细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。
有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。
细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。
2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。
二.荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。
当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。
该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。
特点： 1）简单、快速。
2）板式检测，可进行高通量。
三.LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。
通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测。
T细胞检测技术
贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子，说说这种情绪是什么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之
2、分子生物学检测
（1）Realtime-PCR （2）分子杂交
三、T细胞介导的细胞毒实验
特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别靶细 胞表面特异性抗原，通过Fas途径及颗粒酶途径， 介导靶细胞溶解。
1、51Cr释放实验
铬酸钠（Na251CrO4）中的六价铬能被活 细胞摄取，并在细胞溶解后以三价铬的形 式被释放。
化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。
1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折
1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法
• 方法学评价 优点：灵敏、特异，是CTL活性测定的经典方法； 缺点：操作繁琐；放射性；靶细胞51Cr自发释放；
2、IC Assay（In vivo cytotoxicity Assay）
表达特定抗原的肿瘤细胞系经CFSE标记后， 皮下注射入小鼠，被小鼠体内抗原特异性CTL作用 24小时后，取出肿瘤细胞，检测其CFSE含量。
西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。
白细胞介素(IL-2)检测及临床意义
白细胞介素（IL-2）检测及临床意义
一、概述
白细胞介素-2 (IL-2)又称T细胞生长因子。
主要由T细胞产生。
是在淋巴细胞增殖分化过程中重要的细胞生长因子，生理作用有刺激T细胞生长、诱导细胞毒作用和对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用等
二、检测方法
IL-2主要检测方法为生物素亲合素系统的双抗体夹心ELISA 法。
三、临床意义
1、IL-2可提高人体对病毒、细菌、真菌和原虫等感染的免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK 细胞)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。
2、IL-2 还可以增加抗体和干扰素 (IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。
3、IL-2的表达异常与临床多种疾病有密切关系，尽管外周血、尿液中IL-2 水平，或激活淋巴细胞上清液中IL-2水平的异常没有疾病特异性，但是可作为相关疾病的辅助诊断、预后及疗效观察提供可靠数据。
4、IL-2升高：肿瘤、心血管病、肝病等疾病时均可使 IL-2 水平升高，在器官移植后早期排斥反应时也出现IL-2表达升高。
5、IL-2降低：在多种原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病时均可伴有 IL-2 水平降低，如 SLE、麻风和艾滋病等。
细胞毒性实验
细胞毒性实验
细胞毒性实验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对细胞的毒性程度。
在药物研发、化学品评估、环境监测等领域中，细胞毒性实验起着至关重要的作用。
本文将介绍细胞毒性实验的原理、方法和应用。
原理
细胞毒性实验通过将待测物质暴露于不同类型的细胞培养物中，通过观察细胞
生长、代谢活性、细胞形态等指标的变化来评估毒性。
细胞毒性主要分为急性毒性和慢性毒性两种类型，分别用于评估物质对细胞的直接杀伤作用和潜在的长期影响。
方法
1. 细胞培养
首先需要选择适当的细胞系进行实验，常用的细胞系包括HEK293、HeLa、RAW264.7等。
细胞需在灭菌条件下培养，并保持在适宜的培养基中。
2. 暴露实验
将不同浓度的待测物质加入到细胞培养物中，设立对照组和实验组。
根据实验
需要，可以选择不同时间点进行观察。
3. 细胞存活率检测
通过MTT法、CCK-8法等方法检测细胞的存活率，进而评估毒性程度。
此外，也可以观察细胞形态的变化，如细胞凋亡、坏死等。
4. 数据统计分析
将实验结果进行统计分析，绘制图表，评估不同浓度下待测物质的毒性效应。
应用
细胞毒性实验广泛应用于药物筛选、化学品评估、环境毒性检测等领域，为评
估物质对细胞的毒性提供重要依据。
通过细胞毒性实验，可以及时发现有毒物质，减少对人类健康和环境的危害。
综上所述，细胞毒性实验是一种重要的实验方法，具有广泛的应用前景。
加强
对细胞毒性实验的研究和应用，对于促进科学研究和保护人类健康具有积极意义。
细胞毒实验
SI
50 40 30 20 10
0 100:1
Excel 作 图
NK杀伤实验
50:1 E：T
25:1
检测方法
