间培养2 个月后获得带5 8 片叶单独生长的新芽在1/2 MS + BA 0.5 或1.0 培养基中继代可长出3 个以上腋生新芽同样培养基上继代4 次增殖再转移到1/2 MS 固体培养基上12 个月后至少可从1 个冠芽繁殖出5 000 株小苗1.2 叶的离体培养叶的离体培养通常是经愈伤组织分化成苗林惠端等[7]将冠芽基部叶切段培养于含2,4-D 2.0﹢KT 1.0 或2,4-D 4.0﹢KT 2.0 的MS 培养基中可诱导愈伤组织充分成熟叶肉较厚的叶片基部可获较高的诱导率愈伤组织转移到1/2 MS(铁盐为2 倍) + NAA 1.0 + 活性炭0.5% + 蔗糖2% 可分化出根系发达的绿苗将大苗移植而带少量愈伤组织的小苗用于继代增殖每40 45d 继代一次以25 30 倍的几何级数增殖Mathews 等[5]从无菌小植株上切取完整叶子置于MS + NAA 1.8 + IBA 2.0 + KT 2.1(或BA 2.2)培养基中培养则在外植体切端增生愈伤组织并于其上分化成芽BA 比KT 诱导出更多的芽1.3 果实的离体培养以果实进行离体培养也是经由愈伤组织再分化出芽苗吴昭平等[8]以幼果果肉培养于MS + BA 2.0 + NAA 2.0 的培养基中7 15d 内诱导出团状愈伤组织生长15d 的愈伤组织转移至1/2 MS + BA 0.5 + IBA 1.0 + NAA 0.5 + 蔗糖2%的培养基上半个月后即见绿芽分化移至1/2 MS + NAA 0.5 + BA 0.1 + 蔗糖1%培养基中生根壮苗Wakasa 等[4]将果肉置于MS +肌醇100 + 蔗糖3% + NAA 0.2 2.0 + BA 1.0 培养基上培养时薄片边缘出现五种类型团状组织其中节状体生长最旺盛在NAA 2.0 + BA 1.0 的培养基上长大后转移至NAA 2.0 + BA 2.0 或高于2.0 的培养基上开始分化形成茎在NAA 1.0 的培养基上只形成根除节状体形成茎叶外其他几类团状组织均未能分化出苗1.4 种子的离体培养种子离体培养通常用于杂交苗的快速繁殖种子在无生长调节剂的培养基上可长成小植株在添加一定生长调节剂的培养基上则经愈伤组织分化成苗Srini Vasa Rao 等[9]以Kew和皇后的杂交种子培养于MS + BA 0.1 或MS + IBA 0.1 的培养基上种子发根后从根梢形成愈伤组织而后整个胚转变为愈伤组织其上可观察到初始的茎芽分化移至MS + NAA 2.0 + IBA 2.0 + BA 2.5 培养基上获得带根的茎芽丛再生植株也移栽成功吴昭平等[10] 以沙劳越种和菲律宾种的正反交种子进行离体培养种子的愈伤组织有切口的比无切口的诱导率高愈伤组织的诱导需细胞分裂素和生长素共同作用以6-BA 2.0 + NAA 0.5 + 2,4-D 1.0 培养基诱导率最高达76% 愈伤组织转移到1/2 MS + 6-BA 0.5 + IBA 1.0 的培养基上分化出绿芽再生苗转移到1/2 MS + ZT 1.0 + NAA 0.5 培养基上增殖可获由15 25 个芽组成的芽丛1.5 经黄化苗进行快速繁殖Kiss 等[11]探索了一条新的凤梨快速繁殖途径以卡因种和西班牙种的无菌苗为材料将苗尖去除仅留5 8mm 带根茎段置MS + NAA 1.8(10 M)中暗培养获黄化苗切取﹒72﹒第30卷黄化苗转入N6 + KT 2.5(25 M)或BA 4.5(20 M)培养基光照培养在培养皿中每株黄化苗上生出13 15 株小苗至小苗3 5cm 高时移入生根培养基(不添加生长调节剂的MS 培养基) 获得再生植株并且再生植株中未发现变异株1.6 其他探索为使快速繁殖体系更好地应用于生产研究人员还进行了其他探索在增殖培养中通常认为液体培养较固体培养增殖率高而液体震荡培养增殖率则更高[5,12] 但也有人认为液体静止培养较好[13] 李华赐等从能源和药品节约上进行一些改进黎仕聪等[14]则认为还应建立适宜的二级苗圃以提高成活率2 育种探索2.1 无性变异系Wakasa 等[15]以不同外植体的再生植株系为材料检测其叶色叶背的蜡分泌叶簇密度叶片刺和白条纹的分布方式找出变异植株发现源自果实的再分化植株变异率高徐舜全等[16]以凤梨叶片组培苗与叶片扦插苗进行对比试验发现组培苗种植后发生了明显的变异现象Liu [17]从有刺的嵌合体培养获得了无刺的红西班牙品种通过离体培养产生大量无性变异系可以从中筛选出所需的变异体培育优良品种2.2 