植物组织培养 (2)
组织培养技术2
在液氮（-196℃）条件下，加入冷冻保护剂，可使组织培养物的代谢水平降低，有利于细胞、胚状体、试管苗、愈伤组织等的长期保存。据报导，冷冻保存的胡萝卜胚状体，在保存1年后仍有再生成植株的能力，有些国家已利用此方法建立了种质库，但我国在这方面仍是空白。 在国际上一个新的动向是"人工种子"的试验。所谓"人工种子"，是指以胚状体为材料，经过人工薄膜包装的种子。在适宜条件下它萌发长成幼苗。据美国遗传公司报道，美国科学家已成功地把芹菜，苜蓿，花椰菜的胚状体包装成人工种子，并得到较高的萌发率，这些人工种子已生产并投放市场。我国科学工作者成功地研制成水稻人工种子。可见，组织培养将在遗传育种、作物改良和改革作物栽培中获得更大的成效。编辑本段前景展望 由于生产方法独特，且都是在人工无菌操作和近期温的环境条件下进行大规模的人工培养和工厂化生产，因此组织培养技术对食物资源的保质、保纯和反季节生产有着特殊作用，因而有望成为农产品工厂化生产的基本内容，预计在本世纪将形成大产业。 这种技术可以使一棵幼芽同时培育出千百棵幼苗，而且培养出来的幼苗性状都一样的。还可以用于许多地方。
解散
简述
是在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。 美国在20世纪中期应用组培技术而获得的芹菜苗已成苗地取代了种子繁殖的传统方法。我国目前在番茄、辣椒、马铃薯、生菜、人参和果品生产中也已广泛投产应用。
原理
植物组织培养的原理是细胞全能性。也就是说每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。 组织培养基于此原理就可以将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。编辑本段植物组织培养条件 1.愈伤组织的培养条件：必须无菌操作 2.材料：刚生长不久，具有高度分裂能力的茎尖，芽尖，感染病毒的机会很小 3.植物细胞全能性，确保组织能培养成植株。 4.在无菌操作室中完成接种工作，然后放于培养室[光照（日光灯照射），温度（30度）]中培养。所以说完成操作后，在培养室中培养时就需要光照条件了。编辑本段组织培养的意义（一）增加遗传变异性，改良作物
6 植物组织培养实验二PPT课件
谢谢你的到来
学习并没有结束，希望大家继续努力
Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
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2、无菌操作要注意：每次操作前， 将双手用酒精棉球擦拭消毒；镊 子、解剖剪刀等金属工具用火焰 烧过灭菌，冷却后方可使用；尽 量减少无菌三角瓶或培养皿在空 气中的暴露时间；所有无菌操作 尽量快速完成，并要求在酒精灯 附近进行。
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3、请先在自然条件下练习外植体解剖， 分割成0.5cm2左右的小块（段），经操 作熟练，检查无误后，再进行无菌解 剖分割及接种，以减少植物材料染菌 或失水死亡的机率。
欢迎同学们进入奇幻的植物组织培养实验世界
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植物组织培养实验Ⅱ——— 外植体取材﹑表面消毒与接种
实验目的 实验原理、基本知识 实验用品、材料 实验要求 实验内容 、方法 实验报告——作业 下一次实验预告
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一、实验目的
1、掌握无菌操作技术，加深对无菌操作的了
解；
2、掌握常规的植物细胞组织培养技术，达到 能独立操作的能力
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7、打开三角瓶——铝箔纸的拿法
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8、瓶口在火焰上烧过
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9、铝箔纸的放法
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10、镊出黄瓜苗
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11、镊出黄瓜苗
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12、放入培养皿中
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13 、
黄 瓜
幼 苗 形 态
生 长 点
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——
14、剪取茎段
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15、剪好的外植体
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16、黄瓜切块的接种
第二章(2)植物组织培养操作技术
第二章(2)植物组织培养操作技术1 灭菌用物理或化学方法，杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体，即所有生命的物质全部杀死。
2 灭菌方法2.1培养基灭菌一般高压湿热灭菌，某些激素、维生素采用过滤灭菌。
2.2玻璃器皿灭菌干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h；湿热灭菌：121℃, 20～40min。
接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
2.3接种工具灭菌用前干热灭菌：160～180℃,1.5～2.0h；用前湿热灭菌：121℃, 20～30min。
接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
2.4实验服、口罩、滤纸灭菌湿热灭菌：121℃,20～30min。
实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。
2.5接种室灭菌紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20～30min。
臭氧灭菌机：1～2h；熏蒸灭菌：5～8ml/m3甲醛+5g/ m3高锰酸钾；冰醋酸；1～3%高锰酸钾或3%来苏儿。
接种台喷雾消毒：75%酒精。
2.6接种材料灭菌灭菌步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润灭菌，最好加吐温-80等表面活性剂(灭菌液的0.5%)，一般70%酒精30S，0.1～1%升汞5～8 min。
③无菌水冲洗3～5次。
2.7物体表面灭菌2.7.1灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌2.7.2范围：桌面、墙面、双手、材料表面2.7.3消毒剂：70%酒精；1～2%来苏水；0.25～1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-802.8培养室灭菌新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次。
隔2～5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
