饲料霉菌毒素检测流程
饲料霉菌毒素检测流程
亚太中慧集团疾病控制中心
Asia Pacific Chinwhiz Group Co.Ltd Center for Disease ControL
饲料霉菌毒素检测流程
1、饲料样品的采集
1.1 样品采集的原则
尽可能地考虑到采取被检饲料的各个不同部分、不同位置，不同深度和广度，多点取样，按随机抽样原则使每个个体被抽到的机会相等，使最终抽取的样本能代表整批对象；并通过正确的分样方法制备工作样本。
在饲料分析中，采样点最低不少于5个，且应分布于饲料堆垛的各个部位，包括上下层，四角，中心，每个采样点的采样量不低于200g。
如饲料的量越大，其均匀度越差，采样点和采样量也应相应增加。
1.2 饲料的采样
根据其批量确定采样点，然后从各样点采取200g以上的原始样品。
再将原始样品混合均匀，用四分法缩分至1kg，用于实验室检测。
四分法：将采集的原始样品在清洁的平面上充分混匀后，堆成四方体，用适当器具沿对角线，分成四等份，弃去对角线两份，将剩下两份再混匀，重复上述操作，直至缩减到所需要重量为止。
2、饲料霉菌毒素的检测
检测方法：ELISA；
检测试剂盒：Romer
材料：研磨机、
3、样品的处理
将饲料样品，用研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。
称取20g研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。
饲料霉菌毒素高通量检测标准发布
2021年（第42卷）第3期端与乳头的游离端齐平，以免奶溅到手上，污染乳汁。
握力一般为15-20kg,尽量做到用力均匀、一致。
压榨速度应稍快，每分钟约80-120次,根据母牛的排乳特性灵活掌握，原则是母牛大量排乳时,必须加快速度。
一般在开始挤奶的1min,速度为80~90次/min,以后大量排乳，速度为120次/min,最后排乳较少，速度又降为80~90次/min。
每分钟的挤奶量应能达到1~2.0kg o对于乳头短小的母牛，可采取指挤法或滑榨法挤奶，即以拇、食指捏住乳头基部，向下滑动，将奶捋岀。
此法初学时很易操作，但对乳牛危害极大，能引起乳头皮肤破裂、乳头变长、乳头腔变曲等严重弊病。
此外,此法需用润滑剂来减轻手指与乳头皮肤的摩擦，乳汁是最方便的润滑剂,但这样就会增加牛奶污染的机会。
因此，除乳头特别短小者外，此法应禁止采用。
1.3当大部分奶已挤完后，应再次地按摩乳房采取半侧乳房按摩法，即先后按摩右侧和左侧的乳区。
动作是两手由上而下，由外向里按压一侧两乳区，用力稍重，如此反复6~7下，使乳房内乳汁流向乳池,然后重复榨取各个乳区。
到挤奶快结束时,进行第3次按摩乳房。
这次必须用力充分按摩，尤其对新产牛更要做得细致。
方法是用两手逐一分别按摩4个乳区，直到完全挤净，点滴不留为止。
挤毕可在乳头上涂以油脂，防止龟裂。
每次按摩时,要把挤奶桶放在一边，以免按摩时毛发、皮垢等物落入桶内污染牛奶。
2挤奶时应注意事项2.1挤奶时间长擦洗乳房后，要立即挤奶，并且每头牛要在6~10min内挤完，其中包括擦洗乳房和按摩乳房的时间。
挤奶时间太长，将降低产奶量。
因为奶的分泌与乳牛的神经系统和内分泌有密切关系，挤奶前乳房的擦洗和按L流摩，对乳房产生一种刺激，通过神经系统作用于乳房的收缩组织，同时也通过内分泌反射地引起肌上皮和平滑肌细胞的收缩，使奶由乳房排出。
这种反射和收缩作用时间是很短的，只能维持几分钟，所以从擦洗乳房到挤奶结束一定要连贯进行，要求在几分钟内挤完，中途不可停顿。
饲料霉菌毒素中毒的危害、检验及其解决方法
现为神经和 内分泌紊乱 、 免疫抑制 、 致癌致 畸、 肾损伤 、 肝 繁殖 卵管萎缩 ， 产蛋量下降 ， 产畸形蛋 ； 采食量减少 ， 生产性能下降，
其干燥。 食槽及水槽也要定期消毒清洗 。
厚 １２ ， ￣ 倍 其他病 变及症状不甚明显者 ， 为可疑反应 。 如皮肤不增厚， 且无局部病
变 者 ， 阴性 反应 。 为 禽 类 喂 饲 试验 。 ３ ６月龄 母 鸡 ， 选 － 每
天 喂 可疑 饲 料 ２ ５克 （ ６月龄 或 成 鸡 每 天