杂交种子培养通过人工杂交获得杂交种子经离体培养可以得到大量的杂种苗如前所述一个杂种胚可以形成许多幼苗由于染色体不稳定经由愈伤组织途径繁殖成的幼苗在遗传上可能异质这一技术可以在短时间内从一个胚形成的大量杂种苗中筛选出所需要的变异植株2.3 遗传转化凤梨育种中也进行了转基因的尝试如导入抗性蛋白合成基因增加凤梨对粉蚧的抗性[18] 导入抗线虫基因[19] 导入反义ACC 氧化酶基因[20] 导入抗多酚氧化酶基因防止凤梨黑心病的发生[21]等均已在研究中有些已取得阶段性结果凤梨育种现在仍以传统的杂交育种为主生物技术在育种上的应用还只是一种探索3 种质保存Sugimoto[22]用腋芽直接培养在MS(1% 琼脂1.5%葡萄糖)上16 下可保存4 年以上Zee 等[23]以Hana51 Hana129 (osus)和Hana73 (A.bracteatus)的无菌小苗进行保存研究发现保存于无菌蒸馏水中12 个月后存活率仍可达85%和73% 保存在MS(无机盐取1/4 量) + 3%蔗糖+ 0.9%琼脂的培养基中12 个月后小苗的成活率最高长势最好4 其它凤梨科植物的离体培养其它凤梨科植物的种子离体培养研究较多离体培养铁兰属(Tillandsia)一些植物的种子发现大多数种子在不同温度(15 25 )及添加不同外源生长调节剂的培养基上(NAA 0或0.1 BA 0或1.0), 萌发无显著差异但T. stricta 和T. tectorum 在25 比15 萌发率高10% BA 的存在可诱导芽苗的形成但抑制其进一步生长T. stricta 培养会使培养基pH值在数天内从5.4 下降至3.4 猜测培养基里高酸度水平会使离体材料失去生活力[24,25] Fischer 等[26]以剑凤梨属的2 个种的种子进行培养也获得丛生芽Mercier 等[27]将V. fosteriane 的种子培养在KM MS 1/2 MS 培养基上发芽转至添加NAA 0.2 (1.1 M)培养基上生长第2 期洪燕萍等凤梨科植物的离体培养综述﹒73﹒在添加NAA 0.5 (2.7 M)和BA 1.66 (8.9 M)固体培养基上会形成绿色突起物并发育成芽每株苗可形成15.2 个芽液体继代培养可使芽量加倍再转接到添加NAA 1.0 0.54 M的培养基上中止不定芽的大量形成而使芽生长2cm 长的苗转入添加NAA 0.2 1.1 M 的培养基上可诱导生根巴西特有的濒危凤梨科植物Dyckia macedoi 以其种子离体培养获得的小苗叶基为外植体获得再生植株移栽成活率近100% 且无表型变异[28]Kukulczanka 等[29]将铁兰属剑凤梨属(Vriesea)的几个种及Puya mirabilis 的小苗培养在RM(Reinert and Mohr)培养基上增殖并再生出植株培养基中添加BA 1.0 2.0 有利于腋芽的生长和生根Tombolato 等[30]以羞凤梨属(Neoregelia)的N. carolinae 分生组织诱导再生成植株Vinterralter 等[31]以光萼凤梨属(Aechmea)的A. fasciata 叶片为外植体经愈伤组织分化芽苗并获得稳定的深绿色芽苗无性系这种无性系一直培养到生根其变异率低于1% 深绿色的无性系继代培养超过40 次历时5 年其生活力及变异率仍无明显变化我国也有一些观赏凤梨离体培养的报道如隐花凤梨属(Cryptanthus)的褐叶小凤梨(C. acaulis) 双带隐花凤梨(C. bivittatus)和褐带纹小凤梨(C. lacerdes) 的茎段或芽培养[32,33] 铁兰属的松罗铁兰(T. usneoides)的芽培养[34] 果子蔓属(Guzmania)的红星凤梨(G. minor)的嫩吸芽培养[35] G. minor 的种子培养[36]观赏凤梨的品种繁多进行离体培养研究的还不多而且没有较系统的基础研究和建立较有生产效益的快速繁殖体系此外以离体培养为手段进行变异品种选育种质资源保存等研究也有待开展5 展望食用凤梨的离体培养研究已较为成熟但某些外植体离体快速繁殖中存在较严重的变异倾向[11] Wakasa 等发现源自果实和裔芽的再分化植株几乎都是变异体而源自冠芽和腋芽只有少数变异体选取适当的器官可以达到两种目标即无性繁殖系和培养变异体高原利雄等[37]认为以冠芽进行快速繁殖约有7%左右多刺个体若在幼苗阶段去除多刺个体则快速繁殖具实用价值实际上即便在幼苗阶段去除外型变异的植株也不能保证所有变异个体均已剔除离体培养避免出现愈伤组织可以限制体细胞变异如果以凤梨的腋芽为外植体进行诱导同时以Kiss 等建立的黄化苗方法进行增殖并结合Zee 等的种质保存方法以及其他一些降低成本的方法和移栽技术相信凤梨的快速繁殖体系能达到生产要求此外结合其他技术(如辐射)扩大变异加快育种速度或进行转基因探索有望获得可应用于生产的优良品种另外在观赏凤梨的离体培养可以食用凤梨为借鉴应用离体快速繁殖和无性变异系育种等方法取得更好的经济效益参考文献[1] 黎美华,等. 