GST pulldown手册—翻译
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
gst pull down技术原理
gst pull down技术原理嘿，咱今儿个就来讲讲 gst pull down 技术原理哈！你说这技术啊，就像是一场奇妙的魔术表演呢！gst pull down 技术，简单来说，就是让两个蛋白能够亲密接触，然后把它们一块儿给“揪”出来。
这就好比是在一个大派对里，我们要找到特定的两个人，然后把他们拉到一起。
想象一下哈，细胞里面有那么多的蛋白，就像派对上的一群人，熙熙攘攘的。
而我们的 gst 标签呢，就像是一个特别的标记，能让我们一眼就认出我们要找的那个蛋白。
这可太重要啦，不然在那么多蛋白里找，不就像大海捞针嘛！然后呢，我们把带有 gst 标签的蛋白和其他蛋白放在一起，让它们相互作用。
这就好像是给他们创造机会，让他们互相了解，看看能不能擦出点火花来。
一旦它们结合在一起了，嘿，我们就可以通过特定的方法，把它们一块儿给拉下来。
这感觉就像是用一个神奇的网，把那两个有缘分的蛋白给网住啦！你说这技术妙不妙？它能帮我们搞清楚蛋白之间的关系，就像搞清楚人与人之间的关系一样重要呢！通过 gst pull down 技术，我们能知道哪些蛋白是好朋友，哪些蛋白可能有点小矛盾。
这对于研究细胞的各种活动可太关键啦！比如说，在细胞的信号传导过程中，不同的蛋白要相互配合才能完成任务。
要是没有 gst pull down 技术，我们怎么能知道哪些蛋白是一起干活的好搭档呢？而且啊，这技术还能帮我们发现新的蛋白相互作用呢！就像是在派对上发现了以前不认识的有趣的人，然后发现原来他们和我们的好朋友也有联系。
你看，gst pull down 技术不就是这样一个神奇又实用的工具嘛！它能让我们深入了解细胞这个神秘世界里的各种关系和秘密。
总之啊，gst pull down 技术真的是科研领域里的一把利器，它让我们对蛋白世界的探索变得更加容易和有趣啦！它就像一盏明灯，照亮我们在细胞世界里前行的道路，让我们能不断发现新的惊喜和奥秘呢！你说这技术是不是超厉害的呀！。
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
GST-pulldown操作说明
GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。
2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMTriton X 100 0.1%DTT 1mMpH 7.5注意：操作轻柔，避免beeds的损失；超纯水清洗注射器避免交叉污染。
3、分别在对照组和实验组中加入等物质量的GST（25kD）蛋白和GST-cdc48（130kD）蛋白,其中GST蛋白为20μg，GST-cdc48蛋白为20*（130/25）=104μg。
4、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。
5、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
6、对照组和实验组分别加入5倍摩尔数的Rpn11蛋白，Rpn11蛋白的量为20*（51/25）*5=200μg。
7、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。
8、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
9、使用Wash buffer 1 洗涤三次，每次500μL，操作如前。
换用500μL Wash buffer 2再洗涤一次，彻底吸除buffer。
Wash buffer 2 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMDTT 1mMpH 7.510、再往对照组和实验组分别加入30μL 2×SDS PAGE loading buffer，混匀，沸水煮5min。
12000rpm离心三分钟，取10μL点样跑小孔聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶泳道图如下。
11、其中Input上样量为GST-pulldown 的1/5.。
(完整word版)GST_pull_down试验方法(自己总结),推荐文档
12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。
（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。
（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。
（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。
（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。
12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
GST-pull-down操作流程
GST pull down操作流程一、表达GST融合蛋白1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜2、5ml菌液加入400ml LB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.83、取1ml菌液保存于Ep管中，sample14、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample26、诱导后的收菌，6000rpm×8min 4度，去尽上清，置于冰上7、加入20ml，－20度预冷的PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100 PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀8、（1）压力破碎仪破碎（2）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总20分钟。
