不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响
冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究
义（ Ｐ＜００ ） Ｄ组 与 其 他 ３ 卵 母细 胞 冷 冻 保存 后 卵子 复苏 率 、 胎 受 精 率 、 续 发 育 潜 能 的 比较 ， 异 无 统 计 学 ．１ ； 组 胚 继 差
４种玻璃化冷冻载体都是小 鼠卵母 细胞 快速玻璃 化冷冻保存 中可行的冷冻 载体 ， 自制叶
片组 的卵 子 回收 率 明显 低 于 其 他 ３组 ， 更 进 一 步熟 练 叶片 制 作 的 技术 和实 验 人 员 操 作技 能 。 需
宁夏 医学 杂 志 ２ １ ０ １年 ９月 第 ３ ３卷第 ９期
Ｎｎｘ ｅ ，ｅ． ０ １ Ｖ ｌ ３。ｏ９ ｉｇｉ Ｍ ｄＪＳ ｐ２ １ ， ｏ ３ Ｎ ． ａ
文章编号： ０ — ９９２１） —８６ ０ １ １ ５４（０１０ ００ —３ ０ ９
・ 论
著 ・
冷 冻 载 体 对 小 鼠 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 效 果 影 响 的 研 究
自从 Ｗｈｔｎｈｍ 等 （ ９２ 和 Ｗｉ ｕ （ ９２ ｉｉ ａ ｔｇ １７ ） ｌ ｔ １７ ） ｍ 首次报道冷冻 一 解冻 小 鼠胚 胎成功 以来 ， 采用 快速玻
璃化冷冻法冷冻小 鼠卵母 细胞 ， 给人类 卵子 的冷冻提
周 昆明雄性 小 鼠共 ３ ０只（ 自宁夏 医科 大学 动物 实 购
验 中心 ， 普通 级 ） 。
１２ 仪 器 ： 视 显 微 镜 （６ ． 体 Ｓ Ｅ标 准 型 ， ｌ ｐ ｓＪ— Ｏｙ ｕ ，ａ ｍ ｐｎ 、 ａ ） 倒置 显 微镜 （ Ｘ １ Ｊｐ ｎ 及 显 微 注射 操 作 仪 Ｃ ２ ，ａ ａ ）
（ Ｉ Ｇ ｒ ａ ） Ｃ ２培 养 箱 （ ａ ｏ ｃ， ２ ０ Ｇ ｒ Ｒ ， ｅｍ ｎ ， Ｏ Ｌ ｂ ｔ ｔ Ｃ ０ ， ｅ— ｅ ｍ ｎ ， 养 皿 （ ａ ｏｓ Ｕ Ａ） 四孑 培 养 皿 （ ｕ ｓ ａ）培 Ｆｌ ｎ ， Ｓ ， Ｌ ｃ Ｎｎ，
小鼠精子胚胎冻存保种
小鼠精子胚胎冻存保种
将活体品系保存于液氮中，减低活体保种的费用、表型丢失、繁育能力下降等风险。
做到随用随取的快捷操作方式。
胚胎冻存
方法：将超排后的雌鼠与目的雄鼠进行交配，第二天取2细胞进行慢速冷冻，存放于液氮中。
优势：慢速冷冻的胚胎复苏后成活率高（80%以上），且移植后的大小鼠怀孕率及产仔率高。
缺点：操作难度高，需要高昂的程序冷冻仪，操作时间达到6个小时。
精子冻存
方法：将雄鼠处死取出精子通过快速冷冻保存于液氮中
优势：操作速度快，精子保存量大。
缺点：复苏时需要进行体外受精，且受精率低（一般为15%-25%）。
操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响
Journal of China-Japan Friendship Hospital,2019Oct,Vol.33,No.5中日友好医院学报2019年第33卷第5期293操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响韩烁，周雯慧，李媛(首都医科大学附属北京朝阳医院生殖医学中心，北京100020)摘要目的：探讨操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响。
方法：应用超促排卵技术获得小鼠卵母细胞，体外培养后受精，继续培养胚胎至囊胚期。
观察在不同的操作台温度下小鼠卵母细胞的受精及胚胎的发育情况。
结果：卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C,两原核形成率(2PN率)和囊胚形成率分别为89.82%和41.66%,显著低于操作台温度为37.0±0.2°C的2PN率96.25%(Pv0.05)和囊胚形成率57.50%(P<0.05)o胚胎培养期操作台温度升高至38.0±0.2°C,受精率、卵裂率和囊胚形成率与操作台温度为37.0±0.2°C时期的受精率、卵裂率和囊胚形成率无显著差异。
结论：卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C会降低小鼠卵母细胞2PN受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率，提高异常受精率。
胚胎培养期操作台温度升高对小鼠卵母细胞受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率无影响。
