最新化学发光免疫检测
化学发光免疫测定
时间分辨荧光法 消除样品背景干扰的另一种方法是时间分辨荧 光法。样品背景的荧光寿命一般为10ns，而镧 系鳌合物的荧光寿命一般为10-100μs。且斯托 克斯位移较大，很适用于时间分辨法进行测定。
时间分辨荧光免疫原理图
（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）
3 化学生物发光免疫分析法的特点 （1）优点： 高灵敏度 宽的线性范围 分析速度快 高选择性 高稳定性 花费少 所用试剂无毒 消除放射性同位素的污染。
（2）缺点： 实验结果的重复性方面存在一定问题 发光免疫测定是一种瞬时的化学反应 免疫反应中各种因素的干扰 氧化反应中各种因素的干扰 对催化反应原理有的还不十分清楚，对 实验的反应条件不易控制，干扰现象不 易估计和说明。
2. 发光标记物 （1）发光反应中消耗掉的标记物 a．Luminol及其衍生物 Luminol偶联于配体后，其发光效率较低 Isoluminol及其衍生物被广泛应用 Luminol的氨基取代导致Ф降低 Isoluminol的氨基取代导致Ф增加 此类标记可用于各种分析物，但CL需催化 剂，因此有较高的背景信号。
荧光免疫分析法优点： 消除放射性同位素的污染 稳定性较好 缺点： 高的背景光，限制了灵敏度 干扰测定
三．化学发光免疫分析法 这种分析方法既有发光检测的高灵敏度，又有免 疫分析法的特异性。 1．主要发光体系 鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物 焦焙酚 光泽精 吖啶酯 1，2-双氧基化合物 过氧化草酸酯 萤火虫发光体系 细菌发光体系
3 酶免疫分析法
用酶标记抗原或抗体 例：酶联免疫法测定氯霉素 微量反应板——羊抗兔IgG抗体 兔抗氯霉素抗体+氯霉素酶结合物 +氯霉素样品 没有结合的酶结合物被洗去，再向相应孔中加入 过氧化氢和邻苯二胺，作用一定时间后，结合后的酶 结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物，加入终 止液后颜色由蓝变黄，用波长450nm（双波长时最适 参考波长≥600nm）酶标仪进行检测，吸光值与样品 中氯霉素含量成反比。 酶不稳定、光度分析线性范围窄
免疫发光常见检测项目
免疫发光常见检测项目免疫发光是一种用于检测生物体中特定分子的方法，利用特定的抗体结合目标分子后，再结合荧光素酶等酶促发光物质产生荧光或发光信号，通过测量光信号的强度来判断目标分子的存在与浓度。
免疫发光技术已经广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物筛选中，以下是免疫发光常见的检测项目：1. 甲型肝炎病毒(HAV)抗体检测：使用免疫发光法检测患者体内是否存在甲型肝炎病毒抗体，用于诊断甲型肝炎和评估疫苗免疫效果。
2. 丙型肝炎病毒(HCV)抗体检测：通过检测丙型肝炎病毒抗体来判断患者是否感染了丙型肝炎病毒，用于早期诊断和治疗监测。
3. 人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体检测：利用免疫发光技术检测患者体内是否存在HIV抗体，用于早期发现HIV感染并进行防治工作。
4. 乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原检测：用于检测患者体内是否存在乙型肝炎病毒表面抗原，用于早期诊断和治疗监测。
5. 梅毒螺旋体特异抗体检测：通过检测患者体内梅毒螺旋体特异抗体来判断是否感染了梅毒，用于早期发现和诊断。
6. 甲亢相关抗体检测：用于检测患者体内是否存在与甲状腺功能亢进相关的抗体，帮助诊断和评估甲亢的程度。
7. 进展性多灶性白质脑病相关抗体检测：通过检测患者体内特定的抗体，帮助早期诊断进展性多灶性白质脑病。
8. 自身免疫性肝炎相关抗体检测：利用免疫发光技术检测患者体内是否存在与自身免疫性肝炎相关的抗体，帮助早期诊断和治疗选择。
