分子生物学 3 核酸
分子生物学：第3章RNA的转录习题和答案
第三章RNA的转录一、名词解释1．转录2．模板链（反义链）3．非模板链（编码链）4．不对称转录5．启动子6．转录单位7．内含子8．外显子9．sigma因子10．RNA编辑11．核酶12．gRNA 13．GU-AG规则14．转录后加工15．核内不均一RNA 16．RNA复制二、填空题1．由逆转录酶所催化的核酸合成是以_______为模板，以_______为底物，产物是_______。
2．RNA生物合成中，RNA聚合酶的活性需要_______模板，原料是_______、_______、_______、_______。
3．大肠杆菌RNA聚合酶为多亚基酶，亚基组成_______，称为_______酶，其中_______亚基组成称为核心酶，功能_______；σ亚基的功能_______。
4．用于RNA生物合成的DNA模板链称为_______或_______。
5．RNA聚合酶沿DNA模板_______方向移动，RNA合成方向_______。
6．真核生物RNA聚合酶共三种_______、_______、_______，它们分别催化_______、_______和_______的生物合成。
7．某DNA双螺旋中，单链5’… ATCGCTCGA … 3’为有意义链，若转录mRNA，其中碱其排列顺序为5’… _______… 3’。
8．能形成DNA--RNA杂交分子的生物合成过程有_______、_______。
形成的分子基础是_______。
9．DNA复制中，_______链的合成是_______的，合成的方向和复制叉移动方向相同；_______链的合成是_______的，合成的方向与复制叉方向相反。
10．一条单链DNA(+)的碱基组成A2l％、G29％，复制后，RNA聚合酶催化转录的产物的碱基组成是_______。
11．RNA聚合酶中能识别DNA模板上特定起始信号序列的亚基是_______ ，该序列部位称_______。
分子生物学基础知识
五、核酸的理化性质及应用
(一) 一般理化 1、性粘度质
DNA > RNA 2、沉降系数
DNA >> RNA 3、酸碱性质
DNA pI 4~4.5 ，pH 4.0 ~ 11.0 稳定，提取 RNA pI 2~2.5 提取左右，混有很少DNA污染
(二) 紫外吸收 特征 1、碱基的行为表现 —— 共轭双键在260nm有最大吸收
DNA 分子中碱基间电子的互相作用是紫外吸收的构造根底， 但双螺旋构造有序堆积的碱基又 “ 束缚 〞 了这种作用。变性 DNA的双链解开，碱基中电子的互相作用更有利于紫外吸收， 故而产生增色效应。
4、复性：变性的DNA在适当的温度、一定离子强度条件下， 给以足够的时间重新缔合形成双螺旋的过程，称为复性。 5、影响复性的因素：
甲基化，甲羟化，乙酰化等
(二) RNA的种类:
1、参与基因表达的RNA
① 信使RNA〔mRNA〕：遗传信息的传递，翻译模板 ② 转运RNA 〔tRNA〕：氨基酸载体 ③ 核糖体RNA 〔rRNA〕：提供蛋白质合成的场所
2、核不均一RNA〔hnRNA〕:mRNA的前体 3、核内小RNA 〔snRNA〕：参与hnRNA的剪接、转运 4、 核仁小RNA〔snoRNA〕：参与rRNA的加工修饰 5、胞质小RNA 〔hnRNA〕: 运输新合成的Pr到高尔基体加工 6、小片段干扰RNA〔siRNA〕：诱发外源mRNA的降解
分子生物学基础知识
一、核酸分子的根本组成
脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)
核苷酸
核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA)
核糖
戊糖
核苷
脱氧核糖碱基 磷酸 Nhomakorabea嘌呤 嘧啶
生物化学与分子生物学重点
第一章 核酸的结构与功能1、种类：脱氧核糖核酸（DNA），存在于细胞核和线粒体内。
核糖核酸（RNA），存在于细胞质和细胞核内。
2、核酸的分子组成：基本组成单位是核苷酸，而核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸三种成分连接而成。
戊糖：DNA分子的核苷酸的糖是β-D-2-脱氧核糖，RNA中为β-D-核糖。
3、核酸的一级结构核苷酸在多肽链上的排列顺序为核酸的一级结构，4、 DNA的二级结构DNA双螺旋结构是核酸的二级结构。
双螺旋的骨架由糖和磷酸基构成，两股链之间的碱基互补配对，是遗传信息传递者，DNA半保留复制的基础，结构要点： a.DNA是一反向平行的互补双链结构亲水的脱氧核糖基和磷酸基骨架位于双链的外侧，而碱基位于内侧，碱基之间以氢键相结合，其中，腺嘌呤始终与胸腺嘧啶配对，形成两个氢键，鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对，形成三个氢键。
b.DNA是右手螺旋结构螺旋直径为2nm。
每旋转一周包含了10个碱基，每个碱基的旋转角度为36度。
螺距为3.4nm，每个碱基平面之间的距离为0.34nm。
c.DNA双螺旋结构稳定的维系横向靠互补碱基的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持，尤以后者为重要。
