Cas9 protocol_v1.1_130216
CRISPRCas9植物基因敲除
CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒说明书Cat. No. GP0138Protocol No. PT140730-1出版日期July.2014南京市汉中门大街301号南京国际服务外包产业园01栋13层A座电话：+86-25-66776700/66776718传真：+86-25-66776701邮编：210036网址：CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒目录I．组份列表 (2)II．产品概要 (2)III．操作步骤 (3)1. 设计Oligo DNA 序列 (3)2. 线性化pP1C.2载体 (3)3. 重组pP1C.2载体的构建 (3)4. 重组pP1C.1载体的构建 (3)IV．附录pP1C系统质粒图谱..................................................................................4-5 V．参考文献. (6)图Figure 1. CRISPR-Cas9工作原理示意图Figure 2. pP1C.1质粒图谱Figure 3. pP1C.2质粒图谱表Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表Protocol No. PT140730-1 Genloci Biotechnologies Inc.1/6CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒I．组份列表CRISPR-Cas9基因敲除试剂盒组份如下：Table1. CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表组份列表含量pP1C.1 Vector2μgpP1C.2 Vector 2μg贮存条件※注意：在收到货后，请您将pP1C.1 Vector 和pP1C.2 Vector瞬时离心后再保存。
将pP1C.1 Vector、pP1C.2 Vector置于-20℃保存，且避免污染；II．产品概要CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒是一款高效、精准的基因编辑试剂盒，它是基于最新代的人工核酸内切酶CRISPR-Cas9而研发的，相对于传统敲除技术和TALENs\ZFNs技术而言，其操作更加简便，敲除效率最高，基因的编辑更加的精准，大大降低了脱靶机率。
crispr-cas9进行全基因组的筛选
crispr-cas9进行全基因组的筛选Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello) 一、lentiCas9-Blast质粒的基本信息：/pooled-library/broadgpp-human-knockout-b runello/由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。
换成另一种。
1基。
2向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟。
3将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
4把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。
必须在5分钟之内混合。
5混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA 与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
6DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃, 5% CO2 细胞培养箱中培养。
7培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
8每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养48小时。
9收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。
10于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。
11以0.45 μm滤器过滤上清液于15ml 离心管中。
二、慢病毒转染细胞参考网址：/protocols/generatin g-stable-cell-lines/1. 取六孔板铺50000个细胞， 37°C,5% CO 2 培养，待细胞长到70%，换含有8ug/ml polybrene的培养基培养。
cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
植物多靶点CRISPR-Cas9载体使用方法(2015-5-1)
CRISPR/Cas9-based genome editing technologyA robust CRISPR/Cas9 vector system for multiplex targeting ofgenomic sites in monocot and dicot plants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组(**************.cn )1. pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。
CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guide RNA (sgRNA)以及由sgRNA 引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs ），TALENs 更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。
我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。
本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA 表达盒的多克隆位点Bsa I 位于靠近双元载体RB 位置。
sgRNA 表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR 方法拼装好，再利用Golden Gate 或Gibson Assembly 克隆方法组装到双元载体上。
本载体系统已经发表（Ma et al., 2015, Molecular Plant , DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。