关键词：胚胎；发育；温度中图分类号：Q954.43文献标识码：A文章编号：1001-0025(2019)05-0293-03doi：l0.3969/j.issn」001-0025.2019.05.008Effect of different operating table temperature on fertilization and embryonic development of mouse oocytes//HAN Suo,ZHOU Wen-hui,LI Yuan//Journal of China-Japan Friendship Hospital,2019Oct,33(5):293-295Abstract Objective:To investigate the effect of different operating table temperature on fertilization and embryonic development of mouse oocytes.Methods:Mouse oocytes were obtained by hyper-ovulation and fertilized in vitro, then the embryos were cultured to blastocyst stage.The fertilization of mouse embryo oocytes and the development of the embryos were observed at different operating table temperatures.Results:When temperature of the operating table increased to38.0±0.2°C,the pro-nucleate stage(2PN)rate and blastocyst formation rate were89.82%and41.66%,respectively.Both rates were significantly lower than those when temperature was37.0±0.2°C,which were96.25%and57.50%,respectively(both P<0.05).There were no significant differences infertilization rate,cleavage rate and blastocyst formation rate between the above mentioned stage temperatures at the stage during embryo culture period.Conclusion:Increasing the operating table temperature to38.0±0.2°C during oocytes collection can decrease the fertilization rate of2PN,cleavage rate and blastocyst formation rate, and increase the abnormal fertilization rate.There were no effects on fertilization rate,cleavage rate and blastocyst formation rate when the temperature of operating table increased during embryo culture.Key words embryo；development；temperatureAuthor's address Medical Center for Human Reproduction,Beijing Chaoyang Hospital,Capital Medical University,Beijing100020,China卵母细胞体外受精及胚胎发育对生长环境有严格的要求，温度是重要的一个关键影响因素叫人的基础体温是37°C,所以最适宜卵母细胞成熟及胚胎发育的温度是37°C O但是在卵母细胞体外受精和胚胎发育的实际操作过程中，操作环境很难保持恒定的37°C,为了保证实验室人员的正常基金项目：首都医科大学科研培育基金(118208150802)=作者简介：韩烁(1989-),女，研究实习员。
小鼠卵巢玻璃化冻存不同时段FSH干预对Cx43表达的影响
用 。为此 ， 研 究 在 玻 璃 化 冻 存 的 不 同 环 节 中 ， 本 以 Ｆ Ｈ进 行 干 预 ， Ｓ 通过 检 测 Ｃ ４ ｘ ３的 表达 ， 观察 Ｆ Ｈ对 Ｓ
下 每 张切 片任选 ５个 视野根 据 卵 泡形 态 的 正常 与 否
ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆＣ ４ ｒ ｍ ｉｈ ｔ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｘ ３ ｆｏ ｈ ｇ ｏ ｌ ｗ ｉ ｕ ｎ Ｗ Ｓ ＯＧ —Ｆ Ｈ ，Ｆ —Ｆ Ｈ，Ｌ —Ｆ Ｈ，Ｃ ａ ｄ ＶＣ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ ｎ Ｇ，ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｈ ｒ ｅ ｅ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｅ ｐ ｃｉ ｌ ，ｔｅ ｅ ｗ ｒ ｉｎ ｆ ａ ｔ ｖ ｉ