5、RNA的空间结构与功能mRNA:1. 真核生物mRNA的5'-端有特殊帽结构2. 真核生物mRNA的3'-末端有多聚腺苷酸尾3. mRNA碱基序列决定蛋白质的氨基酸序列tRNA：1、3′末端为—CCA-OH 2、含10～20% 稀有碱基3、其二级结构呈“三叶草形”4. tRNA的反密码子能够识别mRNA密码子rRNA：rRNA的结构为花状，rRNA 与核糖体蛋白结合组成核糖体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。
rRNA单独存在不执行其功能。
tRNA功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的戴本并将其转呈给mRNA。
6、核酸的理化性质在某些理化因素作用下，如加热，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为变性。
分子生物学
对蛋白质结构与功能的进一步认识
1956-58年Anfinsen和White根据对酶 蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的 三维空间结构是由其氨基酸序列来确定 的。1958年Ingram证明正常的血红蛋白 与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之 间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基 的差别，使人们对蛋白质一级结构影响 功能有了深刻的印象。与此同时，对蛋 白质研究的手段也有改进，1969年Weber 开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定 蛋白质分子量；
(二)、现代分子生物学的建立和发展阶段
这一阶段是从50年代初到70年代初， 以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺 旋结构模型作为现代分子生物学诞生的 里程碑开创了分子遗传学基本理论建立 和发展的黄金时代。DNA双螺旋发现的最 深刻意义在于：确立了核酸作为信息分 子的结构基础;提出了碱基配对是核酸复 制、遗传信息传递的基本方式；从而最 后确定了核酸是遗传的物质基础，为认 识核酸与
蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了 最重要的基础。在此期间的主要进展包 括：
遗传信息传递中心法则的建立
在发现DNA双螺旋结构同时，Watson 和Crick就提出DNA复制的可能模型。其 后在1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合 酶；1958年Meselson及Stahl用同位素标 记和超速离心分离实验为DNA半保留模型 提出了证明；1968年Okazaki（冈畸）提 出DNA不连续复制模型；1972年证实了 DNA复制
S.Furbery等的X-线衍射分析阐明了核苷酸 并非平面的空间构像，提出了DNA是螺旋 结构；1948-1953年Chargaff等用新的层 析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷 酸量，积累了大量的数据，提出了DNA碱 基组成A=T、G=C的Chargaff规则，为碱 基配对的DNA结构认识打下了基础。
四川师范大学-生命科学学院-分子生物学-期末复习重点
四川师范⼤学-⽣命科学学院-分⼦⽣物学-期末复习重点分⼦⽣物学⽬录Section C 核酸的性质 (5)1、核酸的结构 (5)2、核酸的理化特性 (5)3、核酸的光谱学和热⼒学特性 (5)Section D 原核与真核⽣物的染⾊体结构 (5)1、组蛋⽩核⼼组蛋⽩ (5)2、真核⽣物的染⾊体结构 (5)1) C-G岛： (5)2) 常染⾊质： (5)3) 异染⾊质： (5)4) 理想复性动⼒学曲线解释P84 (6)5) 遗传多态性概念 (6)a) 单核苷酸多态性（SNP）： (6)b) 简单序列重复多态性（SSLP）： (6)c) 限制性⽚段长度多态性（RFLP）： (6)Section E DNA的复制 (6)1、冈崎⽚段： (6)2、DNA复制时为什么需要RNA引物？ (6)3、原核⽣物（细菌）的DNA复制过程（以⼤肠杆菌为例，环形DNA）P79 (6)1) 起始： (6)2) 延伸： (6)3) 终⽌分离： (7)4、真核⽣物的DNA复制过程P87 (7)1) 起始： (7)2) 延伸： (7)5、端粒酶：含义RNA和蛋⽩质，RNA具有反转录的功能。
(7)Section F DNA损伤、修复与重组 (7)1、DNA复制忠实性机理 (7)1) DNA pol：碱基配对原则 (7)2) 3’-5’的外切酶活性 (7)3) RNA引物 (7)4) 错配修复 (7)2、DNA修复原理：P99 (7)1) 光复活（photoreactivation）： (7)2) 烷基转移酶： (7)3) 切除修复： (7)4) 错配修复： (7)3、遗传修复缺陷 (8)1) SOS属于易错修复 (8)2) 同源重组：在真核⽣物的减数分裂过程中，发⽣在⾮姐妹染⾊单体之间或同⼀染⾊体上含有同源序列的DNA分⼦之间或分⼦之内的重新组合。
(8)3) 位点特异性重组：⾮同源DNA的特异⽚段之间的交换，由能识别特异DNA序列的蛋⽩质所介导，并不需要RecA或单链DNA。
核酸的结构与功能-3
Tm是指什么情况下的温度？ A 双螺旋DNA达到完全变性时
B 双螺旋DNA开始变性时
C 双螺旋DNA结构失去1/2时
D 双螺旋结构失去1/4时
双链DNA的解链温度的增 加，提示其中含量高的是 A A和G