我国凤梨品种资源及利用[J]. 广东农业科学, 1993,(1): 20-23.[2] 陈京. 凤梨应用生物技术于育种改良上的进展[J]. 福建果树, 1997,101(3): 32-33.[3] Aghion D, et al. 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第十六章植物离体培养育种
类别 －依外植体的不同划分
胚胎培养 （embryo culture）未成熟或成熟了的胚 器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶
原基、花原基、或花果的未熟部分
组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束
形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等
原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工
作。
第十六章植物离体培养育种
外植体（Explants）
由活植物体上切取下来的可以用于组织培养的组织或器官
初代培养（Primary cultห้องสมุดไป่ตู้re）
指外植体的最初培养
继代培养（Subculture）
将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反 复多次移植的培养，称为继代培养
➢ 生长周期短，繁殖率高
植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不 同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。 总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱 病毒种苗。
➢ 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温 度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和 高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。
生物技术的概念： 是指应用生物科学的理论、方法和技术，按照人们设计的蓝 图，改良和加工生物，或用生物及其制备物作为加工原料， 以提供所需制品为人类社会服务的综合性科学技术。 生物技术与育种结合形成作物育种生物技术
﹢＝
第十六章植物离体培养育种
苏云氏杆菌 产生毒害剂的基因 除害剂基因与质粒结合
基因重 组
B5培养基 是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计 的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的 生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长 更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。
植物离体培养育种案例
细胞分裂素
0.5或1mol/L的HCl+微热
CTK母液可以在冰箱中保存几个月，在长时间的实验中，也可能被分解。 KT和ZT在120C处理1小时仍能稳定存在，BA100C时20分钟。
赤霉素 溶于水，pH5.7但不稳定，用95%的酒 在碱性条件下精，GA变成无活性的异构体，在强酸性环境和高温下，GA也
变成无活性的形式。GA热不稳定，114C处理20分钟降低其活性达90%， 母液需制备新鲜的，并且采用过滤灭菌。
同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。 总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱 病毒种苗。
➢ 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温 度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和 高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。
