洁净手术室沉降法测定沉降菌浓采样布点法.doc
洁净区沉降菌采样操作规程
管理文件一、目 的：规范洁净区沉降菌采样操作标准 二、适用范围：洁净区沉降菌采样操作 三、责 任 者：生产部、质量管理部 四、内 容：1.洁净区沉降菌采样依据：GB/T 16294-2010 《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》2.采样流程→3.采样准备 3.1培养皿准备选择Φ90mm ×15mm 规格的培养皿，培养皿盖和底盘均较平整，无损坏。
准备培养皿数量根据采样区域进行计算。
3.2培养基准备选择大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA ）或沙氏培养基（SDA ），根据实际情况选择。
4.采样前要求4.1沉降菌采样前，被测试洁净室（区）已经过消毒；4.2洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时，温度在18℃～26℃，相对湿度在45%～65%之间为宜）；4.3采样状态有静态和动态两种，采样状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明采样状态；4.4 静态采样时，培养皿暴露时间为0.5小时；动态采样时，培养皿暴露时间为4小时； 4.5静态采样时，室内测试人员不得多于2人。
5.采样：5.1洁净区域（设备）级别及代码5.2培养皿标记：洁净区代码+“-”+培养皿编号，例如，超净台1第5个培养皿标记为：A1-5。
5.3最少采样点数目 5.4采样点布局洁净区（室、设备）采样点布局备注分装间1 2 3 47 85 69 10按左图采样点布置放置培养皿，“○”代表一个培养皿。
分装准备间12 3 4 56 7 8 9 10分装准备间采样时，因内部含有周转筐，故按照左图铺设培养皿，“○”代表一个培养皿。
混合罐装间12 5 634 7 89 10混合灌装间采样时，因室内有混合罐，故按照左图铺设培养皿，“○”代表一个培养皿。
其他洁净区（室）1 32 5 6 4 7 98 10采样时根据具体洁净室代码标记培养皿，“○”代表一个培养皿。
5.5铺设培养皿5.5.1培养皿铺设时按照从洁净度级别较高的区域向洁净度级别较低的区域依次铺设，先铺设A 级区培养皿，再铺设B 级区培养皿，最后铺设C 级区培养皿。
医药工业洁净室区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法-24页word资料
ICS 13.040.30C 10中华人民共和国国家标准GB/T 16292~16294—1996医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法Test method for airborne particles, airborne microbeand settling microbe in clean room(area)of the pharmaceutical industry1996-04-10发布1996-10-01实施国家技术监督局发布目次GB/T 16292—1996 医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法GB/T 16293—1996 医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法GB/T 16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法GB/T 16292—1996前言本标准等效采用美国联邦标准FS-209E—1992《洁净室和洁净区内空气浮游粒子洁净等级》，并参考JGJ 71—90《洁净室施工及验收规范》制定的。
悬浮粒子和微生物的测试是评价医药工业洁净室（区）空气洁净度的主要指标。
本标准用悬浮粒子的测试来评价洁净室（区）空气中的尘粒数。
医药工业洁净室（区）的悬浮粒子测试方法，应采用本标准。
本标准从生效之日起，废止YY/T 0141—93。
本标准的附录A是标准的附录。
本标准的附录B是提示的附录。
本标准由国家医药管理局提出并归口。
本标准起草单位：上海医药管理局药品测试所。
本标准主要起草人：纪炜、徐进庆、沈建华。
中华人民共和国国家标准医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测 试 方 法Test method for airborne particles in clean room (area) of the pharmaceutical industry1 范围本标准规定了医药工业洁净室（区）中悬浮粒子的测试方法和悬浮粒子而言的空气洁净度的评定。
本标准适用于医药工业洁净（区）中悬浮粒子洁净度的监测和洁净度等级的验证。
洁净手术室空气采样方法
洁净手术室空气采样方法Revised as of 23 November 2020洁净手术室空气采样方法1、采样时间：消毒后、操作前进行采样。