5’ NNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN Target SitePAM NNNNNNNNNNNN-3’3’ NNNNNNNNNNNN NCCNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5’-G/A NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGAGCUAG A A CGAUA GAAAACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU Cas9nuclease Cleavage site genomesequenceRuvC-like domain HNH domain CUUGAAAAAGUGGCACCGA G CGUGGCU UUUUU-3’NGGFigure 1. A working model of the CRISPR/Cas9 system. The Cas9-sgRNA complex locates to the target site to cleave the DNA to produce double strand break (DSB).2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱2.1CRISPR/Cas9双元载体本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300 (ACCESSION: AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征(Figure 2)。
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程
CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程Puro 抗性浓度摸索实验将细胞如下图1稀释。
给药7天后，弃培养液，用台盼蓝染色2 min，显微镜下观察细胞存活情况。
确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞筛选浓度。
图1 抗性浓度摸索单克隆形成验证实验细胞计数，将细胞悬液稀释混匀后加入96孔板，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养。
静置培养48 h后每日观察并记录单克隆形成情况。
sgRNA 靶标设计根据基因序列信息，设计 sgRNA。
靶标位点序列信息确认PCR扩增（图2），测序验证基因序列，以确定sgRNA区域有无SNP。
图2 靶标序列扩增sgRNA克隆引物合成根据sgRNA设计sgRNA克隆引物。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建退火，连接，转化，涂板（LB/Amp）培养。
lentiCRISPRv2-sgRNA载体验证每个实验组各挑取6个单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果（图3）。
图3 质粒抽提酶切验证：取3个单克隆进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果（图4）。
选择2个样品送样测序。
图4 单克隆酶切验证病毒包装lentiCRISPRv2-sgRNA无内毒素质粒提取，病毒包装。
细胞转染配制梯度病毒稀释液，细胞于培养箱中静置培养48h。
阳性单克隆细胞株筛选细胞转染48h后，更换完全培养基，筛选至对照组大部分细胞死亡，实验组细胞扩大培养，进行单克隆筛选。
几天后挑选阳性单克隆进行扩增，并取样验证。
阳性单克隆细胞株验证测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列，以确定是否敲除成功。
实验结果示例：该基因有两个单克隆细胞株，A1和A2。
单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式，分别缺失1个和19个碱基，在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。
单克隆细胞A2的目的基因在sgRNA2位置发生突变，插入1个碱基，在新序列的第340位碱基提前出现终止密码子。
CRISPR Cas9基因敲除载体构建试剂盒说明书V1.1
U6 promoter TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCC TATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGT AAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTA
产品说明书
Targeting sequence
gRNA sequence
gRNA-R primer
AAGGACGATACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
TTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
V2.0
北京英茂盛业生物科技有限公司 北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B‐916 Tel：010‐62495135 Emai：order@ Web site：
产品内容
Cas9 基因敲除试剂盒 货号 CR0001 内容 pCas9/gRNA1 载体 pTYNE 验证载体 pCas9‐P 阳性对照载体 pCas9‐N 阴性对照载体
AAGACCTTCAGAAGGTTGCTGAGTACAAGACTGGGC
靶点挑选要点：
1）：Cas9/gRNA 基因敲除原理是对基因组 DNA 序列切割后引发 DAN 修复，产生 DNA 序列缺失突变。因此 基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。
Cas9：一种高效的基因编辑工具