２ 霉 菌毒素产 生 的条 件
霉 菌或 真菌 在 适 当的 湿 度 、 温度 、 气 和 生 长 媒 介 的条 件 氧 下 ， 可产 生毒 素 。气候 多 变 、 旱 、 涝 、 虫 害 等 环 境 下 特 就 干 多 病 别 容 易使 霉 菌 侵 入 植物 ， 产生 大量 霉 菌 毒 素 。 境 湿 度 ＞ ０ ， 环 ７％ 谷 物水 分 ＞ ３ ， 在 ２ ℃左 右 ， 适 合 霉 菌 生 长 。 １％ 温度 ４ 最
Ｔ ２毒素与呕吐毒素同属雪腐镰刀菌霉烯。 一 一 ２毒素是 引
起 口腔 溃 疡 因素 之 一 。其 主要 作 用 是 抑 制 蛋 白酶 的 活性 ， 而 进 阻 止 蛋 白质 的合 成 与 转 化 ， 肝脏 、 对 肾脏 等 不 构 成 明显 的损 害 作 用 。呕 吐 毒 素最 主要 是 引起 鸡 采 食 量 下 降 ， 呕吐 毒 素 的 中毒 案 例 很 少 见 到 。 美 国 Ｆ Ａ 对 玉 米 赤 霉 烯 酮 没有 限量 标 准 ， Ｄ 其
止 ． 后 沿 试 管 壁 加 人 乙醚 ２ ３毫 升 ， 刻 在 两 种 液 体 接 触 部 然 － 片
饲料中霉菌毒素检测技术
霉菌毒素是霉菌产生的次级代谢产物
酵母
次
级 代
抗生素
真菌
霉菌
谢
产
物
霉菌毒
素
蕈菌
精品PPT
一、饲料(sìliào)中霉菌毒素的危害
2、霉菌毒素(dú sù)产生的原因
霉菌无处不在，它们可在农作物生长、收获、运输 和储存期间生长并产生毒素 农作物作为饲料原料在生产、销售、储存、运输 过程中如果受到霉菌污染也会发生霉变、遭受霉 菌毒素污染
2、竞争(jìngzhēng) ELISA 的原理
精品PPT
三、ELISA法的操作(cāozuò)要点及注意事项
2、检测(jiǎn cè)步骤及注意事项
（1）准备阶段 • 详细阅读说明书
• 确认试剂盒试剂组成、数量及其用途
• 试剂配制 • 试样的制备、提取及稀释
• 试剂盒试用前要充分回温
• 实验室室温最好控制在20-25℃ • 准备好实验器具（移液枪机及枪头） • 确认仪器设备运行正常
GB/T19540-2004
DB51/T 1080-2010
饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 免疫亲和柱净化－高效液相色谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
取样 GB/T14699.1 2005 饲料 采样
饲料霉变防控及霉菌毒素脱毒技术规范
DB41/T 2617—2024饲料霉变防控及霉菌毒素脱毒技术规范1范围本文件规定了饲料霉变防控及霉菌毒素脱毒的术语和定义、饲料霉变控制、霉变判定、霉菌毒素脱毒、效果评价及档案管理等的技术要求。
本文件适用于饲料霉变控制及脱毒。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6435饲料中水分的测定GB 13078饲料卫生标准GB/T 13092饲料中霉菌总数的测定GB/T 14699.1饲料采样GB/T 18823饲料检测结果判定的允许误差GB/T 20195动物饲料试样的制备GB/T 30956饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法GB/T 30957饲料中赭曲霉毒素A的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法NY/T 1970饲料中伏马毒素的测定NY/T 2071饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定—液相色谱-串联质谱中华人民共和国农业部公告第1773号.饲料原料目录.2013年中华人民共和国农业部公告第2045号.饲料添加剂品种目录.2013年3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1饲料霉变因湿度、温度等环境因素或收获、贮存、加工、运输等过程不当，致使饲料出现霉菌和霉菌毒素污染的情况。