2、采样方法：（1）布点：室内面积≤30 m2，设内、中、外对角线3点，内外点距墙1m；室内面积 >30 m2，设四角及中央5点，四角点距墙1m。
（2）平板暴露法平板直径9cm、采样高度，暴露5min。
3、检验方法平板37℃培养48h。
计数菌落数并分离致病菌。
4、平板暴露法结果计算50000N细菌总数（cfu/m3）=A×TA为平板面积（cm2）； T 为暴露时间（min）；N 为平均菌落数（cfu）5、结果判定（1）I、II类区域，细菌总数≤10cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（2）III类区域，细菌总数≤200cfu/cm3，并未检出致病菌为消毒合格。
（3）IV类区域，细菌总数≤500cfu/cm2，并未检出致病菌为消毒合格。
6、注意事项：采样前关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样层流手术室空气日常监测方法：要求日常实行动态监测，必测项目为平板采样法（沉降法）或采样器法(浮游菌法)检测细菌菌落总数。
（1）回风口动态平板采样法：应在手术开始、手术2小时、手术结束前抽检3-4次。
每个回风口中部摆放3个倾斜30℃，Φ90 培养皿，暴露30分钟后，37°C培养24小时。
标准：每皿菌落计数平均值应符合表4标准要求。
单皿最大值不应超过平均值3倍。
（2）动态采样器法：浮游菌菌落检测应在手术进行如切皮、缝合、连台手术之间、手术进行4小时等，选择不少于3个程序，测定细菌菌落总数。
标准：I级<30cfu/m3 ；II级<150 cfu/m3；III级<450 cfu/m3；IV级<500cfu/m3。
（3）其他洁净用房在当天上午10时和下午4时各测1次，在每个回风口中部摆放3个Φ90培养皿，沉降后在37℃下培养24h。
洁净度(沉降菌)测试的标准操作规程
洁净度（沉降菌）测试的标准操作规程目的：建立洁净度（沉降菌）测试的标准操作规程，为沉降菌检查人员提供正确的标准操作方法。
范围：适用于本公司洁净区(室)的沉降菌的监测的全过程。
职责：QA对本规程的有效执行承担监督检查责任，沉降菌检查人员对本规程的实施负责。
依据：GB/T16294－2010、2013-2017年环境监测数据及2016-2017年洁净区（室）环境监测回顾报告。
1定义：本规程采用下列定义：1.1菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。
1.2沉降菌：用GB/T16294－2010提及的方法收集空气中的活微生物粒子，通过专门的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数1.3沉降菌菌落数：在规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以cfu//4小时表示。
1.4洁净室：对尘粒及微生物污染需进行控制的房间或区域。
1.5洁净工作台：一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区。
其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流洁净罩、水平层流罩、垂直层流洁净工作台、水平层流洁净工作台等。
1.6洁净度：洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子和微生物的允许统计数。
2、测试方法：2.1 方法概述：本测试方法按国家技术监督局发布的《医药工业洁净室（区）沉降菌测试方法》采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室(区)的洁净度。
2.2使用的仪器和设备：2.2.1恒温培养箱：必须定期对恒温培养箱进行校验。
2.2.2高压蒸汽灭菌器：使用时应严格按照仪器操作规程进行操作。
2.2.3培养皿：2.2.3.1.一般采用￠90mm×15mm 规格的硼硅酸玻璃培养皿。
2.2.3.2.使用前将培养皿置于121℃湿热灭菌20min。
洁净室(区)沉降菌的测试方法
一种工作台或者与之类似的一个封闭围挡工作区其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流罩、水平层流罩、垂直层流洁净工作台、水平层流洁净工作台、自净器等。
4.3.3 洁净度
洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数。
4.3.4菌落
细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的细菌集落，简称CFU。通常用个数表示。
4.5.4 沉降菌计数
4.5.4.1 采样点数目及其布置
4.5.4.1.1 最少采样点数目
沉降法的最少采样点数可按表1确定。
表1 最少采样点数目
面 积m2
洁 净 度 级 别
100
10000
100000
＜10
2～3
2
2
≥10～＜20
4
2
2
