卵母细胞的冷冻技术概要
玻璃化冷冻度
玻璃化冷冻液为VSI ( TCM199+HEPES+10%FCS+ 10%DMSO + l0%EG)和VSⅡ(TCM199+HEPES+20%FCS+20%DMSO+20%EG+0.5MSUCROSE)。
各种冷冻保护剂均具有保护作用，但效果不一样，甘油的效果较差，EG相对较好。
人卵母细胞在室温放置30 min，纺锤体就完全解聚，复温后仅25%一50%可恢复纺锤体结构，牛体外成熟卵母细胞在4℃保持10-20 min，纺锤体可完全解聚，而猪卵母细胞在4℃仅5 min，就会发生部分或完全解聚。
玻璃化冷冻和解冻冷冻：室温下将卵子在PBS+20％FCS(S)中冲洗2～3次后移入10％乙二醇(EG)+10％二甲基亚砜(DMSO)中停留30 s，然后移入20％EG十20％DMSO+0．5 mol／L糖中，用细麦管通过虹吸作用将卵吸入管中，投入液氮。
解冻：在室温下依次将卵子移入含0．4 mol／L糖、0．2 mol／I．糖、0．1 mol／L糖的S及s中，各停留3 min，再于37。
C中停留5 min，最后移入MEM中，准备体外培养成熟(IVM)当进人渗透压梯度较大的高渗溶液时，卵母细胞和卵丘细胞都大幅度收缩，造成二者牵拉、损伤，破坏了胞间连接。
比较了DPBS和TCM199对冷冻保护效果的影响，试验结果表明，二者在冷冻保护效果上无显著差异。
冷冻损伤包括两个因素:一是胞内冰晶造成的机械损伤;二是细胞在高浓度冷冻保护液中暴露时间过长造成的溶质损伤。
这些损伤的发生多在15℃和一5℃间的温度范围。
玻璃化冷冻胚胎的处理过程是影响玻璃化冷冻效果的重要因素。
冷冻前，先用预热到37 ℃, 1 M的DMSO预先处理胚胎5 min，可以使保护剂充分渗透到细胞内，并且因为保护剂浓度较低所以对胚胎产生的毒性作用小。
玻璃化溶液使用DAP213 (DMSO+丙二醇+乙酞胺)，其中DMSO为主要低温保护剂，促进渗透;丙二醇强化玻璃化形成能力;乙酞胺是毒性中和剂，降低了毒性作用。
[指南]辅助生殖技术
![[指南]辅助生殖技术](https://img.taocdn.com/s3/m/0aaedc2d590216fc700abb68a98271fe910eaf16.png)
辅助生殖技术辅助生育技术(artificial reproductive technology，ART)是指对配子、胚胎或者基因物质等进行操作而获得新生命的技术，它包括各种帮助不孕症患者妊娠的技术，如促排卵[yao]物治疗、人工授精(artificial insemina．tion，AH)和体外受精一胚胎移植(in vitro fertilization&emb~o transfer，IVFET)及其各项衍生技术。
目前在ART中的研究热点是IVF一ET及其各项衍生技术。
常规IVF一ET技术主要解决女性不孕问题，特别是输卵管性不孕；在该技术上结合显微操作技术、分子生物学、细胞遗传学等发展起来的衍生技术主要包括有胞浆内单精子注射(intracytoplasmie sperm injection，ICSI)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation geneticdiagnosis，PGD)等。
经过近20年的发展，ART已经取得了惊人的进步。
目前，我国大陆临床ART在许多方面基本上与国际水平接轨，不少中心常规IVFET的成功率已稳定在较高的水平[1]。
本文主要阐述近年IVF一ET及其衍生技术中涉及问题的研究进展。
1 常规IVF-ET常规IVF-ET是指从妇女体内取出卵子，体外培养后加入经过处理获能的精子使之受精，受精卵发育成2～8个卵裂球或囊胚后，移植入母体子宫内并使之着床。
它的适应症为女方输卵管性不孕、排卵障碍、子宫内膜异位症、免疫性不孕、男方轻度少精症、弱精症或畸精症、原因不明不孕特别是经过其他助孕方法多次失败。
主要程序包括控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、手术取卵、体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植等步骤。
1．1 COH方案的改进。
IVF能够获得成功的大前提是获得可以进行移植的优质胚胎，COH 的目的就是提供高质量的卵子以获得更多的优质胚胎，从而提高成功率。
OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察
OPS法玻璃化冷冻未成熟卵母细胞的效果观察章汉旺;任新玲;魏玉兰【期刊名称】《中国妇幼保健》【年(卷),期】2005(20)20【摘要】目的:探讨OPS(open pu lled straw,开放式拉细麦管)法玻璃化冷冻技术冻存未成熟卵母细胞的效果。
方法:小鼠GV期卵母细胞用OPS法玻璃化冷冻复苏后行体外成熟培养(in-vitro m aturation,IVM)或直接行IVM,所获成熟卵行体外受精(IVF)和胚胎的体外培养(IVC)。
以体内成熟卵行IVF/IVC作为in-vivo对照组。
结果:GV期卵冻融后65.11%存活,IVM后成熟率为52.86%,其成熟率显著低于IVM对照组。
冻融卵成熟后受精、卵裂率(33.78%、76.00%)低于IVM对照组和in-vivo对照组,培养后未见囊胚形成。
结论:OPS法玻璃化冷冻技术可有效冻存GV 期卵母细胞,复苏后可发育成熟,但卵的受精和继续发育能力欠佳。