Cas9：一种高效的基因编辑工具Cas9的结构和功能•Cas9是一种核酸酶，能够识别并切割特定的DNA序列•Cas9需要与一条小导向RNA（sgRNA）结合，形成Cas9-sgRNA复合体•sgRNA包含一个与Cas9结合的骨架序列和一个与目标DNA互补的20个碱基的指导序列•Cas9-sgRNA复合体能够识别并结合目标DNA上的一个叫做原型相容性重复序列（PAM）的特殊序列•PAM通常是NGG或NAG，其中N代表任意碱基，G代表鸟嘌呤•Cas9在PAM的上游位置对DNA进行双链切割，形成DNA双链断裂（DSB）Cas9引发的DNA修复机制•DNA双链断裂是一种严重的细胞损伤，细胞会启动两种主要的修复机制来修复DSB：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）•NHEJ是一种高效但不精确的修复方式，它直接将断裂的两个末端连接起来，但在连接过程中可能会发生碱基插入或缺失，导致移码突变•HR是一种精确但低效的修复方式，它需要有一个与目标DNA同源的供体模板，通过拷贝模板上的序列来修复DSB，但在拷贝过程中可能会发生基因转换或交叉互换•Cas9引发的DSB通常会被NHEJ修复，从而实现基因敲除或敲降Cas9 nickase：一种提高特异性的变体•Cas9 nickase是一种经过突变后只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口（nicks）的Cas9变体•Cas9 nickase需要与两条sgRNA结合，分别靶向DNA互补的两条链，并在相距10~20个碱基的位置形成两个缺口•两个缺口之间的DNA片段会被切除，形成一个DSB•Cas9 nickase引发的DSB也会被NHEJ修复，从而实现基因敲除或敲降•Cas9 nickase相比于Cas9有更高的特异性和更低的脱靶率，因为它需要同时满足两条sgRNA和两个PAM的匹配条件Cas9在基因编辑中的应用•Cas9是一种强大而灵活的基因编辑工具，它可以实现多种基因操作，如基因敲除、敲降、插入、替换、激活、抑制等•Cas9可以用于研究基因功能、调控基因表达、纠正遗传病、改善农作物、开发新药等领域•Cas9还可以与其他分子工具结合，如转录因子、表观遗传修饰酶、荧光蛋白等，实现更多样化和精细化的基因编辑。
GenCrispr Cas9 Nuclease 产品说明书
GenCrispr Cas9 Nuclease Cat. No. Z03386 Version 01202016I Description (1)II Kit Contents .......................................................................... .... .... (1)III Key Features ............................... .... .... .... .... .... . (1)IV Storage..................................................................... . (2)V Diluent Compatibility (2)VI Activity test (2)VII References (2)I. DESCRIPTIONGenCrispr Cas9 Nuclease is the recombinant Streptococcus pyogenes Cas9 (wt) protein purified from E. coli that can be used for genome editing by inducing site-specific double stranded breaks in double stranded DNA. Cas9 protein forms a very stable ribonucleoprotein (RNP) complex with the guide RNA (gRNA) component of the CRISPR/Cas9 system. The RNP complex recognizes the target site by matching gRNA with the genomic DNA sequence and produces DNA breaks within 3 bases from the NGG PAM (Protospacer Adjacent Motif). With GenCrispr Cas9 nuclease, customers can screen for highly efficient gRNA in vitro using DNA cleavage assays. The high purity Cas9 protein can also be used for antibody production.Product Source: GenCrispr Cas9 Nuclease is produced by expression in an E. coli strain carrying a plasmid encoding the Cas9 gene from Streptococcus pyogenes without nuclear localization signal (NLS).II. KIT CONTENTSIII. KEY FEATURESHigh Protein Purity: GenCrispr Cas9 Nuclease is > 95% pure as determined by SDS-PAGE with Coomassie Blue detection.Non-specific DNase Activity: A 20 µl reaction in Cas9 reaction buffer containing 100 ng linearized pUC57 plasmid and 0.1 µg of GenCrispr Cas9, incubated for 16 h at 37°C. No DNA degradation is determined by agarose gel electrophoresis.Non-specific RNase Activity: A 10 µl reaction in Cas9 reaction buffer containing 1800 ng total RNA and 0.1 µg of GenCrispr Cas9 incubated for 2h at 37°C. No RNA degradation as determined by agarose gel electrophoresis.High Bioactivity: 20 nM GenCrispr Cas9 incubated for 1 hour at 37°C result in 90% digestion of the substrate DNA as determined by agarose gel electrophoresis.IV. STORAGEGenCrispr Cas9 is supplied with 1x storage buffer (10 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol pH 7.4 @ 25°C). The recommended storage temperature is -20°C.V. Diluent CompatibilityDiluent Buffer: 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 500 μg/ml BSA and 50% glycerol. (pH 7.4 @ 25°C).VI. Activity testCas9 site-specific digestion:Genscript used in vitro digestion of a linearized plasmid to determine the activity of the Cas9 