培养基的基本成分
包括无机成分和有机成分。无机成分包括大量元素和微 量元素。有机成分主要包括糖类、维生素、氨基酸和酰胺 类、含氮碱基、生长调节剂、自然复合物（如水解蛋白、 酵母提取物、果肉和果汁等）以及其他成分如琼脂等。
培养基成分的性质
植物对无机盐类的需求具有广泛的一致性，偶然加 以变动。一般多采用蔗糖。维生素中最关键的是B1， 一般用量为0.1-0.4毫克/升。氨基酸和酰胺只用于某些 组织培养，而在器官增殖阶段加入腺嘌呤也可能是需 要的。关键的有机成分主要是激素和细胞分裂素。
微量元素
Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo 用量少，过多容易导致中毒
激素
❖细胞分裂素
促进细胞分裂和分化不定芽 6-BA、KT、ZA、2iP
❖赤霉素
抑制愈伤组织形成，促进芽的形成GA3
❖生长素
诱导细胞的分裂和根的分化 IBA、IAA、NAA、2,4-D
幼儿园科学小达人：植物育种实验与观察研究案例
幼儿园科学小达人：植物育种实验与观察研究案例在幼儿园科学教育中，植物育种实验与观察研究是一项非常有趣和富有启发性的活动。
通过这样的实验，幼儿可以学习到植物生长的基本规律，培养科学探究的兴趣和能力。
在这篇文章中，我们将深入探讨幼儿园科学小达人在植物育种实验与观察研究中的案例，并共享我们对这个主题的观点和理解。
案例一：豌豆的杂交实验在幼儿园中，通过豌豆的杂交实验，可以让幼儿了解到遗传规律。
在这个实验中，可以选择两种不同颜色的豌豆进行杂交，然后观察它们后代的颜色比例。
这样的实验可以帮助幼儿理解到父母的基因是如何传递给后代的，也可以引导他们思考植物的生长和繁殖规律。
观点和理解：这样的实验对于幼儿的科学素养和思维能力的培养非常有益。
通过亲自动手进行实验，可以让幼儿更加深入地理解遗传规律，激发他们对科学的兴趣。
案例二：植物生长观察幼儿园的植物生长观察是一个持续的项目，通过观察植物的生长过程，幼儿可以逐渐了解植物生长的基本规律和生命力。
在这个项目中，可以选择不同种类的植物，比如花卉、蔬菜、水培植物等，让幼儿观察它们的生长过程，记录生长的变化，并与伙伴们共享观察结果。
观点和理解：通过植物生长观察项目，幼儿可以培养对自然界的敬畏和关爱之情，也可以学会用心观察和记录，锻炼他们的观察和记录能力，同时也可以让他们更好地理解生命的奥秘。
案例三：果树嫁接实验在果树嫁接实验中，幼儿可以学习到植物的繁殖和生长技术。
通过观察果树嫁接后的生长情况，可以了解到嫁接技术是如何实现不同品种的结合和繁殖的。
这样的实验不仅可以增进幼儿对植物生长的理解，还可以培养他们的动手能力和耐心。
观点和理解：果树嫁接实验可以激发幼儿的创造力和实践能力，培养他们对技术的兴趣和理解。
通过自己动手进行嫁接，可以让幼儿更加深入地理解植物的生长和繁殖方式。
植物育种实验与观察研究是幼儿园科学教育中的重要环节，它可以培养幼儿的科学素养和思维能力，激发他们对自然的好奇心和探索欲。
菘蓝叶片的离体培1
菘蓝叶片的离体培养学院：农学院班级：生物技术2012-3 姓名：康莎莎学号：20126268指导教师：倪苏刘凡摘要：本实验以菘蓝幼嫩叶片为外植体，为研究不同外源激素种类、组合及其不同浓度对菘蓝叶片丛生芽诱导的影响，通过对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养.结果表明，在MS培养基的基础上添加6-BA+NAA都能成功诱导出丛生芽；但当添加激素为2,4-D+KT的培养基中，2, 4-D对菘蓝叶片的愈伤组织的形成具有一定的抑制作用,并且对于丛生芽的形成也有较强的抑制作用。
但是对于其最强抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。
关键词：菘蓝叶片；离体培养；激素配比；愈伤组织；芽菘蓝(Isatis indigotica Fort．)为十字花科(Cruciferae)菘蓝属植物。
以根入药，药材名板蓝根[1]。
原产中国。
主产河北省安国，江苏省如皋、南通[2]。
其根(板蓝根)、叶(大青叶)均可药用。
具有清热解毒、凉血的作用，对于医治发烧、发斑、风湿感冒、咽喉肿烂、肝炎、腮腺炎等多种疾病，均有较好的疗效[3]。
以往对菘蓝的研究多集中于其根——板蓝根化学成分和药理作用[4-6]。
