斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
中科院上海分院科学家发现斑马鱼中β-Arrestin1蛋白是胚胎造血系统发育的重要调控因子
牛的碱基 对数 量。克斯 廷说 ， 马有 ９ 多 种遗 传病与 人类相 ｏ
似， 如果能确定马的这些遗传 病 的基 因根 源 ， 就会帮 助人类 加深对 自身相关遗传病 的认识 。
国 际 科学 家共 同破 译 家 猪 基 因组 序 列 。
Ｄ一 氨基 酸氧化 酶是 首个 由 中国学 者发 现的 神经 性慢 性疼
・
７ ・ ４
生 物学 教学 ２１ 年（ ５ 第４ ０ ０ 第３ 卷） 期
乳香 酸提取于卡 氏乳香树的橡胶脂中 ， 氏乳 香树广泛 卡 分布于热带区域。我国海南省、 台湾南部 、 东南部 、 广 广西南
秘， 为后续兰花功能和进 化基 因组 学研 究打 下基础 ， 而且 会
为我国宝 贵兰花品种的种质资 源保 护提供科学 依据 ， 为兰 花 科植物基因资源的开发 和利用提供重要 资源 和技术平 台。
有助 于研发人类疾病治疗的新方法 据 ２０ ０ ９年 ｌ ３日《 １月 参考消 息》 引美联社 芝加哥 １ 援 １ 月 ２日电 ， 由美国伊诺伊 大学 厄巴纳一 尚佩思 分校生物学 教
授拉 里 ・ 斯库克领 导的国 际研 究 团队完成 了该项 研究 。科
型氨基酸氧化酶在神经源性慢 性疼痛 中的作用 ， 明它是治 证 疗神经源性疼痛 的新 的作 用靶 分子 ， 对欧美传统学 术观点和
上海交通大学科学家发现一个治疗 神 经源性疼痛 的新的分子 靶点
据 ２０ ０９年 １ 月 ｌ 《 １ １日 上海科 技报 》 消息 ， 上海交 通大 学药学 院王永 祥教授领衔 的研究 团队在神 经源性 疼痛 调节
研究 中取得了重要突破 ， 首次发现脊髓 Ｄ一型氨基 酸氧化酶
贵赛 马品种 ， 后引入一些 欧美和亚 洲 国家 ， 主要用 于赛 马 和
zebrafish免疫组化sabc
冰冻切片免疫组化Protocol目的：检测mice anti human insulin在斑马鱼胰腺组织的反应性试剂：0.01M PBS（pH：7.2－7.4）0.01M柠檬酸盐（pH 6.0）：1000ml ddH2O中加柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O）3g, 柠檬酸C6H8O7. H2O 0.4g一抗：mice anti human insulin, ready to use (迈新公司)3％过氧化氢溶液：30％H2O2：ddH2O（1：9）（自配）试剂盒：SABC试剂盒显色剂：新鲜配制DAB（1ml ddH2O中A、B、C液各一滴，用时混匀）苏木素：0.5％盐酸酒精：100ml 70％酒精中加入浓盐酸0.5ml中和碱：无水硫酸镁4g（或MgSO4 .6H2O 8g）、碳酸氢钠0.7g溶解于200ml双蒸水中。
封片剂：中性树胶二甲苯（I 、II）及梯度酒精（纯水稀释无水乙醇：100％，95％，90％，80％，70％）（1）60℃烤片20min（2）PBS洗3次（3）3％过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶（4）蒸馏水洗3次后，PBS洗3次（5）滴加SABC试剂盒封闭液，室温20min（6）甩去封闭液：A:阴性对照片不洗，加PBS; B:实验片不洗，加鼠抗人胰岛素一抗，室温2小时（7）PBS缓冲液漂洗3分钟×3次（8）滴加SABC试剂盒生物素化IgG（二抗），室温20分钟(9) PBS缓冲液漂洗3分钟×3次（10）滴加SABC试剂盒SABC液，室温20分钟，PBS缓冲液漂洗3分钟×3次（11）滴加新鲜配制的DAB溶液显色，显微镜下严密观察并注意控制反应时间（3-5min）（12）自来水冲洗终止反应,ddH2O冲洗2minX3（13）必要时苏木素复染胞核2分钟（14）切片经流动的自来水冲洗5次，直至切片颜色呈深蓝色（15）切片经蒸馏水冲洗2次（16）0.5％盐酸酒精溶液分色3－5秒(至切片变为淡红色或结缔组织无色为止，切片经流动的自来水冲洗) （17）切片浸入中和碱液30－60秒，自来水洗10－15分钟，并经蒸馏水冲洗2次（18）脱水：切片浸入70％、80％、90％、95％酒精以及无水酒精溶液I、II中脱水各5分钟（19）透明：切片浸入二甲苯/100％酒精（1:1）溶液、二甲苯I和二甲苯II各10分钟（20）中性树胶封片。
细胞分化的模型与实验验证
细胞分化的模型与实验验证细胞分化是指在多细胞生物中，通过特定的细胞分化过程，一种全能的细胞逐渐转化为特定功能的细胞类型。
如何模拟和验证细胞分化的过程，对于研究细胞发育和再生医学具有重要意义。
本文将介绍几种细胞分化的模型以及用于实验证明的方法。
一、借鉴经典的生物发生学模型生物发生学是研究生物体在发育过程中形态和功能的形成与发生的学科。
通过研究经典模式生物如果蝇、线虫和斑马鱼的胚胎发育过程，科学家们揭示了多种细胞分化的机制，为细胞分化的模拟提供了重要参考。
例如，在果蝇发育过程中，由于其胚胎透明且具有明确的时间点，研究者可以通过显微镜和基因工程手段观察和操控细胞分化的过程。
这些经典模型为我们提供了深入了解细胞分化机制的基础。
二、建立体外细胞分化模型1. 三维培养系统三维培养系统是一种模拟体内环境的细胞培养方法，通过在生物支架或凝胶中培养细胞，在形态和功能上更接近于体内状态，能够模拟细胞在多细胞体内的分化过程。
目前常用的三维培养方法包括细胞球体、胶束微球、仿生材料支架等。
这些方法可以模拟细胞在三维环境中相互作用和信号传导，促进特定细胞类型的分化。
2. 基因编辑技术的应用基因编辑技术如CRISPR-Cas9已经成为研究细胞分化的重要工具。
通过针对特定基因的敲除或突变，科学家们可以模拟细胞分化过程中的突变和功能缺失情况。
例如，在人类胚胎干细胞中，通过CRISPR-Cas9敲除特定的转录因子基因，可以观察到干细胞向特定细胞类型分化的过程。
这种基因编辑技术为验证细胞分化模型提供了准确且可控的手段。
三、实验验证方法1. 免疫组化染色免疫组织化学染色是一种常用的实验验证方法，通过使用特定的抗体标记目标蛋白在组织或细胞中的表达情况。
在研究细胞分化过程中，科学家们可以利用这种方法来检测分化特定细胞类型所表达的特定标志蛋白。
例如，在验证神经元分化过程中，可以使用神经元特异性标记如βIII-tubulin或NeuN来证实细胞已经成功分化为神经元。
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
斑马鱼侧线神经丘毛细胞发育的研究
斑马鱼侧线神经丘毛细胞发育的研究李雯;何英姿;孙珊;于慧前;李华伟【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》【年(卷),期】2014(000)001【摘要】目的：研究斑马鱼后部侧线系统神经丘细胞早期迁移及增殖分化过程。