B C和T C A和T
D C和G
核酸变性后，可发生哪种效应？
A 减色效应
B 增色效应 B 增色效应
＊粘度
DNA粘度大 RNA粘度小
＊旋光性
均很强
＊密度
RNA>双链DNA； 环状DNA >开环、线状DNA 单链DNA >双链DNA
＊沉降速度：
RNA >环状DNA >开环、线状DNA
二、核酸的紫外吸收特性
嘌呤碱和嘧啶碱有共轭双键，都能 强烈吸收紫外光，最大吸收波长为
260nm
蛋白质对紫外光的最大吸收波长 是280nm
∣
真核
28S
5S
小亚基16S
分布 细胞核 细胞质（真核） 细胞质 细胞质
18S
其他小分子RNA及RNA组学
snmRNAs
除了上述三种RNA外，细胞的不同 部位存在的许多其他种类的小分子RNA ，统称为非mRNA小RNA(small nonmessenger RNAs, snmRNAs)。
snmRNAs的种类
核内小RNA 核仁小RNA 胞质小RNA 催参与hnRNA和rRNA的加工和转运。
RNA组学
RNA组学研究细胞中snmRNAs 的种类、结构和功能。同一生 物体内不同种类的细胞、同一 细胞在不同时间、不同状态下 snmRNAs的表达具有时间和空间 特异性。
DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8
核酸分子生物学基础
AMP
戊 糖
HO CH2 5´ O OH HO CH2 O OH
4´ 3´
OH
1´
2´
OH OH
核糖(ribose) （构成RNA）
脱氧核糖(deoxyribose) （构成DNA）
Hale Waihona Puke • 戊糖DNA,RNA中主要的碱基、核苷
戊糖
RNA
D-核糖
碱基
A G C U A G C T
核苷
四、变性与复性
(一) 变性（denaturation) 1、核酸的变性与增色效应
核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结 构的过程。 变性：不涉及共价键3’，5’-磷酸二酯键的断裂，所以它 的一级结构(碱基顺序)保持不变 降解：多核苷酸骨架上共价键断裂，引起相对分子质量 降低
核酸分子细长，溶液的粘度很大，且DNA溶液的粘 度比RNA的大得多。发生变性或降解时，它们的粘 度降低。
二、两性解离
核酸是两性电解质（含有磷酸和氨基），可发 生两性解离。 核酸的解离状态与溶液的pH有关，当核酸溶液 在某一pH时，核酸分子内的酸性解离与碱性解 离相等，所带的正负电荷相等，净电荷为零， 此时核酸溶液的pH称为核酸的等电点（pI）。 由于磷酸酸性较强，而碱基（氨基）是弱碱， 所以核酸的等电点较低。DNA的等电点为4～ 4.5，RNA的等电点为2～2.5。
2、分布
真核细胞
细胞核（95%）： 线型双链，一般与组蛋白结合 成染色体 线粒体、叶绿体（5%）：环 状双链 细胞质（75%） 线粒体、叶绿体（15%） 细胞核（10%）
原核细胞
环状双链 主要集中于核区
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释第二章核酸的结构与功能1. DNA的变性与复性(denaturation and renaturation of DNA): 双链DNA(dsDNA)在变性因素(如过酸、过碱、加热、尿素等)影响下,解链成单链DNA(ssDNA)的过程称之为DNA变性。
DNA变性后，生物活性丧失，但一级结构没有改变，所以在一定条件下仍可恢复双螺旋结构。
热变性的DNA经缓慢冷却后，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性，也称退火。
2．核酸分子杂交(hybridization of nucleic acids)：是核酸研究中一项最基本的实验技术。
其基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的性质,使来源不同的DNA(或RNA)片段,按碱基互补关系形成杂交双链分子。
杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。
这种现象称为核酸分子杂交。
简称杂交（hybridization)3．增色效应与减色效应(hyperchromic effect and hypochromi c effect): DNA变性时，双螺旋松解，碱基暴露，OD260值增高称之为增色效应；除去变性因素后，单链DNA依碱基配对规律恢复双螺旋结构，OD260值减小称为减色效应。
4. 核酶（ribozyme）：核酶是具有催化功能的RNA分子。
大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。
5．探针：探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的基因。
第八章核苷酸代谢1. 从头合成途径(de novo synthesis pathway): 利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及CO2等简单物质为原料合成嘌呤或嘧啶核苷酸的过程,称为从头合成途径，是体内的主要合成途径。
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(1) 琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子 （根据分子大小），然后用NaOH处理 凝胶。