但板蓝根作为一种用量极大且长期销售不衰的药材，市场需求特别大。
迫切需要快速生成大量且无病毒植株来满足市场需求，因此人民逐步将植物组织培养这一新技术应用于菘蓝。
有关菘蓝的植物组织培养，前人已经做了一些阶段性研究[7,8]。
如余绍华用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎的组织培养为外植体[3]，陈秋芳、孟玉玲等以叶片为外植体，陈薇等以下胚轴为外植体建立了菘蓝的快速繁殖体系[9-11]，张胜珍研究了菘蓝叶片原生质的游离、纯化[12]，张菊红等应用正交设计方法[13]，对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。
本实验，将对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养，观察不同激素配比对菘蓝叶片愈伤组织的形成和芽的分化的影响，对其诱导分化的速度和诱导率进行分析，从而为进一步优化现有对菘蓝的组织培养技术提供重要的参考依据；同时也为菘蓝的优质育种、转基因及遗传研究等工作奠定基础。
(第五章)第六章 植物离体茎尖培养与培育
第三节 茎尖培养脱毒
（二）茎尖培养脱毒方法的建立、发展和应用 最早，由Holmes(1948)通过茎尖扦插的方法，由 受侵染的大丽花中获得了无病毒植株。Morel和 Martin（1952）根据这一原理，建立了消除病毒 的茎尖培养方法。此后，茎尖培养方法得到迅速发 展，现已成为最有效的获得无毒植株的方法，已成 功用于多种栽培作物。利用茎尖培养不仅可以消除 病毒，还可以消除植物体中多种其它病原菌。目前 该技术已在农业生产上得到广泛的应用。据不完全 统计，用茎尖培养方法已成功对60多种植物的100 多种病毒进行“脱毒”。
第二节 防治病毒的方法
处理温度和时间因植物种类和器官生理条件等 不同而异。短则几十分钟，长则达数月。在热 处理初期，空气温度必须逐步升高，直至达到 所要求的温度为止。被处理的植株必须含有充 足的有机养分。同时，处理室内要维持合适的 相对湿度和光照。 考虑到连续长期在为病毒钝化所需要的高温中， 对寄主组织会带来危害，因此，也有采用高、 低温交替处理方法。
第三节 茎尖培养脱毒
在材料接种前可结合进行“温热处理”：
对母株，在35～38℃中热处理5～10周；
对马铃薯，将块茎在37～38℃中处理1个月。
第三节 茎尖培养脱毒
(五)脱病毒植株的检定
常用的检测方法有5种： 1、植株直观测定法： 2、指示植物测定法 3、电子显微镜观测法 4、血清学方法 5、分子生物学检测法
第三节 茎尖培养脱毒
3、接种。茎尖剥取完毕后，用锋利的解剖 刀，小心切取所需大小的生长锥，一般为 0.2～0.5mm，带有1～2个叶原基，并随 即接种于适宜的培养基上（参书P8-12，表 8-2）进行培养，每瓶接种1个茎尖。 4、培养。培养基成分及培养条件基本与离 体茎培养相似。但由于茎尖比较小，故培养 基中的无机盐浓度可以适当降低；但适当提 高K+的浓度有利于芽的分化。
菘蓝叶片离体培养及植株再生 作业
激素对菘蓝叶片组织培养的影响姓名：张亚洲专业：农学（本硕连读）班级：10-1 学号：20100099指导老师：刘帆倪苏摘要：本研究以菘蓝叶片为外植体，为了研究不同激素及其组合对菘蓝离体叶片的生长的影响，通过对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养,发现在相同浓度的6-BA+NAA培养基中NAA在诱导丛生芽中，适宜低浓度的NAA有助于丛生芽的发生且丛生芽诱导效果好，生长健壮，并在适当的范围内随着浓度的升高对丛生芽的生长的抑制作用加强；在相同浓度的2,4-D+KT培养基中，2,4-D对菘蓝叶的愈伤组织的形成有一定的抑制作用，并且对于丛生芽的形成也有较强的抑制作用。
但对于其最强的抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。
关键词：菘蓝叶片；激素配比；比较培养；愈伤组织；芽。
菘蓝( Isatis indigotica Fort. )是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源植物，具有清热解毒、凉血利咽、解热、抗炎的功效，广泛用于各种方剂[1]。
以往对菘蓝的研究多集中于其根——板蓝根化学成分和药理作用(7,8,10）。
但由于板蓝根作为一种用量极大且长期销售不衰的药材，市场需求很大。
迫切需要生产大量且无病毒植株来满足市场需求，因此人们逐步将植物组织培养这一新技术应用与菘蓝根。