【总页数】3页(P2633-2635)【关键词】玻璃化冷冻;未成熟卵母细胞;体外成熟培养【作者】章汉旺;任新玲;魏玉兰【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科生殖医学中心【正文语种】中文【中图分类】R711【相关文献】1.OPS法及自制冷冻叶法玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞的研究 [J], 高静;胡泊;徐华;巩小芸;蔡霞2.冷冻平衡液及保护剂的不同组合对小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻效果的影响[J], 袁水桥;杨瑞峰;周生来;孙绪磊;郑志红3.小鼠卵母细胞的OPS法玻璃化冷冻保存技术 [J], 李秀伟;吴通义;侯云鹏;周光斌;朱士恩4.绵羊体外成熟卵母细胞OPS法玻璃化冷冻保存试验 [J], 田树军;闫长亮;杨慧欣;杨中强;朱士恩5.小鼠未成熟卵母细胞OPS法冷冻保存技术的研究 [J], 罗光彬;朱增娟;袁水桥;张晓华;李东全因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法
卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。
安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml 冲洗液(WS)4.1个25mm 的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。
*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。
注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。
（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。
（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。
（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。
（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。
放进37℃的培养箱中完成恢复。
注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。
质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。
成分：*血清替代补充*基本培养基M-199 内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2*冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2: 6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
猪未成熟卵母细胞玻璃化冷冻的研究
．
浙江杭州 ３１２ ；． １０ １４ 山东省日照市畜牧局， ３ 山东 日照 ２６２ ） ７８６
摘 要 研 究 了乙二醇 （Ｇ 、 甲基 ＿ Ｅ ）二 Ｅ￣（ Ｍ Ｏ 、 ， Ｄ Ｓ ）丙二醇 （Ｒ Ｈ 和甘 油（Ｌ ） ４ ＰＯ ） Ｇ Ｙ 这 种渗 透性冷 冻保护剂及其 两 两组合 对玻璃 化冷 冻未成 熟（Ｖ期 ） 卵母 细胞的影响 ； Ｇ 猪 比较 了 ３ 种不 同冻前预处理 方法和 ２ 不 同的解 冻方 法。结 果表 明 ：Ｇ组 卵母 细胞 所取 得的 成熟 率为 种 Ｅ １、 ％ ， Ｄ Ｓ ２９ ０ 与 Ｍ Ｏ组 （ ． ％） Ｅ ８ ６ 及 Ｇ和 Ｄ Ｓ ２ Ｍ Ｏ混合 组（ ．ｌ ） ９ ６ ％ 差异 不显著（ ０ ０ ） 但 明显好 于其他 各组 （ ００ ）６步预 处理 法和 ３ Ｐ＞ 、 ， ５ Ｐ＜ ． ； ５ 步预 处理法所取 得的 卵母 细胞存 活率和成熟 率显著 高于 ｌ 步预 处理 法（ ００）成 熟率分 别为 １、 ％和 ｌ、１ ３步和 ４步解 冻法 Ｐ＜ ． ， ５ ２３ ３ １ｌ％； 取得 的成熟率要 显著好 于 ｌ 步解 冻法 ， 成熟 率分别达 ｌ． ％ 、 、 ％。 ２７ ０ ｌ４ ０７ 关键词 猪 ； 卵母 细胞 ； 玻璃化 冷冻 ； 外成 熟 体 中 图分 类号 Ｑ ５ 、 ９２ ６ 文献标 识码 Ａ 文章编号 ０ １ — ６ １２ ７ ｏ — １６ — ３ ５ ７ ６ １（ｏ ） ０６５ ０ ｏ ６
Ｋｅ ｒ ｓ Ｐ ｒｉｅ Ｏｏ ｙｅ Ｖｉｉ ｃｔ ｎ Ｍａｕ ａｉｎ ｙ ｗｏ ｄ ｏｃｎ ； ｅ ｔ； ｔｆａ ｉ ； ｔｒｔ ｒｉ ｏ ｏ
第五章动物卵母细胞与胚胎冷冻保存技术
2、细胞外冰晶损伤
慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。细胞外 液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高， 对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤。
随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液 的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为 溶液效应又称为化学损伤。
冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的 作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造 成的伤害也越大。这主要是由于细胞内外的电 解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏 和核膜的降解。
单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体 的排出，新陈代谢逐步加强）母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的 受损机制
卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存， 由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而 冷冻保存的难度较大。
在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤， 主要包括在以下几个方面：
快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶 核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对 细胞造成的损害较小。
如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活 ，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（ 如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复 温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶 重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的 超微结构而造成细胞的致命损伤。
目前，欧、美、日、加等国有上百家胚胎移植公 司从事牛羊胚胎移植业务。
在国内，牛的冷冻胚胎生产与移植已开始逐步商 业化。
第二节 胚胎与卵母细胞的冷冻保存原理
胚胎与精子细胞结构差异： 胚胎数量极少 胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为
120um),细胞质多,外包特殊膜—透明带。 胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为
1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母 细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达 11％～25％。
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范NYT1900-2010
畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范 NY T 1900-2010ICS 65.020.30B 43 NY中华人民共和国农业行业标准NY/ T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范Procedures for cell and embryo cryopreservation of domestic animals 2010-07-08 发布 2010-09-01 实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1900-2010前古目本标准遵照 GB/T 1. 1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC 274)归口。
本标准起草单位:全国畜牧总站。
本标准主要起草人:xiJ丑生、王志刚、赵俊金、史建民、孟飞、于福清、孙飞舟、邱小田。
INY/T 1900-2010畜禽细胞与胚胎冷冻保种技术规范1 范围本标准规定了用于保种的家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞冷冻保存技术要求。
本标准适用于家畜精液、家畜卵母细胞、家畜胚胎和畜禽成纤维细胞等遗传物质冷冻保存和检验人库。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4143 .牛冷冻精液GB 20557 山羊冷冻精液NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程3 术语及定义下列术语和定义适用于本文件。
3. 1超低温保存 cryopreservation在液氮中冷冻保存遗传物质的技术。
3. 2卵母细胞 oocyte来源于有腔卵泡具有繁殖能力的细胞。
3. 3成纤维细胞 fibroblast以畜禽组织或胎儿为材料，体外培养、分离出的梭形或不规则形细胞。
胞质近中央处有椭圆形胞核，胞体→般铺展很开，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。