判定标准按照GB 13078执行。
3.2饲料脱毒采用物理、化学或者生物学方法，去除或降解饲料中霉菌毒素，以消除或降低霉菌毒素对畜禽的危.害。
3.3饲料原料粮食作物或其副产物等能够用于饲料加工生产的原料。
3.4饲料防霉剂DB41/T 2617—2024能降低饲料中微生物的数量、控制微生物的代谢和生长、抑制霉菌毒素的产生，预防饲料贮存期营养成分的损失，防止饲料发霉变质并延长贮存时间的饲料添加剂。
防霉剂品种参照《饲料添加剂品种目录》。
(完整版)饲料中霉菌总数测定方法
霉菌总数检测操作规程1 原理根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。
2 试剂与仪器2.1 所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000μL枪头、5mL枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3 所用试剂和培养基高盐察氏培养基取高盐察氏培养基109g，加入蒸馏水1L，搅拌加热至完全溶解，分装三角瓶，115℃高压灭菌30 min，备用。
3、操作步骤3.1配制0.85%生理盐水称取氯化钠8.5g溶于1000mL蒸馏水中。
3.2 锥形瓶加入生理盐水90mL，试管中加入生理盐水9mL，121℃灭菌30min。
（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。
3.3 将1000μL枪头、培养皿、5mL枪头、称量勺、带6颗玻璃珠具塞试管，121℃灭菌30min。
（注意计算数量）3.4 枪头、培养皿置于烘箱103℃烘干。
（1-3步需提前一天完成）3.5 对称量房间进行紫外灭菌30分钟，关灯静置60 min。
以无菌操作取样品10g于含90mL 生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡30min，制成1:10的均匀稀释液。
3.6 吸取1:10稀释液10mL注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合3min。
3.7 用1000μL枪头吸取1:10稀释液1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水9mL的试管中，于振荡器上混合均匀，制成1:100的均匀稀释液。
3.8 另取一只1mL灭菌吸管，按照上述操作方法，作10倍递增稀释，如此每递增稀释一次，更换一支灭菌吸头。
3.9 选择3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取该稀释的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。
3.10 稀释液移入培养皿后，及时将凉至46℃±1℃的高盐察氏培养基（可放置46℃±1℃水浴锅内保温）注入培养皿约15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀。
饲料中霉菌毒素检测技术
紫外检测器 荧光检测器
荧光检测器 荧光检测器 串联质谱 需柱前化学衍生 荧光检测需柱前 化学衍生
甲醇-水
甲醇-水 甲醇-水
免疫亲和柱
免疫亲和柱 免疫亲和柱 SAX净化柱
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
2、免疫亲和柱净化原理
加入待净化样本 洗涤干扰物 洗脱目标物
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
检测方法
高效液相色谱法（荧光） 酶联免疫吸附法 薄层色谱法 液相色谱-串联质谱法 胶体金法 荧光光度法 免疫层析法 高效液相色谱法 高效液相色谱法（荧光） 薄层色谱法 酶联免疫吸附法 高效液相色谱法 液相色谱-串联质谱法 高效液相色谱法（紫外） 薄层色谱法