3无菌操作3.1作好接种前准备3.1.1接种室的灭菌3.1.2超净工作台的灭菌3.1.2.1 开风机前将紫外灯打开30min以上3.1.2.2 之后开风机15min3.1.2.3 用95%酒精洗工作台面3.1.3接种器皿、用具的灭菌用具先用95%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧。
04第四章植物组织培养技术(二)
（1）环境要求远离污染源 （2）水电、交通 （3） 工艺流程 （4）节能（5）无菌
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3.商业化生产的配套设施
相应配套设施包括过渡培养室和露地炼苗场。
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4.商业化生产的工艺流程
试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程 序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生产 流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立起来 的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培养和驯 化等条件外，还应增加病毒鉴定室。
导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰 科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁 殖材料的遗传稳定性。
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2.增殖培养基
增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要 指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量 的有效繁殖体。
基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞 分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长培养基。 一般MS+BA 1~3 mg/ml+NAA0.1~1 mg/ml。
①繁殖速度较快。②遗传性不稳定，已产生变异。③愈伤组织 是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料
• 器官发生型也是许多植物快繁的主要方式。由于不 定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛 生芽发生型。 • 但经过愈伤组织途径或者多次继代培养后，容易导 致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率。如香 蕉继代次数控制在8代之内，再生植株的变异率则 可控制在3%左右。
• 根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根 系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。 • 叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽 要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延 缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。
【安徽】中职农业生物技术(主编曹春英、丁雪珍第二版 高教版)教案：第二章 植物组织培养技术04
第三节植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节植物组织培养操作技术（2）。
二、学时安排2学时。
三、教学目标1．掌握培养基的作用。
2．掌握培养基中生长调控物质的作用。
3．了解培养基的类型。
四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。
难点：培养基中生长调节物质的作用。
五、教具电化教学设备。
六、教学方法讲授法，演示法。
七、教学过程Ⅰ.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。
II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。
配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。
没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。
（二）培养基的种类1.培养基的种类划分2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
常用的培养基配方：表1 常用培养基配方只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。
常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物来提供。
第二章植物组织培养基本原理
第二节 植物的脱分化
一、愈伤组织的形成
1、形成条件： ① 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 ② 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作
用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体 的不同生育期等条件也很重要。
诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（α-萘乙酸），IBA（吲
第二章 植物组织培养的基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。
第二章植物组织培养基本原理
分裂期
第二章植物组织培养基本原理
(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的 区域。
第二章植物组织培养基本原理
5、 愈伤组织的生长过程的特点：
1）体积、重量： 2）生理生化特性：
诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量 减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。 即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
第二章植物组织培养基本原理
二、细胞分化：
分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化
是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方 式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑 制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。
植物组织培养综合实验2
通过满天星等的茎尖培养获 得完整的幼苗，学会茎尖组培快 繁的基本原理和操作技术。
实验原理
植物组织培养的原理: 植物细胞的全能性.