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三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
非渗透性冷冻保护剂不能透过细胞膜，但可以增加细胞外溶 质浓度，在细胞膜内外形成渗透梯度，吸引细胞内水分外流， 使细胞脱水。 各种冷冻保护剂都各有千秋，需要按一定比例混合使用， 以加强效果。冷冻保护剂的浓度很重要，它决定了细胞脱水 的速率。
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
现在关于冷冻损伤有两个假说： ①胞内冰的形成，这是过快冷却所产生的，冰晶 会刺破细胞器，破坏细胞膜，造成冷冻损伤，因而冷 却速率越快，此损伤越大；
一、冷冻技术概述
②“溶质损伤”，也叫“溶液损伤”，这 是由过慢冷却所产生的，它使细胞在高浓度的 溶液中存在的时间过长而发生细胞失水，造成 了不可逆的的损伤，因而冷却速率越慢，此损 伤越大。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.2冷冻保存方法
由于慢速冷冻冷冻与超快速冷冻方法都需要昂贵的 程序化冷冻仪，推广应用并不广泛。现在常用快速冷 冻方法即玻璃化法冷冻。朱士恩等应用OPS法玻璃化 冷冻牛的卵母细胞，得到了很高的囊胚率，成功提高 了冷冻效率。
Open pulled straw（OPS）： 用酒精灯将0．25mi塑料 细管加热拉成OPS管。保证OPS管壁内径0．8～1．0mm，管 壁厚度约0．08mm即可。冷却后用刀片将其切开，细端长度 保持在2cm左右。
三、实验
OPS冷冻：将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑料 注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂1(EFS20溶 液中平衡25～30s，然后移入EFS40，EFSS0中平衡 25～30s)；再将部分培养28h的卵母细胞用带有lml塑 料注射针筒的口吸管连接的OPS管移入保护剂2(10％ EG+10％D溶液中平衡25～30s，然后移入EDFS30， EDFS40玻璃化溶液中平衡25～30s)。将含有卵母细胞 的OPS管放入至液氮中冷冻保存。每支OPS管最好装入 5-6枚卵母细胞。
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
一、冷冻技术概述
1.影响动物种质细胞冷冻保存的两个关键因素：
①冷冻模式 ②防冻剂 1.1常用的冷冻模式包括程序降温法和玻璃化法
程序降温法 利用程序降温仪，按照预先设计的 降温程序将细胞降低至植冰温度，再迅速降温至零下 35度，然后保存在液氮中的过程。
一、冷冻技术概述
玻璃化法 指将经过不同防冻剂浓度平衡后的细胞 直接投入到液氮中保存。高浓度防冻剂在快速降温过程中 由液态转化为一种类似于玻璃状的形态，而不形成冰晶， 不会产生细胞内冰晶形成所致的化学、物理损伤，使得冷 冻技术更加简洁，迅速，廉价。
三、实验
4.结果与讨论
4.1.将成熟培养28h后的卵母细胞经行麦管和OPS管冷冻， 2种方法采用相同保护剂处理，相同方法解冻，然后经行孤 雌激活培养，比较不同冷冻方式对牛卵母细胞的体外成熟 及孤雌胚发育的影响，结果见表l：
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
用带有12号针头的5ml注射器抽取卵巢表面直径为 2—8mm间卵泡中的卵母细胞和卵泡液。然后用PBS+5 ％FBS稀释后，在体式镜下检出卵母细胞。 挑选胞质均匀或暗凝，卵丘细胞层部分脱落以及致密 的卵丘—卵母细胞复合体进行成熟培养。
三、实验
2.卵母细胞的冷冻：
麦管冷冻：常规玻璃化(O．25mL细管)冷冻，将 室温调至20～28"0，在恒温台上使试验用具及试剂得 到充分平衡。试验操作在38℃恒温台上进行，首先将 培养28小时的卵母细胞转移到38．5℃的预处理液， 预平衡液中平衡25～30秒：然后再转移到10％EG+10 ％DMSO组成的EDFS30、EDFS40玻璃化溶液，平衡25～ 30秒。最后将卵母细胞保存在麦管中并在液氮中保存：
将含有卵母细胞部分直接浸入置于恒温台上的 含有牛卵母细胞冷冻保存与体外孤雌培养技术研究 0.25mol／L蔗糖解冻液的表面皿中，溶解后将卵母 细胞用口吸管轻轻吹出并摇动混匀，在此液中平衡 lmin，然后移入0.15mol／L蔗糖解冻液中平衡5min， 以充分脱出卵母细胞内部抗冻剂。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.3卵母细胞成熟阶段
不成熟的卵母细胞在冷冻，解冻后受精率和卵裂 率都较低。未成熟卵母细胞的成熟率和受精率要比成 熟的卵母细胞的成熟率和受精率低很多，冷冻损伤对 成熟的卵母细胞的影响更小。成熟卵母细胞比未成熟 卵母细胞对冷冻的耐受性高。
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.4 卵丘细胞的影响
二、卵母细胞的冷冻保存研究
1.影响卵母细胞冷冻的因素
1.1冷冻保护剂的影响 有研究认为PROH比甘油和DMSO相比，解冻后形 态正常率和受精率效果更好,PROH使细胞质变为无定 型状态，提高了膜的渗透性。甘油广泛用于牛胚胎的 冷冻，因为它毒性低；还有相关报道认为DMSO对细 胞骨架系统和糖酵解途径有特殊的毒性。