Ｆ Ｈ ｉ ｅ ｖｒ ｌ ｒｃｓ ｏ ｖ ｒ ｃｔｎ（ Ｇ—Ｆ Ｈ） ｉ ｔｅｆ ｎ ｒｃｓ ｏ ｖ ｒ ｃｔ ｎ（ Ｇ—Ｆ Ｈ）ａｄｉ ｅｌｅ ｒｃｓ ｉｉ Ｓ ｎｔ ｅａ ｏｅｓ ｆ ｉ ｆ ａｏ Ｏ ｈｏ ｌ ｐ ｔｉ ｉ ｉ Ｓ ，ｎ ｈ ｏｔ ｏｅｓ ｆ ｉ ｆ ａｏ Ｆ ｒ ｐ ｔｉ ｉ ｉ Ｓ ｎ ｔ ｔ ｐｏｅｓ ｆ ｔ— ｎｈ ａｒ ｏ ｖ ｒ
２ １ 年 ９月第 ３ ０２ ４卷第 ９ 期
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文章 编 号 ：０ １— ９ ９ ２ １ ） ９— ８ ７— ３ １ ０ ５ ４ （ ０ ２ ０ ０ ２ ０
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小 鼠 卵巢 玻 璃 化 冻存 不 同时 段 Ｆ Ｈ 干 预 对 Ｃ４ Ｓ ｘ ３表 达 的 影 响
ｒ ｓｒ ｃ ］ ｏｂｅ ｔｖ Ｔ ｎ ｕ ｈ ｅ ｔｗ ｙ ｏ ｉ ａｉａｉｎ ｉｔｒｅ ｔ ｎ ｏ Ｓ ｖａ ｏ ｓｒａｉｎ ｔｅ ｅ ｐｅ ｓ ｎ ｏ ｘ ３ ｔａ ｔ Ａｂ ｊｃｉｅ ｏ ｆ ｄ ｏ ｔｔｅ ｂ ｓ ａ ｆｖｔ ｆ ｔ ｎｅｖ ｎｉ ｆＦ Ｈ ｉ ｂ ｅｖ ｔ ｈ ｘ ｒｓｉ ｆＣ ４ ． ｉ ｒ ｃ ｏ ｏ ｏ ｏ
不同玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响
不同玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响郑轶;周平【摘要】Objective:To compare the effects of different vitrification carriers on the freezing human ovarian tissue,and provide the theoretical and experimental basis in selecting frozen solution. Methods:The human ovarian cortex tissues were cut into the size of 10 mmí1 mmí1mm,randomly divided into the fresh group(group A),needle immersed vitrification group(group B),solid surface vitrification group( group C) and direct covered vitrification group( group D) according to different vitrification carriers. The fresh group were fixed by 10% formaldehyde,embeded in paraffin,sectioned and stained with hematoxylin and eosin. The other three groups were preserved in liquid nitrogen after freezing for two months, then fixed, sectioned and stained using rapid rewarming protocol. The proportions of normal primordium follicles in group B,C and D were calculated by histological analysis,which was used to analyze the frozen effects. Results:There were 809 primordial follicles in four groups,the proportions of normal primordium follicles in group A,B, C and D were 96. 12%,88. 14%,80. 00% and 81. 25%,respectively. The proportions of normal primordium follicles in group B,C and D were lower than that in group A(P<0. 01),but the differences of which between group B,C and D were not statistically significant (P>0. 05).Conclusions:Compared with the fresh tissue,the proportions of normal primordium follicles decrease after freezing,but the vitrification freezingcan be used to preserve the human ovarian tissue still.%目的：：比较不同的玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响,为人卵巢组织玻璃化冷冻方案的选择提供理论基础和实验参考依据。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究