至裂解液清澈9、14000rpm，20分钟，4℃离心，分离上清，取50ul sample310、取GST-Beads（400ul）到柱子管中，用预冷的PBS洗去其中的Triton－x－100，加上清（？），4度，旋转孵育1h如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管，加细菌裂解液1ml11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率12、用-20度预冷1％的Triton－x－100 in PBS洗3次，PBS洗3次1000转 2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次）13、用大枪头剪去少许（beads：PBS=1:1）,吸出10ul跑样，检测纯化情况14、sample1，2，3，4加sample buffer，100度 10min，12000rmp 30sSDS－PAGE 每样10ul15、4度保存GST－pro-beads（如果不做pull-down,可以洗脱）sample1：诱导前sample2：诱导后sample3：上清sample4：纯化后上清二、裂解细胞1、收集细胞（胰酶处理好，防止细胞破碎）1000rmp，5min，RT2、PBS 洗，离心1000rmp，5min3、加400ul IP lysis buffer（0.1％Triton）1：100加cocktail冰上孵育 30minIP Lysis buffer 500ml：HEPES 5.95gNacl 4.38gEGTA 0.38gPH=7.44、针头过5次5、冰上，旋转孵育，15min6、14000rpm，20min，4度，留上清，去沉淀三、表达纯化HIS－tagged protein1、500ml LB 高温灭菌2、接种单克隆到5ml LB，加抗生素，37度，250转，过夜3、把菌液转移到500mlLB,加抗生素中，37度，250转，OD~0.7（看到云雾）4、加入IPTG 250－500ul，诱导4小时（温度摸索）5、6000转，4度，15min，弃上清，用10ml lysis buffer 溶解沉淀6、加入50ul PMSF，超声破碎，（300w，工作5，间歇10，全程10min）7、12000转，4度，20min8、柱中加入1ml ni-beads，上清转移至柱中，4度，旋转孵育1小时，（每种蛋白需要自行摸索相应的最佳条件，为防止蛋白降解，以下均在冰上）小量就是50ul的NI-beads放EP管，加细菌裂解液1ml9、用Wash buffer 1 10ml每次，洗2次（小量是1ml洗）用Wash buffer 2 5ml每次，洗2次（小量是1ml洗）收集洗脱液电泳检测每种wash buffer 的最佳用量（防止将蛋白洗脱）10、用Elution buffer洗脱蛋白2-4次，每次0.5ml，取1ul洗脱液在NC膜上，丽春红染色，颜色越深，蛋白量越大，取蛋白量最大的做Pull downLysis buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl10mMImidazoleWash buffer 150mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl20mM ImidazoleWash buffer 250mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl40mM ImidazoleElution buffer50mM NaH2PO4，PH8.0300mM Nacl300mM ImidazoleElution buffer 40ml50mM NaH2PO4 0.312g300mM Nacl 0.701g300mM Imidazole 0.8171g三、pull down实验1、his-pro加入到已纯化的GST-Pro的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！2、4℃旋转结合，4h3、PBS+0.1%Triton-100洗3次，PBS洗3次，1000转 2min，1:1留。
GST pull-down
百泰派克生物科技
GST pull-down
Pull down（拉下实验）是一种体外亲和纯化蛋白的技术，Pull down技术将已知蛋白（诱饵蛋白）利用亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）进行标记，再特异性识别混合体系中的配体蛋白（靶蛋白），以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是在体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
GST pull-down实验，也称GST融合蛋白沉降技术，是利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记诱饵蛋白进行的Pull down实验。
GST pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来挖掘未知的蛋白或肽的相互作用。
百泰派克生物科技提供高效快速的GST pull-down 蛋白互作分析服务，可用于鉴定两种已知的兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，以及寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
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普洛麦格公司GST pull-down 试剂盒手册-步骤部分翻译
第一部分：TNT® T7 Quick 转录/翻译反应制备捕获蛋白技术