有关菘蓝的组织培养前人已经做了一些阶段性研究[11,12],如余绍华用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎为外植体[2]，陈秋芳、孟玉玲等以叶片作外植体，陈薇等以下胚轴为外植体建立了菘蓝的快速繁殖体系[3-5]，张胜珍研究了菘蓝叶片原生质体的游离、纯化[6]，张菊红等[9]应用正交设计方法,对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。
本研究，将针对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养,观察不同激素配比对菘蓝叶片愈伤组织的形成和芽的分化的影响，对其诱导分化的速度和诱导率进行分析，从而为进一步优化现有对菘蓝的组织培养技术提供重要的参考依据。
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固体培养发展到液体振荡或旋转培养 悬浮培养、液滴培养、双层培养、包埋培养
培养基不断改进
White培养基、MS培养基、MT培养基等
实验手段逐步完备
植物组织培养在农业上的应用
倍性育种：花药培养、胚乳培养 突变体筛选：愈伤组织培养 创造新种质：细胞融合
克服胚败育：胚培养 植物性药物和生物制品的生产
组织培养的意义
胚胎培养 主要克服远缘杂交中胚不能在种子中正常发
育而早期败育的问题。
胚珠和子房培养 进行试管内受精和杂种胚的分化成长，
以克服不育性和不亲和性等障碍。
细胞及组织培养 进行优良单系的快速繁殖，自交不亲
和系、雄性不育系的无性繁殖，突变体的诱导与分离及 种质的保存和运输等方面。
花药及花粉培养 单倍体育种，加速获得纯二倍体。 原生质体培养 进行体细胞杂交、核移植和核置换等工
技术用途
快繁：人工种子、茎尖培养 脱毒：微芽嫁接、茎尖培养 克服杂交不亲和：花药培养、细胞 融合 种质资源保存和交换：愈伤组织培养、茎尖培养
利用植物体的器官、组织或细 胞，通过无菌操作接种于人工配 制的培养基上，在一定的光照和 温度条件下进行培养，使之生长 发育的技术称为组织培养
组织培养的类型
• 按培养材料分为（Gamborg等)：
愈伤组织培养
最为常见的组织培养
细 胞 培养 器 官 培养
悬浮细胞培养 单细胞培养
原生质体培养
胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、 叶、花和幼果的部分组织的培养
（分离出的体细胞/花粉细胞/卵细胞）
原生质体培养 除去细胞壁的原生质体
发展简史
➢ 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细 胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植 株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的 技术程序奠定了基础。
➢ 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养中筛选出至今 仍被广泛使用的MS培养基。
同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。 总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱 病毒种苗。
➢ 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温 度、光照、湿度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和 高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。
➢ 1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗 花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。
➢ 1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养， 获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。
植物组织培养在技术上的发展