方法选取不同发育阶段的野生型斑马鱼胚胎，采用免疫组织化学染色和原位杂交方法，观察斑马鱼后部侧线原基的迁徙以及神经丘的沉积过程，BrdU 标记原基增殖细胞，观察原基细胞团的增殖情况；选择不同发育时期的转基因斑马鱼（Brn3c：mGFP）胚胎，统计绿色荧光蛋白（GFP）阳性表达的神经丘毛细胞数目；采用活细胞染料FM1-43FX标记神经丘中的功能性毛细胞并进行统计计数，BrdU 标记神经丘增殖细胞，观察神经丘细胞的增殖情况。
结果受精后20小时的斑马鱼侧线器基板沿水平肌隔开始向后迁移并形成后部侧线神经丘，迁徙速度约为1．7肌节/小时；受精后48小时，初级后部侧线系统基本发育完全，包括躯干部的5～6组神经丘细胞团，尾部的2～3组神经丘细胞团；受精后3、5、7天时的斑马鱼神经丘毛细胞数量分别为5．68±1．46、10．10±0．99、12．45±1．32个；FM1-43FX阳性毛细胞数量分别为3．68±1．11、8．18±1．86、10．22±1．24个。
结论受精后3～7天是斑马鱼侧线神经丘毛细胞发育的活跃时期。
%Objective This study aims to examine the development of the posterior lateral line of the zebrafish and establish ant model to study the process of hair cell differentiation and regeneration .Methods We observed the posterior lateral line system formation by DAPI immunohistochemistry and whole mount in situ hybridization .We further evaluated hair cells differentiationwithin neuromast by using Transgenic Tg (Brn3c:mGFP) zebrafish and stained the functional hair cells by the mechanotransduction marker FM 1 -43FX .We labelled proliferating cells in primordium and neuromast by addition of BrdU to the system water .Results The posterior lateral line primordium originated from a sensory placode and started its journey at around 20 hours post fertilization to migrate along the horizontal myoseptum to the tail -tip with a constant speed (1 .7somite/hour) .The primordium depositd five or six neuromasts spaced along the body ,and two or three terminal neuromasts at the tail -tip at 48 hours post fertiliza-tion .At 3 ,5 and 7 days post fertilization ,zebrafish contained 5 .68 ±1 .46 ,10 .1 ± 0 .99 ,and 12 .45 ± 1 .32 hair cells perneuromast ,respectively .Furthermore ,the average number of FM1-43FX stained hair cells within each neuro-mast were 3 .68 ± 1 .11 ,8 .18 ±1 .86 ,and 10 .22 ± 1 .24 ,respectively .Conclusion We establish the development model of hair cells in zebrafish lateral line neuromast and suggest that3 to 7 days post fertilization is an important period for lateral line neuromast differentiation .This study would be useful for underlying the mechanisms of hair cell differentiation and regeneration .【总页数】7页(P60-66)【作者】李雯;何英姿;孙珊;于慧前;李华伟【作者单位】复旦大学附属眼耳鼻喉科医院上海 200031;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院上海 200031; 复旦大学医学院生物医学研究院;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院上海 200031;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院上海 200031;复旦大学附属眼耳鼻喉科医院上海 200031; 复旦大学医学院生物医学研究院【正文语种】中文【中图分类】R764.35【相关文献】1.顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞损伤及再生模型的建立 [J], 芈肖肖;严健;李圆;施军平2.顺铂损伤后幼年斑马鱼侧线毛细胞STAT3的表达及意义 [J], 翁宇航;陈飒;周金章;刘惠刚;龙孝斌3.西伯利亚鲟侧线神经丘发育过程的观察 [J], 程千千;施志仪;陈晓武;宋佳坤;轩兴荣4.顺铂引起斑马鱼侧线毛细胞凋亡的实验研究 [J], 芈肖肖;孔肖雯;李圆;施军平5.Wnt/β-catenin信号通路对斑马鱼侧线毛细胞再生影响的实验研究 [J], 芈肖肖;严健;李圆;施军平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22
斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。
在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。
因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。
操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。
实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。