1.V8871共4个试剂中取3个试剂，从-70℃保存环境中拿出解冻，RQ1 DNase第一次
使用后可放置在-20℃保存。
→TNT® T7 Quick Master Mix 手温溶解或在冰上溶解，其他样品室温溶解或冰上放置。
2.按下表加样，获得捕获蛋白，30℃孵育60-90min。
Components Reaction Volume（不用35S蛋氨酸）TNT® T7 Quick Master Mix 40ul
Methionine，1mM 1ul
Plasmid DNA template（s）0.5ug/ml 2ul
Nuclease-Free Water to 50ul
第二部分：GST融合蛋白固定到Magne GST TM颗粒上的相关技术
实验组：1ml GST-融合蛋白细菌培养物
对照组：1ml GST蛋白细菌培养物→→低表达蛋白需要加大样品量
当然，Magne GST TM颗粒本身也可以作为阴性对照。
◆细菌裂解步骤
1.从1ml左右菌液中收获细菌→加入Magne GST TM细胞裂解液之前先冻融细菌可增加某
些菌种的裂解效果，如BL 21菌种，方法可选用：-20℃冷冻15-20min或干冰冷冻5-10min。
2.室温中，在每个菌液中加入Magne GST TM细胞裂解液200ul，吹打并重悬浮菌液。
3.加入RQ1无RNA酶DNA酶2ul。
（可省略）→该步骤可增加GST-融合蛋白纯度并降
低蛋白粘度，若加入5ul可明显降低粘度，但是也可以省略该步骤。
4.25℃放置在平面摇床上，缓慢振荡，孵育20-30min。
◆Magne GST TM颗粒平衡步骤
1. 上下颠倒Magne GST TM颗粒使其重悬浮成均匀液体。
2. 取1.5mlEP管，加入已充分重悬浮的Magne GST TM颗粒20ul →在诱捕捕获蛋白时
不要让Magne GST TM颗粒放置过久，会因沉淀而降低结合效率。
3. 将Magne GST TM颗粒放在磁力架上的试管处，一般几秒钟之间会发生磁性捕获。
4. 小心倾倒EP管，弃掉上清液。
5. 将Magne GST TM颗粒从磁力架上移开，加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液250ul，
用移液枪吹打数次使其重悬浮，或上下颠倒数次。
6. 重复3—5步骤2次，一共需要洗涤3次。
◆结合步骤
1.完成以上步骤，加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液100ul并上下颠倒重悬浮颗粒。
注：加入1%BSA（牛血清白蛋白）可减少非特异性结合及可能的潜在背景。
使用5%浓度的IGEPL CA-630也能达到同样效果。
BSA的使用量应按照特定的目的蛋白进行优化。
2.在Magne GST TM颗粒重悬浮液中加入200ul细胞溶菌产物→细菌裂解步骤中获得。
3.在旋转平台上室温孵育30min（稳定温和混合）。
◆洗涤步骤
1.将以上EP管放在磁力架上，使Magne GST TM颗粒被磁力捕获，移除上清液→上清液
可用于凝胶分析。
2.加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液250ul至上一步骤的EP管中并轻轻上下颠倒数
次，使其混合均匀，室温孵育5min。
3.再次用磁力架行磁力捕获，小心移除上清液→洗涤液可用于凝胶分析。
4.加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液250ul至上一步骤的EP管中并轻轻上下颠倒数
次，使其混合均匀→该步骤不需要室温孵育5min。
5.第3次使用磁力架行磁力捕获，小心移除上清液→洗涤液可用于凝胶分析。
6.重复4-5步骤，一共进行3次洗涤。
7.最后加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液20ul→→可选：取3-5ul该液体，加入1×SDS
上样缓冲液20ul，煮沸洗涤蛋白5min，进行SDS-PAGE分析。
8.推荐使用5ul以上体积的GST-融合蛋白或GST对照蛋白进行pulldown系统分析。
第三部分：捕获、洗涤并分析目的捕获蛋白技术
◆捕获步骤
1.每5ul第二部分获取的GST-融合蛋白（或GST对照蛋白）加入20ul第一部分通过TNT®
T7 Quick 转录/翻译反应制备的产物。
2.加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液175ul，使其变成200ul反应体系。
→Magne GST TM
结合/洗涤缓冲液是一个中性PBS缓冲液。
3.在室温条件下放置与旋转平台上孵育1h，使其轻轻混合。
→该步骤有助于消除非特异
性黏附蛋白和降低背景。
4.将EP管放入磁力架中，行磁力捕获，小心移除上清液→上清液可保存待进一步分析。
◆洗涤步骤
（最佳洗涤体积及次数可能需要按情况进行优化）
1.加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液400ul于上一部分的EP管中，上下轻轻颠倒混匀。
2.室温孵育5min，并在此期间间断上下颠倒EP管数次。
3.将EP管放入磁力架中，行磁力捕获，小心移除上清液，并保留上清液有待进一步分析。
→该步骤获取的上清液很重要，务必保留，留作结果分析。
4.加入Magne GST TM结合/洗涤缓冲液400ul，上下轻轻颠倒混匀→该步骤后不需要孵育
5min。
5.将EP管放入磁力架中，行磁力捕获，小心移除上清液→上清液可保存待进一步分析。
6.重复4至5步骤3次，一共进行5次洗涤。
→每次移除的上清液都可保存待进一步分
析。
◆洗脱步骤
1.在上一部分EP管中沉淀中加入1×SDS上样缓冲液20ul。
2.室温孵育5min，使其混合均匀。
3.将EP管放入磁力架中，行磁力捕获，小心吸取洗脱液，保存，并行进一步分析。
→诱
饵蛋白和捕获蛋白复合体就在该洗脱液中，务必保留，留作结果分析。
◆分析步骤
以上各步骤获取的上清液及重要的洗脱液，加入适当蛋白质上样缓冲液后，煮沸5min，行WB检测。
目的蛋白的显示可以用考马斯亮蓝染色或者用相关抗体检测。