1.1.1 alamarBlue一步荧光测定法 alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体
酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织 厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组 间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤， 适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不 影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增 细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细 胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞 系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔 即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。
血液免疫学检验方法与应用
血液免疫学检验方法与应用血液免疫学检验方法与应用是医学领域中一项重要的检测技术，通过此项检验可以诊断各种免疫性疾病，了解患者的免疫功能状态，指导治疗和判断预后。
本文将介绍血液免疫学检验的常用方法以及在临床实践中的应用。
I. 血清学检验方法血清学检验方法是血液免疫学中常用的一种技术手段。
它通过检测人体血液中的血清成分来评估患者的免疫状态。
1. 免疫球蛋白测定免疫球蛋白是一类抗体蛋白，通过测定血清中的免疫球蛋白水平可以判断患者的免疫功能是否正常。
常用的测定方法包括比浊法、酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）等。
2. 微量血浆蛋白电泳通过电泳技术，可以对血浆中的蛋白质进行分离和定量，并进一步了解患者的免疫功能状态。
这项技术在多发性骨髓瘤等血液疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要意义。
3. 补体测定补体是免疫系统的重要组成部分，通过测定补体水平可以评估患者的免疫功能状态。
常用的补体测定方法有补体结合试验（CH50）、C3和C4测定等。
II. 免细胞免疫学方法免细胞免疫学方法是研究人体免疫系统功能的一种重要技术手段。
与血清学检验方法不同，免细胞免疫学方法通过检测人体免疫系统中的免疫细胞来评估患者的免疫状态。
1. 淋巴细胞亚群分析淋巴细胞是人体免疫系统中重要的细胞类型，淋巴细胞亚群分析可以通过染色荧光标记等技术手段对不同种类的淋巴细胞进行定量分析。
这项技术在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和自身免疫性疾病等的诊断和疗效监测中具有重要意义。
2. 细胞毒性测定细胞毒性测定是一种评估免疫细胞活性的方法，通过检测细胞对其他细胞的杀伤能力来评估患者的免疫状态。
常用的细胞毒性测定方法有细胞介导免疫细胞毒性试验（CTL）和自然杀伤细胞活性测定（NK细胞测定）等。
III. 分子免疫学方法随着分子生物学技术的发展，分子免疫学方法逐渐在血液免疫学检验中得到应用。
这些方法通过检测免疫系统中的分子水平，更全面、准确地评估患者的免疫功能状态。
专题06 实验
1.(2018·江苏卷,17)关于还原糖、蛋白质和DNA的鉴定实验,下列叙述正确的是( D )A.在甘蔗茎的组织样液中加入双缩脲试剂,温水浴后液体由蓝色变成砖红色B.在大豆种子匀浆液中加入斐林试剂,液体由蓝色变成紫色C.提取DNA时,在切碎的洋葱中加入适量洗涤剂和食盐,充分研磨,过滤并弃去滤液D.将DNA粗提物溶解在2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂,沸水浴后液体由无色变成蓝色解析:甘蔗茎的组织样液中含有大量的蔗糖,蔗糖属于非还原糖,与斐林试剂在50~65 ℃的水浴加热条件下不会产生砖红色沉淀。
大豆种子的匀浆液中含有大量的蛋白质,鉴定蛋白质时应使用双缩脲试剂,双缩脲试剂在常温下能与蛋白质发生反应,生成紫色的络合物。
提取DNA时,植物细胞需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
在切碎的洋葱中加入适量的洗涤剂和食盐,进行充分的研磨,过滤后收集滤液。
在沸水浴条件下,DNA与二苯胺试剂反应溶液由无色变成蓝色。
2.(2014·海南高考·T1)下列植物细胞中,适合观察细胞有丝分裂的是( )A.蚕豆叶肉细胞B.洋葱鳞片叶表皮细胞C.蚕豆根尖分生区细胞D.洋葱根尖伸长区细胞解析：选C。
本题主要考查的是植物细胞有丝分裂的相关知识。
A项中,植物的叶肉细胞是高度分化的细胞,不能进行有丝分裂,故A项错。
B项中,洋葱鳞片叶表皮细胞为高度分化的细胞,不能进行有丝分裂,故B项错。
C项中,根尖分生区细胞具有分裂能力,故C项正确。
D项中,伸长区细胞不分裂,开始分化,故D项错。
3.(2018·北京卷,4)以下高中生物学实验中,操作不正确的是( A )A.在制作果酒的实验中,将葡萄汁液装满整个发酵装置B.鉴定DNA时,将粗提产物与二苯胺混合后进行沸水浴C.用苏丹Ⅲ染液染色,观察花生子叶细胞中的脂肪滴(颗粒)D.用龙胆紫染液染色,观察洋葱根尖分生区细胞中的染色体解析:在制作果酒的实验中,将葡萄汁液装入发酵装置中时,要预留约1/3的空间,其目的是:①让酵母菌先进行有氧呼吸,快速繁殖,耗尽瓶内的氧气后再进行酒精发酵;②暂时储存发酵产生的CO2,防止发酵液溢出导致杂菌污染。
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法
细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方法（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。
近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。
目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。