≥20～＜40
8
2
2
≥40～＜100
16
4
2
≥100～＜200
40
4.3.8 非单向流（曾称为乱流）
具有多通路循环特性或气流方向不平行的，不满足单向流定义的气流。
4.3.9 静态测试
洁净室（区）净化空气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安装，洁净室（区）内没有生产人员的情况下进行的测试。
4.3.10 动态测试
洁净室（区）已处于正常生产状态下进行的测试。
4.4 测试方法
10
3
≥200～＜400
80
20
6
≥400～＜1000
160
40Βιβλιοθήκη 13≥1000～＜2000
400
100
32
2000
800
200
63
中华人民共和国《国家标准医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法》.doc
中华人民共和国《国家标准医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》（2012-05-26 09:41:00）1范围本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌的测试条件、测试方法。
本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或无菌区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境的验证。
2引用标准下列标准所饮食的条文，通过在木标准中引用而构成为木标准的条文。
本标准出版时, 所示版本均为不效。
所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
YY/T0188、6 — 1995药品检验操作规程第6部分：药品生物测定法3定义本标准采用下列定义。
3、 1 洁净室（区）clean room （ area ）3.2 洁净工作台cleaning work station一神工作台或者与之类似的一个封闭围档工作区。
其特点是自身能够供给经过过滤的空气或气体，如垂直层流置、水平层流罩、垂直层流洁净工作、水平层流洁净工作台、自净器等。
3、3 洁净度cleanliness洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一-粒径的悬浮粒子的允许统计数。
3.4 菌，客colony forming units细菌培养后，由…个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。
通常用个数表示。
3、5 沉降菌settling microbe用木标准提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
3、6 悬浮粒子ailborne Paritical可悬浮在空气中的尺寸一般在0、001pm〜1000pm之间的固体、液体或两者的混介物质, 包括生物性粒子和非生物性粒子。
3、7单|仙流unidirectional air flow （曾称为层流laminar flow ）沿着平行流线，以单一通路以一定流速向流动的气流o3、8非单向流水线nonunidirectional air flow （曾称为乱流turbulent flow ）具有多个循环特性或气流方向不平行的，不满足单向流定义的气流。
洁净室沉降菌的监测及测定法
2.1沉降菌检验用培养基。
3.相关文件：《沉降菌测定记录》RD-SOP-ZL-005。
4.内容：4.1采样点数目：采样点数目按房间大小和房间的洁净级别来设置，具体数目见下表：面积（m2）洁净级别100 10000 100000<10 10-20 20-40 >40 2-3481622242222在满足最少测点数的同时，还宜满足最少培养皿数，见下表：洁净级别所需Φ90培养皿数（以沉降0.5h计）100 10000 100000 5-7 5 54.2取样点布置，如图示：文件名称洁净室沉降菌的测定法文件编号：HV-SOP-ZL-005/00 第 2 页共 2 页4.2.1采样点布置在离地0.8米高的水平面上均匀布置4.2.2 采样点多于5点时，可在离地面0.8-1.5m高度的区域内分层布置，但每层不少于5个点。
4.2.3布置采样点时，应避开回风口。
4.3测试时间：净化空调系统正常运行不少于30分钟后开始。
4.4测试方法：4.4.1将已准备好的培养皿置于采样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上。
4.4.2全部采样结束后，将培养皿倒置于30-35℃恒温培养箱中培养48小时。
4.4.3菌落计数。
4.4.4结果计算：4.4.5结果判定：用平均菌落数判断洁净室的空气中的微生物。
4.4.5.1洁净室（区）内的平均菌落数必须低于所选定的评定标准。
见下表。
4.4.5.2若洁净室（区）内平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域进行消毒，然后重新采样2次，测试结果必须合格。