nuclease. It is a sensitive assay for GenCrispr Cas9 quality control. The linearized plasmid containing the target site:(CATCATTGGAAAACGTTCTT)can be digested with gRNA:(CAUCAUUGGAAAACGUUCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGU UAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU)and GenCrispr Cas9. Two cleavage DNA fragments (812 bp and 1898 bp) are determined by agarose gel electrophoresis. A 20 µl reaction in 1xCas9 Nuclease Reaction Buffer containing 160 ng linearized plasmid, 40 nM gRNA and 20 nM GenCrispr Cas9 for 2 hours at 37°C results in 90% digestion of linearized plasmid as determined by agarose gel electrophoresis.VII References1. Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. (2012)Science 337 (6096) 816-821 (2012).2. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression.NatureProtocols. 8, (11), 2180-2196 (2013).3. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8, (11), 2281-2308(2013).Notes:1. This is a basic protocol. The reagent concentrations, conditions, and parameters may need to be optimized.2. 1000 nM is equal to 160 ng/µl.GenScript US860 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854Tel: 732-885-9188, 732-885-9688Fax: 732-210-0262, 732-885-5878Email: *********************Web: For Research Use Only.。
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A Brief Protocol for Gene Targeting by Cas9 in Zebrafish（2013-02-16 v1.1）一、Cas9靶位点的选择1.Cas9靶位点（靶点）包含20个碱基，其中5’端应为GG▲；紧邻靶点3’端的3个碱基构成PAM区，要求序列为NGG（N为任意碱基）（图1）。
可在正义链或反义链上选择靶位点。
可参考如下的Cas9靶位点预测网站：/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx▲注意：5’端选择GG并非Cas9靶点本身的要求，而是由于本实验所用的gRNA（guide RNA）体外转录载体采用了T7启动子。
T7启动子要求转录起始位点的前两位为GG，并且第三位最好为G或A；如果采用其他的启动子，可以随之更改。
图1. Cas9的作用原理（引自Mali et al., 2013）2．如果采用限制性内切酶酶切法检测靶点的突变效率，则需要在靶点序列内、PAM的5’端附近选择一个单一的限制性内切酶位点。
例：斑马鱼th基因的某个Cas9靶点（此例的靶点位于反义链上）：BxtYI5’-TCTTGTCACCAAATATGATCCGGATCTGGATCAGGATCACCCAgtaagtgctggattat-3’ 3’-AGAACAGTGGTTTATACTAGGC CTAGACCTAGTCCTAGTG GG Tcattcacgacctaata-5’PAM Target site3．对于coding gene，靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG之后，但是不要在最后一个exon上；最好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。
同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框（in-frame）的起始密码子。
靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。
原则上不要选择5’-UTR和3’-UTR。
二、Cas9靶位点的确认1. 确认靶点在基因组中的唯一性：靶位点序列在Ensembl 网站进行blast ，确认是斑马鱼基因组中的单一位点。
2．PCR 扩增靶点序列：从准备用于打靶的成鱼中PCR 扩增靶点及附近的序列。
在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100 bp ，并且PCR 扩增产物最好不要超过500 bp ，且为单一条带。
3．检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR 产物进行酶切验证。
要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。
4．测序确认靶点序列：将PCR 产物直接送去测序（不需要TA 克隆）。
如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA 序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM 区不是NGG ，或5’端不是GG ），则应重新选择靶点；如果测序结果显示靶点序列为杂合子，则最好重新选择实验材料。
5．遴选实验材料：采用上述的PCR 与测序策略筛选出足够量的靶点正确且为纯合的成鱼，后续针对该靶点的实验最好都用这一批成鱼进行。
三、构建gRNA 体外转录载体1. p-T7-gRNA 为gRNA 的克隆与体外转录载体，载体骨架来自pMD18-T simple （Amp 抗性），gRNA 序列的连入方向为RV-M->T7->M13-47。