采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究目的比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响，寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。
方法将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组，包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。
观察各组卵巢组织卵泡形态；冻融后的卵巢组织行体外培养，比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。
结果冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组，差异有统计学意义（P0.05），TV组卵泡正常形态率最低（P0.05）。
2.3培养液中激素的测定结果体外培养的10d中，与新鲜培养液相比，复苏后卵巢组织培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随着培养时间逐渐升高（图3A、3B）。
SSV组雌二醇和孕酮平均浓度明显高于其他组（P0.05）。
3讨论玻璃化冷冻过程需要一个特殊的载体承载冷冻保护液和组织细胞，对于卵巢组织而言，载体需要一定的容积同时要尽量减少所需冷冻液的体积以提高降温速度。
此外，当组织被浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹在组织周围，由于其低导热性形成有效的绝热区从而减缓了降温速度[9]。
由此可见，载体的选择要考虑上述多种影响因素。
目前已有多种载体被实验性地应用于玻璃化冷冻过程，如冷冻管（cryovial）、开放式拉长麦管[10]、最小微滴法和不锈钢网筛等。
冷冻管被应用于卵巢组织的程序化冷冻，但因管壁较厚和所需较多冷冻液，导致降温速度慢，不能满足玻璃化形成的需要。
在本研究中，冷冻管玻璃化组的正常形态原始卵泡仅为64.57%，冻存效果显著低于其他组。
Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷冻猴子的卵巢组织，复温后约70.4%的卵泡保存正常形态。
本研究中也使用了该方法玻璃化冷冻人卵巢组织，复温后形态学检测可见约78.36%的原始卵泡保存了正常形态，低于新鲜组和SSV组；体外培养后，生长卵泡比例增加，但仍低于新鲜组和SSV组，提示直接微滴玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态及发育潜能存在一定影响。
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析冷冻保存技术（Cryopreservation）对细胞存活率和功能恢复具有重要的影响。
在很多领域，包括医学研究，生物技术和生殖医学中，需要长期保存细胞样本或组织。
冷冻保存技术可以延长细胞的保存时间，但同时会对细胞造成一定程度的损伤。
本文将对冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响进行分析。
首先，冷冻保存技术对细胞存活率的影响是关键的。
当细胞被冷冻保存时，细胞内的水分会在冷冻过程中形成冰晶，这可能导致细胞脱水和细胞器的破坏。
为了尽量减少这些损伤，科学家们已经开发了各种冷冻保护剂，如甘油和二甲亚砜（DMSO），用于保护细胞免受冻结所引起的细胞脱水和冰晶形成。
这些保护剂可以在冷冻过程中起到稳定细胞膜和细胞内结构的作用，从而提高细胞的存活率。
此外，科学家们还不断改进冷冻的速度和方法，例如快速冷冻（快速冷却）和慢速冷冻，以进一步提高细胞存活率。
其次，冷冻保存技术对细胞的功能恢复也有影响。
在冷冻过程中，细胞内部的生物化学反应速度大大降低，细胞代谢活动几乎停止。
这可能导致细胞内重要蛋白质、酶和其他生物分子的结构和功能发生改变，使细胞在解冻后难以正常运作。
此外，冷冻保存过程中的细胞脱水和冰晶形成也可能导致细胞器的破坏，进一步影响细胞的功能。
然而，通过合适的解冻过程和适当的培养条件，可以促进冷冻保存后细胞的功能恢复。
例如，逐渐将细胞从低温解冻到正常温度，并提供适当的培养基和营养物质，有助于细胞逐渐恢复其正常的代谢活动和功能。
此外，不同类型的细胞对冷冻保存技术的影响可能有所不同。
某些类型的细胞，如干细胞和胚胎细胞，对冷冻保存更为敏感。
冷冻保存过程中可能导致干细胞或胚胎细胞的分化能力下降，细胞的干细胞特性丧失。
因此，在冷冻保存这些类型的细胞时，需要更加精细的处理和保护措施，以确保其存活率和功能的恢复。
另外，冷冻保存技术在不同研究领域和应用中也有一些局限性。
有些细胞或组织不适合冷冻保存，因为其细胞膜不耐受冷冻过程所引起的损伤。