9. 甲状腺自身抗体检测：通过检测患者体内存在的甲状腺自身抗体，帮助诊断自身免疫性甲状腺疾病。
10. 类风湿因子检测：通过检测抗体类风湿因子的存在来诊断类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
11. 癌胚抗原(CEA)检测：用于检测患者体内是否存在癌胚抗原，用于早期诊断以及治疗效果的监测。
12. 前列腺特异抗原(PSA)检测：通过检测前列腺特异抗原的存在来筛查和诊断前列腺癌。
以上是免疫发光常见的检测项目，通过检测特定分子的存在和浓度，免疫发光技术为临床医生提供了快速、准确、灵敏的检测手段，对于疾病的早期诊断、治疗效果的监测以及临床研究具有重要意义。
免疫发光常见检测项目
免疫发光常见检测项目免疫发光技术（immunofluorescence）是一种常见的免疫检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
免疫发光检测项目包括许多常见的检测目标和应用领域，下面将介绍一些典型的项目。
1.抗核抗体（ANA）检测：ANA是自身免疫疾病的重要标志物，如系统性红斑狼疮。
ANA检测通过检测体液中的抗核抗体，能够帮助医生诊断自身免疫疾病并评估疾病的严重程度。
2.甲状腺抗体检测：甲状腺抗体（抗甲状腺球蛋白抗体和抗甲状腺过氧化物酶抗体）的检测用于甲状腺自身免疫疾病的诊断，如自身免疫性甲状腺炎和Graves病。
3.肾炎相关抗体检测：包括抗肾小球基底膜抗体、抗肾小管基底膜抗体和抗核细胞抗体等，是诊断肾炎和相关疾病的重要依据。
4. I型和II型糖尿病抗体检测：I型糖尿病是自身免疫性疾病，I型糖尿病患者体内可出现胰岛β细胞相关的抗体，如抗胰岛细胞抗体和抗谷氨酰-tRNA合成酶抗体。
II型糖尿病患者体内不产生这些抗体。
5.抗神经元抗体检测：用于诊断神经免疫性疾病，如抗NMDA受体脑炎、抗VGKC复合物抗体相关性脑炎等。
6.单克隆蛋白（M蛋白）定量检测：单克隆蛋白（monoclonal protein）是指由单个淋巴细胞克隆产生的一类异常免疫球蛋白。
定量测定血液中的M蛋白水平，可用于诊断多发性骨髓瘤、类白血病及其他与异常免疫反应相关的疾病。
7.性激素检测：通过检测血液中的性激素水平，可以帮助诊断和评估不孕症、性发育异常、多囊卵巢综合征等与性激素水平异常相关的疾病。
8.传染病相关抗体检测：包括乙肝病毒表面抗体、乙肝病毒核心抗体、丙肝病毒抗体等，用于诊断和监测乙、丙肝等传染病。
9.肿瘤标志物检测：包括癌胚抗原（CEA）、前列腺特异抗原（PSA）、癌细胞血清抗原（CA125）等常见的肿瘤标志物检测，可用于肿瘤早期筛查、诊断和预后评估。
10.抗感染性疾病抗体检测：如HIV抗体检测、梅毒抗体检测、布鲁氏菌抗体检测等，用于感染性疾病的诊断和筛查。
化学发光免疫检测操作流程
化学发光免疫检测操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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免疫荧光层析法 化学发光
免疫荧光层析法化学发光免疫荧光层析法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）和化学发光（Chemiluminescence）是两种常用的检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
本文将介绍这两种技术的原理、步骤和应用，以及它们之间的区别和优缺点。
免疫荧光层析法是一种利用抗体与特定抗原结合后可发出荧光信号的检测方法。
它的原理是将标记有荧光染料（如荧光素）的抗体与待检样品中的目标抗原结合，形成免疫复合物。
通过荧光显微镜观察，可以检测到目标抗原的存在与否。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和无需放射性标记物的优点，被广泛应用于病原微生物的检测、抗体的定量和细胞蛋白的定位等研究领域。