茎尖离体快繁技术
植物的茎尖和腋芽在适宜的培养基上，在合 适的激素条件下，其生长点分化形成大量芽并 能形成良好的苗。苗经诱导可长出根而形成完 整的植株，这就是茎尖组培快繁。此技术已广 泛用来繁育那些不能形成种子进行繁殖或难以 繁育的花卉杂交品种或其它具有重要经济价值 的植物，由于病毒一般不侵入生长点细胞，因 此，这种方法也广泛用来脱病毒获取脱毒苗。
室实 验
选材：材料类型、大小，年龄与发育状况等 修剪：去除较老和脏的叶片，尽量减小体积，减少污染 清洗：自来水冲洗，2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗
无 菌 间 室培 养
灭菌：75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水
冲洗3-5次。
无菌修剪：用无菌镊子和剪刀进一步去除多余的叶片，
依据需要切割成相应大小的茎段（带2-3个叶片）。
接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个
材料/瓶
培养：25 ℃，光照培养
观察记录：污染，生长状况，分枝
实验结果与分析
培养过程请进行下列观察和记录:
1、污染情况：内生菌污染？外源菌污染？ 2、茎尖诱导情况，分枝状况，诱导率。 3、幼苗生长状况：弱小？健壮？玻璃化？
褐化？
理论基础
利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、 腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离 体培养。在短期内获得大量遗传性一致的个体 的方法（技术）称离体无性繁殖，由于这种方 式得到的植株群体来自一个单株（或一个单 芽），它们的遗传组成相同，这些株群可称单 株无性系或单芽无性系。 优越性：
高二生物《植物的组织培养技术》
一、基本过程−−−→−−−→→脱分化再分化外植体（离体的组织、器官或细胞）愈伤组织根、芽或胚状体完整植株1.外植体由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体。
一般取植物幼嫩部位（如茎 尖）或花药等。
2.愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。
其特点是：排列疏松、无规则、高度液泡化、呈无定形状态的薄壁细胞，具有未分化特性。
知识点睛第10讲 植物组织培养技术愈伤组织形成过程中，没有叶绿素和叶绿体的形成，所以愈伤组织形成初期不需要充足的光照。
通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l来诱导植物材料愈伤组织的形成。
3.胚状体胚状体是在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚的发生和发育过程，形成与合子胚相类似的结构。
一般专指在组织培养条件下产生的非合子胚。
诱导胚状体需要的条件，因植物种类、部位和培养时组织细胞所处状况的不同而异。
胚状体的诱导与外植体所处生理状况，内源激素的变化及遗传性、倍性等都有密切关系。
①胚状体的产生不需要任何激素，如烟草、曼陀罗和水稻等的花药培养。
②培养中需要生长激素或细胞分裂素或二者的组合，如檀香和石刁柏的愈伤组织培养。
③需先在有激素的培养基上诱导，然后转入低浓度激素或无激素的培养基中，如胡萝卜在诱导愈伤组织时需2,4-D，但由愈伤组织诱导出胚状体时，则需在没有2,4-D的培养基培养。
④某些天然产物，如椰乳，西瓜汁，酵母提取物，酪朊水解物或腺嘌呤等都有利于胚状体的发生。
二、理论基础：植物细胞的全能性1. 细胞全能性的定义：指已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。
2. 在生物的生长发育过程中，细胞并不表现出全能性，而是分化成各种组织和器官。
3. 细胞具有全能性的原因：含有该种生物全部遗传信息。
4. 细胞的全能性高低比较：①一般，细胞分化程度越高，全能性越低②受精卵>生殖细胞>体细胞③植物体细胞>动物体细胞三、条件1.离体2.无菌3.一定的营养物质：水、无机盐、蔗糖（提供碳源和调节渗透压）、维生素等4.植物激素在配制好的培养基中，常常需要添加植物激素。
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次生代谢物生产:利用组织和细胞的大规模培养，可以生产人类需要的一些天然有机化合物
植物种质资源的离体保存
优点：节约人力、物力和土地，防止有害病虫的传播，便于种质资源的交换和转移
培养基的成分
水
矿质元素
碳水化合物
生理活性物质
生长调节剂
附加物
天然添加物
水
水质软化装置
离子交换
外植体的选择
地上部比地下部清洁。
外植体越小，克服特殊植物病理问题的机会越大，但同时也降低了存活率。
内部的组织比外部的不易受到污染。
不同外植体反应不总是相同
外植体的灭菌
1.根据培养容器大小将材料切割成适当大小；
2.流水（自来水）冲洗植物表面；
3.在酒精中晃动几秒钟；
4.HgCL2（0.1～1%）＋吐温（润湿剂）2滴/100ml：3～5min；
5.用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗；
6.商业漂白剂7~15%＋吐温2滴/100ml：10～30min；
7.再用经过高压灭菌的蒸馏水冲洗几次
培养条件
温度
光照:光周期和光强
湿度
气相条件
