碱性磷酸酶比活力测定

（二）、酶活力
在37C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的
碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分
钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单 位。
酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位 数。
酶活性测定前处理
1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品不稀释（用洗脱液稀释）
3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系 （Lambert--Beer定律）：
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D） 与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度 （I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这 就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定 律。
4. 待测溶液浓度的计算：
蛋白浓度按下式计算：
100g / mL牛血清白蛋白 ＝ C未知
OD280
OD280
数据处理
单位时间0.1mL酶液催化产物量计算： 克分子消光系数法
PNP 1 mol / L(1cm光程)＝C未知
OD40（5 8.8 103）
OD即Βιβλιοθήκη C未知＝OD/(8.8103)
计算：
酶活力(U/mL) = B t V1
（3）消光系数法：
1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1% 或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξ C = D/E1cm%, 或 C = D/ξ
常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分 别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数 可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。
（1）标准管法：
在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D） 值，然后计算：
C未知 =（D未知/D标准）×C标准
（2）标准曲线法：
分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列 浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。 在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D） 之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘 制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。
酶液（mL）
0.1 mol/L NaOH (mL) 酶液（mL） OD 405 nm
各管加入1.0 mL
各管加入0.2 mL
各0.50mL
混匀，37℃，5分钟
/
各0.1mL
37℃，精确反应10分钟
各管加入2.0 mL
0.1mL
蛋白浓度测定
1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值； 2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度； 3. 以洗脱液作空白。
蛋白浓度测定前处理
1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释） 3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释） 4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）
12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照
管号 5 mM pNPP(mL)
空白（01-04） 1-1 2-2 各0.2mL
3-3 4-4
Na2CO3-NaHCO3 (mL) 20 mmol/L MgCl2 (mL) H2O (mL)
A
蛋白浓度(mg/mL)= C A V2
式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的 pNP mol数，t为反应时间，C为测得的蛋白mg数， V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定酶活力 所用的酶量(mL数)
酶的比活力（U/mg）＝ 酶活力(U/mL)/ 蛋白浓度(mg/mL)
纯化倍数=各步比活力/第一步比活力 得率%=各步总活力 100/第一步总活力
碱性磷酸酶比活力的测定
一、目的要求
1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法
二、原理
（一）、比色分析法
1. 物质的颜色和波长： 可见光：波长（λ）400—760nm 紫外光：λ小于400nm 红外光：λ大于760nm
光的互补示意图
2. 溶液的颜色和光吸收的关系：
溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜 色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相 互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。