主要区域的序列如下：T7 promoter +1 BbsI BbsI5’-...GAATTC TAATACGACTCACTATAG ca GTCTTCTAGAAGAC gttttagagctagaaata gcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttt ttAAAGCTT (3)2．用BbsI 酶切pT7-gRNA 、切胶回收，得到gRNA 克隆骨架pT7-gRNA_BbsI ，所得粘性末端如下所示（骨架上5’各留下一个4 bp 的overhang ，中间的小片段丢弃）：5’-...TAATACGACTCACT ATAG ca GTCTTCTAGAAGAC gt tttagagctag...-3’ 3’-...ATTATGCTGAGTGATATC GTCAGAAGATCTTCTGcaaaat ctcgatc (5)酶切体系： pT7-gRNA plasmid 1~2 μgBuffer G 2.0 μLBbsI (Fermentas) 0.5 μL ddH 2O To 20 μL 37℃，4 h;切胶回收， 20 μL ddH 2O 溶解。
3．根据靶位点订购两条oligo （均为25 nt ，s 序列与靶序列同向，As 反向）。
以th 为例：th target oligo s ：5’-ataG GGTGATCCTGATCCAGATC gt -3’th target oligo As ：5’-taaaac GATCTGGATCAGGATCACC -3’方框内为靶点序列。
红色碱基为形成粘性末端所必需的固定序列，不能更改；蓝色碱基则需要根据靶点序列更改（注意target oligo As 中蓝色的碱基为靶点的互补序列，只需要其中的19个碱基，最后一个G 不需要合成）。
4．用ddH 2O 分别将oligo 溶解为10 μM 的溶液，退火，得到粘性末端如下的小片段：th target_an ：5’-ataG GGTGATCCTGATCCAGATC gt -3’3’- CCACTAGGACTAGGTCTAG caaaat -5’退火程序： oligo s (10 μM) 5 μLoligo As (10 μM) 5 μL 95℃ 5min, -1℃/30sec/cycle,to 4℃5．将退火后的片段与回收的上述gRNA 克隆骨架pT7-gRNA_BbsI 连接、转化，挑取克隆，用RV-M 与target oligo As 作为引物进行菌液PCR 鉴定（58℃退火，延伸30 sec ，30 cycle ）。
目的条带约为130 bp 。
挑取阳性克隆送测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒。
RV-M 序列：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’连接体系： pT7-gRNA _BbsI0.5 μL target_an 2.0 μL2*solutionI (Takara)2.5 μL 16℃，2 h 以th 靶位点为例，正确的克隆序列如下（相应的载体称为pT7-th gRNA ）：5’-...GAATTC TAATACGACTCACT ATAG GGTGATCCTGATCCAGATC gt tttagagctagaa atagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctt tttttAAAGCTT (3)四、制备Cas9 mRNA 和gRNA1．制备Cas9 mRNA ：（1）制备Cas9 mRNA 的体外转录模板：通过XbaI 单酶切线性化pSP6-2sNLS-spCas9载体（Amp 抗性）（37℃，4 h 以上）；取少量电泳确认线性化完全后，直接回收线性化产物。
（2）体外转录Cas9 mRNA 。
mRNA 体外转录体系（SP6 mMESSAGE mMACHINE ® Kit ，Ambion ）： 2× NTP/CAP10 μL 10× Reaction Buffer2 μL Linearized template DNA 1 μg (<6 μL) 37℃，2h ； 加入1 μL TURBO DNase ，37℃、15 min 以去除DNA 模板；SP6 Enzyme Mix 2 μLDEPC H 2O To 20 μL 取0.3 μL ，电泳查看转录效果（1% agarose ，产物约2 Kbp ）； 回收mRNA 。
（3）添加polyA 序列、回收得到可用于显微注射的Cas9 mRNA （添加polyA 序列可增强mRNA 的稳定性和翻译效率）。
mRNA 加polyA 的反应体系：（这里选用的是NEB 的加A 体系；也可以使用Ambion 的加A 试剂盒） ATP (10 mM) 5 μL10× Reaction Buffer 5 μL 体外转录、回收的mRNAE. coli Poly(A) 聚合酶 1 μLDEPC H 2O To 50 μL 37℃，1h ；取0.3 μL ，电泳查看加A 效果；（1% agarose ，产物约2 Kbp ，比加A 前略大）； 回收mRNA 。
2． 制备gRNA ：（1）制备gRNA 的PCR 体外转录模板：用T7-cr fwd 和tracr rev 引物对，以构建好的gRNA体外转录载体（例如pT7-th gRNA 质粒）为模板，使用高保真酶PCR ，得到gRNA 体外转录模板（58℃退火，延伸30 sec ，40 cycle ，40 μL 体系）。
取1 μL PCR 产物电泳，确认为单一条带（125 bp ）后直接回收PCR 产物，用于后续的步骤。
T7-cr fwd 序列：5’-GAAATTAATACGACTCACTATA-3’tracr rev 序列：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’（2）体外转录gRNA 。
gRNA 体外转录体系：（这里选用的是Ambion 的MAXIscript ® T7 Kit ；也可以使用其它的体外转录体系，例如Promega 的产品，但是不要用体外转录mRNA 的体系。
） 2.5 mmol/L NTP 4 μL10× Reaction Buffer 2 μL Template DNA 1 μg (<6 μL) T7 Enzyme Mix 2 μL DEPC H 2O To 20 μL 37℃，1h ；加入1 μL TURBO DNase ，37℃、15 min 以去除DNA 模板； 取0.3 μL ，电泳查看转录效果（3% agarose ，产物100 bp 左右）；回收gRNA 。
（3）回收gRNA ：建议使用Ambion 的mirVana™ miRNA Isolation Kit 进行回收。
也可采用LiCl 沉淀法，但效率较低。
用mirVana™ miRNA Isolation Kit 回收小片段RNA ：1）用RNase-free water 将gRNA 转录体系稀释到300 μL ，加入330 μL 无水乙醇；2）将溶液加到回收柱中，10000 g 离心15 s （转速太高会损伤滤膜）；3）加入700 μL 的miRNA Wash Solution I ，离心5~10 s ；4）加入500 μL 的Wash Solution II ，离心5~10 s ；重复一次；5）弃去收集管中的液体，离心1 min，去除残余的液体；6）加入适量95℃预热的RNase-free water或Elution Solution，最大转速离心20~30 s，收集得到gRNA溶液。