洁净级别 100级 10000级 100000 标准（平均） 0.5个/皿1.5个/皿3个/皿文件名称 洁净区尘埃粒子测定法文件编号：HV-SOP-ZL-006/00 起草人 日期 第 1 页 共 3 页 审核人 日期 颁发部门：行政部审定人 日期 批准人日期送达部门质量管理部目的：明确洁净区尘埃粒子检验的标准操作程序。
洁净区沉降菌测试操作规程
范围：洁净区
职责：质量部、生产车间对本规程的实施负责
正文：
1.试剂及仪器、器皿
1.1试剂
——营养琼脂培养基
1.2仪器及器皿
1.3生化培养箱，Φ90mm培养皿、锥形瓶、胶塞、灭菌锅、烧杯等。
2.测试前准备
2.1培养基的配制
——按SOP-QM-424《培养基配制标准操作规程》进行。
2.2培养基平皿的制备
2.2.1将Φ90mm培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟或180℃干热灭菌2小时。
2.2.2将培养基加热溶化，冷至45℃时，于无菌检查操作间将培养基注入平皿，每皿约15ml。
2.2.3待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃-35℃生化培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
3.采样
3.1采样点的数目及采样点的布置
3.1.2.1采样点的布置力求均匀,避免采样点在某局部区域过于集中或过于稀疏，关键区域可增加采样点。
3.1.2.2采样点位置离地0.8-1.5米左右（略高于工作台面）
3.2采样方法：按3.1的要求放置平皿数，打开培养皿盖，使培养皿暴露30分钟，再将培养皿盖盖上。
4.培养
第1页共2页
所有采样结束后，将平皿倒置在30ºC—35ºC的生化培养箱中培养48小时。
5.操作结果的评价
5.1用肉眼直接计数并记录。
5.2结果计算
式中 M—平均菌落数（CFU）
M i—1，2，3……号平皿菌落数
n—平皿总数
5.3结果评价标准见下表：
测试结果均须合格。
第2页共2页。
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洁净手术室沉降法测定沉降菌浓度采样布点法
手术室的级别分为：Ⅰ级手术室，Ⅱ级手术室，Ⅲ级手术室，Ⅳ级手术室。
Ⅰ-Ⅲ级手术室有手术区和周边区之分，手术区为需要特别保护的手术台及其周围区域，余下区域均为周边区。
Ⅳ级手术室不分手术区和周边区。
各级手术室不同区域的空气洁净度级别不同，有5级、6级、7级、8万级及8.5级之分。
GB50333-2013中（13.3.18.4）要求采用沉降法测定沉降菌浓度时，细菌浓度测点数要和被测区域含尘浓度测点数（13.3.11－2）相同，同时应满足表13.3.18-2 规定的最少培养皿（不含对照皿）数的要求。
也就是说按这两种方法中布点数多的布点。
表13.3.18-2 沉降菌最小培养皿数
表13.3.11-2 测点位置表
上表明确指出5级洁净度区域最少培养皿是13个；而含尘浓度的检测布点方法是
（13.3.11.2）Ⅰ级手术室手术区5个，所以在测沉降菌的时候，Ⅰ级手术室手术区布点数应为13个。
沉降菌最少培养皿数明确指出6级洁净度区域最少培养皿是4个；而含尘浓度的检测布点方法是Ⅰ级手术室周边区8个，所以Ⅰ级手术室周边区布点数应为8个，即Ⅰ级手术室沉降菌采样共需布21个点（不包括对照）。
沉降菌最少培养皿数指出6级洁净度区域最少培养皿是4个；而含尘浓度的检测布点方法是Ⅱ级手术室手术区3个，所以Ⅱ级手术室手术区布点数应为4个。
沉降菌最少培养皿数指出7级洁净度区域最少培养皿是3个；而含尘浓度的检测布点方法是Ⅱ级手术室周边区6个，所以Ⅱ级手术室周边区布点数应为6个。
即Ⅱ级手术室沉降菌采样共需布10个点（不包括对照）。
沉降菌最少培养皿数指出7级洁净度区域最少培养皿是3个；而含尘浓度的检测布点方法是Ⅲ级手术室手术区3个，所以Ⅲ级手术室手术区布点数为3个。
沉降菌最少培养皿数指出8级洁净度区域最少培养皿是2个；而含尘浓度的检测布点方法是Ⅲ级手术室周边区6个，所以Ⅲ级手术室周边区布点数应为6个。
即Ⅲ级手术室沉降菌采样共需布9个点（不包括对照）。
洁净手术室的等级标准(空态或静态)及沉降法测定细菌浓度布点
)
2、检测细菌浓度，必须有2次空白对照。
第1次对用于检测的培养皿做对比试验，即每次采样时留一个培养皿直接送培养并采取单盲法（即送检的人知道是对照而微生物实验室的人不知道）。
第2次是在检测时，每室或每区1个对照皿，对操作过程做对照试验：模拟操作过程，但培养皿打开后即立即封盖。
两次对照结果都必须为阴性。
整个操作应符合无菌操作的要求。
3、采样后的培养皿，应尽快置于37℃条件下培养24h，然后计数生长的菌落数。
菌落数的平均值均四舍五入进位到小数点后1位。
4、当某个皿菌落数太大受到质疑时，应重测，如结果仍很大以两次均值为准；如果结果很小可再重测或分析判定。
布皿和收皿的检测人员必须遵守无菌操作的要求。
13个点
布点示意：
2014-6-13。