1 单个细胞水平测定CTL活性目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。
活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。
目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。
1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。
LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。
但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。
(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。
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细胞毒性T淋巴细胞生物杀伤效应的检测方
法
作者：王政, 田菲菲, 刘丁, 吕凤林
【关键词】 T淋巴细胞生物杀伤细胞毒性
细胞介导的免疫效应在机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫、移植排斥效应和自身免疫性疾病发生机制中发挥重要作用, 主要效应细胞之一为细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphoclyte, CTL)。
近年来, 基于CTL特异性表位的多肽疫苗已经成为研究热点之一, CTL的活化及对靶细胞的杀伤效应成为衡量疫苗质量的重要因素之一。
目前已经报道许多新的评价CTL活性及其杀伤效应的方法, 现就此做一综述。
1 单个细胞水平测定CTL活性
目前一般常用的有产生细胞因子的细胞记数法和有限稀释分析法(LDA)。
活化的T淋巴细胞可分泌一些功能性的细胞因子, 如IL2、IFNγ、TNFα等, 由于分泌不同种类细胞因子可以区分不同免疫功能的记忆细胞或效应细胞, 这样可以在体外评价外周血单个核细胞（PBMC）中抗原特异性T细胞的数量和功能状态。
目前常用的检测细胞因子的方法如ELISA、ELISPOT、PCR/RT PCR及细胞内因子检测等。
1.1 有限稀释分析法(Limiting dilution analysis, LDA) 该方法是迄今应用较广泛的定量分析系统［1］。
LDA 法使我们能够详细了解免疫反应动力学和记忆CTL(Memory CTL, mCTL) 细胞亚群的细
胞周期［2］, 也是对pCTL和mCTL亚群细胞表面的激活标志物进行研究的良好方法。
但此方法也存在缺点, 主要是: (1)在LDA条件下, 深入刺激会使效应CTL(eCTL)细胞加快凋亡［3］, 使CTL活性测定值变动较大, 对eCTL细胞数量不能测定或测定值偏低。
(2)实验较繁琐, 因为在实验之前, 首先需要将淋巴细胞表面表达的CD分子, 如CD44或CD62L进行染色, 再用FACS法分类筛选, 然后在LDA条件下培养6 d; 这样就会造成T细胞数量损失, 特别是在活化状态进行筛选和分离时。
1.2 ELISA ELISA可直接检测肿瘤患者体液如血液中的细胞因子(如IL2、IFNγ或TNFα)水平, 也可用于测定激活的淋巴细胞(诸如LAK或CIK细胞) 培养液中各细胞因子水平, 这是评估免疫活性细胞激活程度和免疫状态的重要指标。
当然, ELISA法检测的是一群细胞产生的细胞因子总量, 无法给出单一细胞的信息和精确估算抗原特异性T细胞数量, 而且, 它不能检测淋巴细胞被抗原刺激后产生细胞因子的能力。
在肿瘤免疫检测中, 随着ELISPOT技术的发展, ELISA法的应用已逐渐减少。
1.3 固相酶联斑点法( Enzyme linked immuno spot, ELISPOT) 基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅灵敏度大为提高, 而且能得到分泌细胞因子的细胞频数。
CTL受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子, 就被预包被的抗体直接捕获, 通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数, 从而反映抗原特异性CTL的活性。
此法的优点在于: (1)激活的T细胞周围环境中
细胞因子高度浓集, 即使只分泌100个因子的细胞, 也能被检测出来, 敏感性很高; (2)使用的2种单克隆抗体一般识别同一种因子的2个不同表位, 特异性很高; (3)可对T细胞直接进行检测, 不需要体外扩增, 所需的T细胞量较少, 应用冻存的PBMC可以反复检测多种细胞因子;
(4)在检测细胞数量的同时也可反映其功能, 与临床结果相关性较好。
但是ELISPOT法也有一些缺点: 检测到的T细胞必须能分泌目标细胞因子, 如果T细胞无功能或分泌其他的细胞因子, 就有可能低估抗原特异性细胞的数量; 除了CTL, 一些辅助T淋巴细胞(CD3+和CD4+)、自然杀伤细胞等也可分泌相同的细胞因子, 故还需结合细胞表型的分析, 为解决这一问题, 目前已经有同时检测两种细胞因子的方法［4］。
Malyguine等［5］比较了分别对GrB(颗粒酶B) ELISPOT法、IFNγ ELISPOT法和51Cr释放法进行了比较, 实验结果显示三者的相关性较好, 并指出检测GrB ELISPOT法与51Cr释放法的反应性非常接近, 而比IFNγ ELISPOT法和四聚体法更快速更直接。
ELISPOT 法所需细胞少, 鉴定抗原表位效率很高。
另外基于IFNγ或TNFγ分泌性CD8+T细胞的ELISPOT法已用于检测几种MHCⅠ类分子限制性黑色素瘤抗原, 如MAGE、gp100、Mart1、酪氨酸酶等［6］。
缺点是大数量的斑点, 或者斑点的形状变异较大而导致人工分析变得很困难。
如果应用计算机辅助成像检测技术即可解决此问题, 还能够确定分析斑点的面积, 分析T淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。
1.4 染色细胞内的细胞因子体外培养、刺激、活化细胞, 用Brefeldin A封闭细胞因子分泌途径, 使细胞因子在细胞内累积。
然。