铁盐单独配制，一般用硫酸亚铁和EDTA-Na2通过加热形成稳定的螯合铁贮存。
生长素类先用少量95％乙醇或1mol/L NaOH加热助溶后，用水定容。
细胞分裂素类先用少量1mol/L盐酸溶解，再用水定容
培养基制备
加一定量水，依次加入需要量的母液。
加入需要量的蔗糖，溶解，定容。
调节pH值。
加入需要量的琼脂，加热溶解（要不断搅拌）。
氨基酸及其酰胺类-----有机氮源、缓冲作用、调节体内平衡
单核苷酸
植物生长调节剂
六大类植物激素
生长素
细胞分裂素
赤霉素
脱落酸
乙烯
油菜素内酯
生长素/细胞分裂素相互作用
生长素－细胞分裂素比率关系，用于组培中决定芽和/或根的形成
细胞分裂素对生长素的浓度比值高时，倾向于形成芽
生长素细胞分裂素的浓度比值高时，倾向于形成根
优点：多用于抗性筛选
成果：已选出一些抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白的突变体，有些已用于生产
培育远源杂种
胚培养可克服受精后障碍导致的远源杂交不孕，产生远源杂交后代，育成新物种.苹果,梨,大白菜和甘蓝、栽培棉和野生棉
原生质体融合可克服有性杂交不亲和性，获得体细胞杂种.马铃薯和番茄、烟草和龙葵
基因工程育种
农杆菌介导法、基因枪法均基于植物组织培养技术。
研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等
德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说
反向渗透蒸馏
矿质元素
大量--氮、磷、钾、钙、镁、硫
微量--铁、锰、硼、锌、铜、钼
碳水化合物
作用：提供碳源、维持渗透压
通常碳源用蔗糖
低浓度（1.5～2.5％）的糖有利于木质部的生长；
高浓度（3～4％）有利于韧皮部
生理活性物质
维生素-----作用：辅酶
肌醇-----作用：帮助活性物质发挥作用，使培养物快速生长，促进胚状体及芽的形成
分装：在琼脂未凝时（40℃左右凝固）分装，量一般为容器的1/4～1/3，注意不要沾到容器口。
封口。
灭菌。
存放。
注意事项
不能高压灭菌的物质，在灭菌后温度下降但琼脂尚未凝固时，在无菌条件下，用过滤除菌法加入。
配好的培养基一般应在两周内用完
外植体:从需要培养的母株分离的一小块植物材料
接种体:已经培养的植物材料用于继代培养
德国植物学家Haberlandtቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ1902年提出了植物细胞具有全能性
李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。
1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术
Guha和Maheshwari等——花药培养
Cocking等-原生质体培养
Carlson等——原生质体融合
植物组织培养的应用
1）便于贮藏和运输、可直接播种和机械化操作；
2）可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质
培育新品种或创制新物种
单倍体育种
离体选择突变体
培育远源杂种
基因工程育种
单倍体育种
手段：花药和花粉培养
优点：所有基因均能表现，基因型可快速纯合
成果：已育成大面积种植的品种
离体选择突变体
手段：愈伤组织、悬浮培养细胞易变异、细胞数量大，有利于突变体筛选
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养
离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件
外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞
愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织
植物组织培养的特点
1.组培技术是无菌操作技术。
2.组培材料处于完全的异养状态。
3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。
4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根
快繁和脱毒
育种
次生代谢物生产
种质保存
在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用
离体快繁（试管苗和人工种子）
试管苗特点
繁殖系数大、速度快，苗木整齐一致，周年生产
人工种子
指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。
具有试管苗的优点外，还具有以下优点：
两种激素的比值处于中间水平时增强愈伤组织的形成
附加物:
胶凝剂
螯合剂
渗透剂
活性炭
其他
天然添加物
椰乳,水解酪蛋白,酵母提取液
作用：提供天然微量营养成分、生理活性物质和生长调节剂等
缺点：成分不确定，影响实验重复性
母液（贮备液）注意事项
各种药品要充分溶解后才能混合。
混合时要注意先后顺序，避免相互结合生成沉淀。
5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。
6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调
植物组织培养的研究类型
组织培养
器官培养
胚胎培养
细胞培养
原生质体培养
植物组织培养的研究任务