化学发光是一种利用化学反应产生的光信号来检测目标物质的方法。
它的原理是将待检样品中的目标物与标记有化学发光底物的抗体结合，形成免疫复合物。
当加入特定的激发剂后，底物会发生化学反应，产生可见的光信号。
通过光电倍增管或摄像机的检测，可以定量地测量化学发光强度，从而判断目标物的含量。
化学发光方法具有高灵敏度、宽线性范围和较低的背景信号等优点，因此在临床诊断和生物工程领域得到广泛应用。
免疫荧光层析法和化学发光在实验步骤上存在一些差异。
免疫荧光层析法的步骤包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和显微镜观察等。
而化学发光的步骤则包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和化学反应等。
两种方法的原理都是基于抗体与抗原的特异性结合，但在标记物和检测信号的产生上有所不同。
免疫荧光层析法和化学发光在应用上也存在一些差异。
免疫荧光层析法常用于检测细胞表面标记物、病原微生物和抗体等，广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
而化学发光常用于检测肿瘤标志物、药物残留和基因表达等，被广泛应用于药物研发和生物工程领域。
两种方法在不同领域有着各自的优势和适用范围。
总的来说，免疫荧光层析法和化学发光是两种常用的生物分析技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛应用的特点。
化学发光免疫分析
3
在血循环中，约99.5%的T3与TBG结合，但T3与TBG的亲和力明显低于T4；T3不与TBPA结合
参考范围：0.58—1.62 ug/dL 临床意义： T3升高：⑴见于甲状腺功能亢进的病人，轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化较T4明显，适合轻型甲亢、早期甲亢和亚临床甲亢以及甲亢治疗后复发的诊断；T3型甲亢仅有T3和FT3升高； ⑵与T4一样，T3亦受TBG变化影响，但受影响程度不及T4。 T3降低： ⑴仅于较重甲状腺功能减退的病人，T3和T4均下降，轻型甲减T3不一定下降； ⑵重症全身性疾病状态或慢性病变可导致T3下降，多见于慢性肾功能不全、慢性心功能不全、糖尿病、心梗等疾病的患者。
参考范围：5.0—14.5ug/dl（CENTAUR） 临床意义： T4升高：⑴见于甲状腺功能亢进的病人，但轻型甲亢、早期甲亢、亚临床甲亢的变化未如T3明显； ⑵凡引起TBG升高的因素均可使T4升高，如妊娠、应用雌激素、葡萄胎、淋巴瘤、血卟啉病等；⑶药物如胺碘酮、含碘造影剂、β受体阻断剂、奋乃近、海洛因等 T4降低： ⑴见于甲状腺功能减退的病人，轻型甲减、亚临床甲减的变化较T3明显； ⑵缺碘性甲状腺肿可见T4降低或在正常低限，而T3正常； ⑶肾病综合征、肝功能衰竭、遗传性TBG缺陷症、肢端肥大症、重症全身性疾病状态等；⑷以及应用糖皮质激素、雄激素、生长激素、苯妥英钠等药物
血清FT3和FT4降低： ⑴甲减病人两者皆下降，但轻型甲减、甲减初期多以FT4下降为主；⑵低T3综合征仅有FT3下降； ⑶某些药物，如苯妥英钠、多巴胺、糖皮质激素也可使FT3和FT4降低。
临床意义：
T3、T4均升高：高TBG血症、甲亢、甲状腺激素不敏感综合征。 T4升高，T3正常或下降：家族性白蛋白异常性高T4血症；胰高血糖素瘤；药物普萘洛尔、胺碘酮、胆囊造影剂；全身性疾病、精神性疾病；苯丙胺成瘾；T4型甲亢、甲亢伴T4转换T3障碍。 T4正常，T3升高：T3型甲亢；甲减用T3或者其他甲状腺激素制剂替代治疗后 T4正常，T3下降：患有全身性疾病时；5’单脱碘酶活性下降；血皮质醇升高的各种情况；营养不良综合征。 T4下降、T3升高：医源性甲亢；甲状腺功能正常病人服用甲状腺激素制剂。 T4下降，T3正常：轻至中度甲减；碘缺乏；苯妥英钠、卡马西平。 T3和T4均下降：中至重度甲减；重症全身性疾病；低TBG血症；大剂量使用水杨酸制剂