Southern Blot (2)
(2) 将DNA 转移到硝酸纤维素膜（ nitrocellulose）
Southern Blot (3)
膜上DNA的位置 与凝胶上DNA的 位置相同
left-hand
low 12
基因组DNA RNA-RNA poly(dG-dC) DNA-RNA poly(dT-dA)
核酸修饰
Phage DNA RNA
More, complex modification
甲基化 (A, C)
细胞内DNA
甲基化作用：
限制性修饰 碱基错配修复 真核基因组结构 （转录抑制）
紫外吸收 UV
DNA/RNA：max=260nm
protein, max=280nm A260：nucleotides 〉ssDNA /RNA 〉dsDNA
核酸定量
1mg/ml：A260 =20（dsDNA）
1mg/ml：A260 =25（ssDNA/RNA）
DNA 纯度
A260 / A280 =1.8，pure dsDNA A260 / A280 =2.0，pure RNA A260 / A280 <1.0，pure protein
5. 拓扑异构酶 topoisomerases
调节超螺旋程度（复制、重组和转录） Type I —— 单链断裂 / 1 Type II —— 双链断裂 / 2 细菌： 促旋酶 DNA gyrase 拓扑异构酶 IV（unlink DNA）
复习题
1. B helix、A helix 、 Z helix 有什么特点? 2. DNA双螺旋的稳定性是由哪些非共价作用维持的？ 3. （G+C）含量在DNA分子的哪些性质中起重要作用？ 4. 什么是 Tm ？DNA变性和复性的条件各有那些？ 5. 如果你获得了一段DNA序列，如何鉴定它的纯度，对 其定量，并粗略知道它的大小？ 6.Southern blot, Northern blot，DNA指纹技术的原理和 目的。 7.DNA拓扑异构酶 有几种，各有什么特点？
DNA supercoiling
1. CCC (Covalently Closed Circle ) 2. 超螺旋
松弛DNA （Lk0 ）
双螺旋方向和盘绕方向( positive/negative )
3. 拓扑异构体 topoisomer 4. Energy of supercoiling
超螺旋和扭转应力 torsional stress
核 酸
Nucleic acids
核酸的结构
核酸的物理和化学性质 核酸的变性、复性和杂交
DNA 超螺旋结构
Primary structure
purines bases
nucleosides Nucleic Nucleoacids tides phosphate groups pentose sugar pyrimidine ribose deoxyribose
核酸的物理和化学性质
核酸的稳定性 (stability)
氢键 堆积作用 磷酸基的静电斥力
粘度 (viscosity)
剪切力 超声波 用途
浮力密度 (buoyant density)
密度梯度离心 8M CsCl（RNA > DNA > protein) GC含量 ρ=1.66+0.09% (G+C)
二甲基亚砜 DMSO，尿素Urea， 甲酰胺 formamide
3. 降低盐浓度
4. 热变性 （thermal denaturation）
Melting curve ：双链DNA分子热变性的动态曲线。
解链温度 melting temperature (Tm )： 有一半的双链DNA分子发生变性时的温度。
Melting curve
Tm与（G+C）含量成正相关
Renaturation
1. 温度
较 Tm 低 20-25℃ 快速降温 （阻止复性） 慢速降温 （形成 dsDNA)
2. 盐浓度
0.15 ~ 0.5M NaCl
3. DNA 初始浓度 4. 复性时间
Hybridization
１．Southern Blot（1）
（4） 探针与膜上 的DNA杂交 （5）显影
2. DNA指纹技术 （DNA fingerprinting）
数目可变的串联重复序列, VNTR* viariable number tandem repeat 核心序列core sequence 长度: 2-300bp 重复次数: 可变的
VNTR-A5 VNTR-A7 VNTR-A VNTR-B2 VNTR-B3
核酸的分离
琼脂糖凝胶电泳
甲醛变性电泳（RNA）
核酸的
变性、复性和杂交
Denaturation
酸处理 acid ( 非变性）
水解 hydrolysis（高温高酸 HClO4）
脱嘌呤 apurinic （ 无机酸） 测序 Maxam and Gilbert 1. 碱处理 alkali DNA：变性（破坏氢键结构） RNA：水解 （hydrolysis） 2. 化学试剂
A G C
T/U
DNA/RNA sequence
DNA double helix
A-form
B-form
Z-form
B-form
A-form
Z-form
helical sense right-hand
humidity bp/turn sequence 92% 10
right-hand
75% 11
1. 父母遗传性 2. 长度多态性 同一座位、不同座位
1985 Alec Jeffreys ( England)
3. Northern blot
Measuring gene activity
4. In situ hybridization
locating genes in chromosomes