免疫组织化学实验
免疫组化实验方法
（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液 等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收 光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。
3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200） 褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高
（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
精选ppt
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荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC） 黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～ 495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。最常用。
精选ppt
3
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） • 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂
片）。 • 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
细胞免疫组织化学实验流程及注意事项
九、细胞免疫组化实验
1. 细胞爬片的制作
(1) 细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为2-5×10^5ml ；
(2) 在无菌培养皿中铺上3 块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠；
(3) 取细胞悬液分别滴到圆片或载玻片上，注意不要滴到片外，让细胞贴片30min 左右;
(4) 30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢)
2. 组化前处理
(1) 取出培养皿，用PBS 漂洗3 次×2min （PBS 可以不灭菌）；
(2) 4%多聚甲醛处理（室温）10-30min ；
(3) PBS 漂洗，3 次×2min ；
(4) 0.2%Txiton X-100 处理（室温）10-15min ；
(5) PBS 漂洗，3×2min；
(6) 3%H2 O2 处理（室温）10min ，以消除过氧化物酶；
(7) PBS 漂洗，3 次×2min ；
3. 组化（同免疫组化）。
贴壁细胞需要做免疫组化时，可以在培养皿里放入盖玻片，让细胞长在上面后，在取出来进行实验。
需要注意的是：取出培养好细胞的盖玻片后，PBS洗两次后，室温晾干用PFA或丙酮室温或4度固定都可以，10～15分钟。
之后可按组化常规方法进行。
封片时将有细胞的面向下盖在载玻片上即可。
另外，用丙酮固定细胞的同时即对细胞膜进行了打孔的步骤，如果用PFA进行固定，则需要再使用打孔剂打孔（细胞内表达）。
使用过氧化氢去除内源性过氧化物酶时，细胞要比石蜡切片的组织反应强烈，偶尔会掉片。
免疫组织化学实验流程
免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。
以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。
抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。
实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。
二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。
将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。
在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。
三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。
加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。
用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。
四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。
可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。
五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。
将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。
需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。
因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。
二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
四、免疫组化实验用抗体的选择1、一抗选择要点(1)选择单克隆还是多克隆抗体。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
免疫组化
• 注意事项： • （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 • （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏， 可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液， 然后于皿中加入高一级脱水剂。 • （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软， 助长材料的解体。 • （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则 会使组织变脆，影响切片。 • （5）如需过夜，应停留在70%酒精中。 • （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色 混浊现象。
• 1.4．透明 • 透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料 透明，增记折光系数；同时便于下步的浸蜡和 包埋等程序。 • 常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是 逐级进行，可减少材料收缩。 • 步骤为：纯酒精、二甲苯等量混合液15min， 二甲苯Ⅰ15mi意事项 • （1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空 气中的水分进入。 • （2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为 了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 • （3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾 状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精 中重新脱水，然后再透明。
2)100% 无水酒精： 2 次/5 min；
3)95% 酒精 2 min；
4)80% 酒精 2 min；
5)70% 酒精 2 min；
6)蒸馏水:5 min；
具 体 操 作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
免疫组化实验
2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内 进行结合反应。一般用Triton X-100、 蛋白酶k等通透液。
免疫组化实验
(2)封闭内源性过氧化酶
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至1000 ml；1000 ml0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H 2 O 2 。
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3 steps
preparing the tissue
被检测细胞和组织的制备
SECTION
DEWAX
制片
脱蜡
PRETREAT 预处理
SPECIAL STAINS 特异性染色
doing the stain
检测过程
IMMUNOHISTOCHEMISTRY 免疫组织化学 IN SITU HYBRIDIZATION 原位分子杂交
In situ Hybridization
To identify a specific gene sequence (DNA or RNA) in intact cells or tissues . 使用一个特定序列的分子探针在细胞或组织的特定位置检测一个相应 的基因
probe
(mRNA)
In situ = Inside (cell/tissue)在组织细胞内 Hybridization = Specific Binding of a Probe探针与目的序列 产生特异性结合 Detection = Visible Reaction 形成一个可见的反应
Immunohistochemistry
To identify an antigen in intact cells and tissues 使用一个特定的抗体在细胞或 组织检测相应的目的抗原
Immuno Histo Chemistry
= Antibody 抗体 = Tissues 在组织内与相应的抗原结合 = Visible Reaction 产生可见的呈色反应
Getting the best from IHC and ISH
免疫组织化学 and 原位分子杂交
Contents
1.What is IHC and ISH? 免疫组化和分子杂交 2. What is the effect of fixation? 固定的影响 3. Sample pre-treatment 标本的预处理 4. IHC protocol 免疫组化的基本过程 5. Optimizing IHC 如何做好免疫组化 6. IHC Applications 免疫组化的应用 7. ISH protocol 8. Optimizing ISH
IHC
Streptavidin- Conjugate 抗生物素 蛋白—酶 复合物
Secondary Antibody 生物素化二抗
Primary Antibody 一 抗 Vimentin Chromogen
In situ hybridization 原位分子杂交
三抗＋酶
StreptavidinConjugate
reading the slide
检测信号的判读
IMAGE CAPTURE
In situ assays:Three main variables
影响原位检测的三个主要因素 III. 检测 DETECTION
Least！ important
II. MOLECULAR PROBE 抗体和探针 (Ab/Probe)
二抗
Secondary Antibody
一抗
Primary Antibody
探针
Target Gene (mRNA)
Probe
Chromogen
IHC and ISH =In situ detection 免疫组化和原位杂交检测的三个共同步骤
FIX TISSUE 标本的固定 EMBED 标本的包埋
Blocks of excised tissues that are fixed and embedded in a wax or resin or frozen and then cut into thin sections.冰冻、石蜡或树脂 切片 Sometimes tissues imprints are also used. 组织印片
5um Weak Staining as only part of cell available 仅有部分细胞适用
3 Categories:
Fixatives
Coagulant fixatives 凝固性固定剂 Precipitate proteins, good preservation of antigenicity, some morphological distortion (Alcohols, ketones, acids, heavy metals)使蛋白 质产生沉淀 可以良好的保存组织的抗原性 但也可对形态产生某些不良影响 Cross-linking fixatives交连性固定剂 cross-links between amino groups. Good morphological preservation, some loss of antigenicity (Aldehydes, epoxides) 使蛋白质氨基酸分子间产生交连 可以良好的保存形态结构 丧失某些抗原活 性 Combination fixatives Mixture of the above two, balance of morphological and biological activity. 使用两种以上的不同类型的固定剂 形成在保存抗原性与形态良好之间的平 衡
利用‘cytospins离心涂片机’制备的悬浮培养细胞涂片
3. Smears of a fluid prep (blood smears)
体液涂片和血涂片
10-40um
Weak Staining if membrane not removed
染色弱的原因是膜未通透
Sample Type: Tissue Sections
Medium ！！ importance
I. 标本的制备 SAMPLE
Most ！！！ important
Sample Type: Monolayers 单层
1. Layer of cells grown on a solid substrate
生长在固相支持物上的单层细胞
2. Suspension cells that have been concentrate onto a solid substrate (cytospins)