临床免疫检验：直接化学发光免疫分析
胰岛素 C-肽 肌红蛋白 肌钙蛋白
思考题
LOGO
1.直接化学发光免疫分析的原理是什么？方法类型有哪些？ 2.常用的直接化学发光剂是什么？
小结
01
直接化学发光免疫分析的检测原理
02
直接化学发光免疫分析的方法类型
03 直 接 化 学 发 光 免 疫 分 析 的 关 键 技 术
04
直接化价
活化吖啶酯可直接标记抗 原或抗体，结合物稳定， 不影响吖啶酯发光效率及
抗原或抗体免疫活性
吖啶酯具有化学发光反应 简单、快速，发光本底较 低，无需催化剂等优点
02 01
LOGO
固相载体采用纳米磁性微球
03
可增大包被面积，加快反应
“分离-洗涤”简便、快捷
吖啶酯发光为瞬间发光，持
04
续时间短，对信号检测仪的
灵敏度要求较高
临床应用
激素
甲状腺激素 生殖激素
肾上腺激素 垂体激素
治疗药物监测
茶碱 地高辛 环孢素 巴比妥
贫血因子
维生素B12 叶酸
红细胞叶酸 铁蛋白
过敏性疾病
总lgE 特异性lgE
肿瘤标记物
AFP CEA PSA CA19-9
骨代谢
骨胶原酶 脱氧吡啶啉
LOGO
病原体血清 标志物
HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb
现对超微量物质的定量分析方法
化学发光剂
LOGO
化学发光免疫分析使用的发光剂是吖啶酯
方法类型
LOGO
夹心法
1
间接法
2
竞争法
3
检测原理
LOGO
发光标记物的制备
LOGO
化学发光微粒子免疫检测法
化学发光微粒子免疫检测法
化学发光微粒子免疫检测法（Chemiluminescent Micro-
Particle Immunoassay，CMIA）是一种常用的免疫分析技术。
它结合
了生物技术和化学技术，可快速、敏感、特异地检测多种分子，包括
蛋白质、抗体、激素、细胞因子等。
CMIA的原理是将待检测物（如血清中的某种蛋白质）与特异性结合该蛋白的抗体标记的化学发光微粒子结合，形成固相免疫复合物。
然后加入激发化学发光作用的底物，使该微粒子发出光信号。
根据光
信号的强度来定量检测待检测物的浓度。
CMIA具有以下优点：1）灵敏度高，检测下限可达到pg/ml级别；2）特异性好，可以将同类标记物分别检测；3）操作简便，无需专业
培训即可进行；4）试剂稳定性好，不受温度、湿度等环境因素的影响。
CMIA目前已广泛应用于临床检测中，例如检测乙肝表面抗原、
HIV抗体、丙型肝炎病毒抗体等。
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吖啶酯
CH 3
N+
- HO 2
CO
O
CH 3 N
O CO O
R R
CH 3 N
O CO O
+ CO2+ 光
吖啶酯发光
代表仪器：拜耳公司的ACS180 西门子的ADVIA Centaur 雅培的ARCHITECT
异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更 快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯 在缓冲液不稳定、易水解的缺点
ADVIA Centaur
西门子 固相磁粉化 学发光
吖啶酯,直接 发光
链霉亲和素 －生物素间 接包被
170T/H
磁珠包被 200T/H
常规单克隆 磁性微粒子 磁性微粒子
Ag/Ab包被 包被技术
包被技术
400T/H
180T/H
240T/H
国产全自动化学发光仪
企业 迈瑞 安图 新产业 迈克 威高
长光华医 博奥塞斯
cobas® e601
罗氏 电化学发光
三联吡啶钌 直接发光
ARCHITEC T® i 2000 SR
雅培
化学发光微 粒子
Unicel® DxI800
贝克曼 微粒子酶促 化学发光
LIAISON
索灵 磁性微粒子 化学发光
吖啶酯衍生 物
直接发光
金刚烷 AMPPD
AKP，酶促发 光
异鲁米诺衍 生物ABEI
直接发光
AMPPD
ALP /OH —
O O OCH3
光
OHPO4
2—
1. 酶促化学发光