研究材料范围逐步扩大
胚、胚轴、子叶、幼苗、茎尖、根、叶等； 动物细胞+植物细胞/微生物原生质体
离体的植物 脱分化 器官、组织、
细胞
愈 再分化 根 伤
组
织
芽
植 物 体
植物 组织 培养 过程
植物组织培养特点
➢ 培养条件可以人为控制 组织培养摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气
候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳 定地进行周年培养生产。
➢ 生长周期短，繁殖率高 植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不
作。
愈伤组织培养是最为常见的组织培养方式？
➢愈伤组织（Callus）： 原指植物在受伤后，于伤口表面形成的一团薄壁细胞。 在组织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的 一团无序生长的薄壁细胞。
➢原因： 1. 大部分组织培养经历callus再生途径长出植株； 2. callus可以用于悬浮培养和原生质体培养。
潜在全能性的原因：基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的 营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出 全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程， 就是植物组织培养。
植物细胞全能性的表达
脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停 止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来， 恢复细胞的分裂活性。 再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一 定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
第六章 植物离体培养育种 Tissue culture and breeding
§1 植物离体培养发展简史、意义和生物学原理
组织培养的概念
组织培养（Tissue culture） 是指用无菌方法使植物体的离 体器官、组织和细胞在人为提 供的条件下生长和发育的所有 培养技术的总称，也称之为离 体培养（In vitro culture）。
类别 －依外植体的不同划分
胚胎培养 （embryo culture）未成熟或成熟了的胚 器官培养（organ culture）根尖、茎尖、子叶、叶片、叶
原基、花原基、或花果的未熟部分
组织培养或愈伤组织培养（狭义，tissue culture）维管束
形成层、贮藏薄壁组织及愈伤组织等
细胞培养 单个游离细胞
生物学原理
植物的再生作用：植物的根、茎、叶等器官、组织和细胞 都具有再生成完整植株的能力。其是无性繁殖的基础， 它是受内源激素调控的。人工控制和调整培养基成分， 可使其发育成完整的植株。
细胞的分化和形态发生：指细胞在分裂过程中发生结构和 功能方面的改变，从而在植物个体发育过程中形成各类 组织和器官，完成整个生活周期。
组织培养的类型
• 按培养方法：固体培养、液体培养、看护培养、微室培 养、包埋培养等
• 按培养过程：初代培养、继代培养
外植体（Explants）
由活植物体上切取下来的可以用பைடு நூலகம்组织培养的组织或器官
初代培养（Primary culture）
指外植体的最初培养
继代培养（Subculture）
将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中，这种反 复多次移植的培养，称为继代培养
生物学原理
植物细胞的全能性（totipotent）：是指植物每个细胞都
具有该植物体的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套 遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从 理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的 细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。