(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。
避免漏加溶液。
(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。
一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。
(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。
吸时动作要轻。
任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。
(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。
第一天以下操作需戴乳胶手套。
1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。
1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。
梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。
稀释时间宁长勿短。
特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。
1.2 PBST处理5分钟，两次。
2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。
斑马鱼肝脏组织油红O染色方法比较优化
斑马鱼肝脏组织油红O染色方法比较优化赵方新;李怡;张烜;陆景坤;牛燕;丁枫;武建强【期刊名称】《医学信息》【年(卷),期】2022(35)17【摘要】目的通过设置不同染色步骤、条件,探索适合处理斑马鱼肝脏的冷冻切片油红O染色方法。
方法取3月龄斑马鱼肝脏OCT样品,设置6、8、10、12μm四种不同厚度切片各两片,其他各组切片厚度均为8μm,采用不同的处理方法处理两张切片。
染色后置于显微镜下观察视野内组织完整度、背景情况、橘红色脂滴的染色面积、位置以及深染的细胞和位置形态。
结果以4%多聚甲醛固定、10%~30%蔗糖梯度脱水,切片厚度设置8~10μm,室温晾干1 h,甲醛(4%)固定10 min,油红O 染色10 min,60%异丙醇分化2 s,ddH_(2)O浸洗浸泡5 s后,苏木素染色3 min,ddH_(2)O浸泡30 s去浮色,1%盐酸酒精分化2 s,流水冲洗2 min返蓝,甘油明胶封片为条件进行油红O染色的效果较好,斑马鱼肝组织组织完整、背景清晰,脂滴染色效果较好。
结论优化的斑马鱼油红O染色方法可以较为清晰地显示肝脏脂滴,可辨别细胞核轮廓位置,进而对斑马鱼肝病模型中的脂肪变性情况进行定位与半定量的分析。
【总页数】5页(P27-30)【作者】赵方新;李怡;张烜;陆景坤;牛燕;丁枫;武建强【作者单位】内蒙古医科大学基础医学院医学实验中心【正文语种】中文【中图分类】R446.8【相关文献】1.弹性蛋白免疫组织化学染色与醛复红弹性纤维染色方法的比较2.油红O及苏丹黑B对重度脂肪肝组织脂质染色效果的比较3.实验用斑马鱼成鱼内脏组织病理学检查方法的优化4.油红O染色在斑马鱼体内脂质染色中的应用5.脂蛋白肾病肾脏组织油红O染色方法改良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
模式动物斑马鱼
模式动物斑马鱼斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
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斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色
斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。
固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。
实验步骤：
1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。
固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一
种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。
可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。
使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。
2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。
丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。
4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。
5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。
6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。
7. 用封闭液清洗胚胎2次。
8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。
加入合适浓度的一抗。
一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。
9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。
根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。
10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。
11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。
12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。
13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。
14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。
15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。
爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。
一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。