反应原理图
利用酶对发光底物催化作用而直接发光， 通过光强度的测定而直接进行定量。
1. 酶促化学发光
• 特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的 稳定性不如直接化学发光好。
• 代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS 2、 DXI800
仪器型号
CL-2000i
Autolumo A2000
MAGLUMI 4000
IS 1200
AutolumiS 2000
EVERESYS A1800
Axceed 260
发光机制 ALP+AMPPD
HRP
测试速度 240T/H 200T/H
ABEI+NaOH、 H2O2 HRP
ABEI+NaOH、 H2O2
HRP
辣根过氧化物酶 常用的底物为鲁米诺或其衍生物
碱性磷酸酶 常用的底物为AMPPD和4-MUP
ALP
1. 酶促化学发光
鲁米诺在碱性缓冲液中被HRP催化发生氧化反应
鲁米诺
H2O2 /OH — HRP
+N2 + H2O + 光
1. 酶促化学发光
AMPPD在碱性条件下，被ALP酶解生成相当稳定的AMP-D阴离子， 其有2～30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在 15min时其强度达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定
delay 2.5s
delay 0.1s
+ NaOH
+ H2O2
激发底物1
激发底物2
发光
异鲁米诺发光
代表仪器：瑞典索灵公司的LIAISON、新产业MAGLUMI 2000/4000
电化学发光
• 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质 • 特点：①反应在电极进行；
②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌
吖啶酯
240T/H 120T/H 220T/H
180T/H
鲁米诺衍生物 180T/H
测试项目数 20 65 95 17 42
34 35
测试题与讨论
1. 酶促化学发光是发光底物经
作用而发出光,常用的酶有：
和
。
的降解
2. 雅培ARCHITET i2000采用
标记的
标记分子，专利的
衍生物，具有更
高的发光效率以及稳定性。
三联毗啶钌 分子结构图
N
N
N
Ru
N
N
N
O O
N
O
O
电化学发光反应原理
这一过程可在电极表面周而复始地进行， 产生许多光子，使光信号增强
底物：三联吡啶钌[Ru(bpy)2+3]、三丙胺(TPA)
电化学发光
代表仪器：罗氏e601、e411
进口全自动化学发光仪
仪器型号
生产厂家 反应原理 标记物
包被方式 测试速度
化学发光免疫检测
学习目标
1. 化学发光检测的分类及原理 2. 了解常见进口、国产全自动化学发光仪检
测原理
化学发光免疫检测分类
辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（ALP）
01
酶促化学发光
02
吖啶酯发光 异鲁米诺发光
直接化学发光
电化学发
光
1. 酶促化学发光
酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光,常用的酶HRP和ALP
谢谢大家！
结束语
谢谢大家聆听！！！
22
1. 酶促化umo A2000
2. 直接化学发光
不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件就能发光的物质
1 反应迅速
2 背景低
3 信比高
吖啶酯化学发光
• 吖啶酯在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见， 特点 • 发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标