高效液相色谱法
黄曲霉毒素
NY/T 2071-2011 NY/T 2550-2014 NY/T 2549-2014 NY/T 2548-2014 DB37/T 2617-2014 GB/T 28716-2012
四、HPLC法在饲料霉菌检测中的应用
1、HPLC法检测霉菌毒素的关键点比较
霉菌毒素 名称
黄曲霉毒素 玉米赤霉烯酮
提取液
甲醇-水 乙腈-水 水
净化
免疫亲和柱 多功能净化柱 免疫亲和柱 免疫亲和柱
检测器
荧光检测器 串联质谱 荧光检测器 串联质谱
备注
荧光检测需柱前 光化学衍生
脱氧雪腐镰刀菌 烯醇（呕吐毒素） 赭曲霉毒素A
•
•
加洗液不要溢出微孔，防止交叉污染
拍板用力适当，看不到明显液体为宜
三、ELISA法的操作要点及注意事项
2、操作要点及注意事项(续)
（5）显色 • • • • 加显色液要快速准确 回形振荡混匀，消除气泡 严格按照说明书控制温度、时间及避光要求 防止微孔内液体挥发，加以密封
饲料霉菌毒素检测流程
饲料霉菌毒素检测流程
饲料霉菌毒素检测流程
1、饲料样品的采集
1.1 样品采集的原则
尽可能地考虑到采取被检饲料的各个不同部分、不同位置，不同深度和广度，多点取样，按随机抽样原则使每个个体被抽到的机会相等，使最终抽取的样本能代表整批对象；并通过正确的分样方法制备工作样本。
在饲料分析中，采样点最低不少于5个，且应分布于饲料堆垛的各个部位，包括上下层，四角，中心，每个采样点的采样量不低于200g。
如饲料的量越大，其均匀度越差，采样点和采样量也应相应增加。
1.2 饲料的采样
根据其批量确定采样点，然后从各样点采取200g以上的原始样品。
再将原始样品混合均匀，用四分法缩分至1kg，用于实验室检测。
四分法：将采集的原始样品在清洁的平面上充分混匀后，堆成四方体，用适当器具沿对角线，分成四等份，弃去对角线两份，将剩下两份再混匀，重复上述操作，直至缩减到所需要重量为止。
2、饲料霉菌毒素的检测
检测方法：ELISA；
检测试剂盒：Romer
材料：研磨机、
3、样品的处理
将饲料样品，用研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。
称取20g研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。
霉菌毒素检测方法
霉菌毒素检测方法1.呕吐毒素(DON)的检测ELISA法测试前请仔细阅读本说明在2—8℃冷藏—不要冻结1.简介 DON毒素脱氧瓜萎镰菌醇（DON，）是单端孢菌素烯烃中的一种，它通常是由生长在谷类物品（如小麦、玉米、大麦和秣草）霉菌镰红菌素生成的。
脱氧瓜萎镰菌醇的毒性效应包括：呕吐、不想进食、胃肠炎、腹泻、免疫抑制和血液病。
研究表明猪对脱氧瓜萎镰菌醇很敏感。
当脱氧瓜萎镰菌醇含量≥1ppm时，它们就拒绝进食。
其毒性也会对其他物种产生毒性效应，各种物种对脱氧瓜萎镰菌醇的敏感性各不相同。
研究表明脱氧瓜萎镰菌醇会使已加工食物发生问题，包括使可吃的谷类制品产生臭味、对生面团质量产生负面影响。
因此，精确测定可能含有脱氧瓜萎镰菌醇的食物和食品就现得十分重要。
FDA（美国食品和药品管理局）已经制定了脱氧瓜萎镰菌醇含量的强制标准。
美国食品药物管理局已经颁布的DON毒素建议限量如下：2.方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppm级的DON毒素。
样品和标准控制液中游离的DON毒素与轭合物中的DON毒素竞争抗体结合位置。
清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明DON毒素越少。
将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中DON毒素的准确浓度。
3.贮存要求本试剂盒存放在2～8℃时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。
4.试剂与仪器4.1已提供的材料48个包被了抗体的孔；48个红色标记的混合孔；5瓶2ml浓度为0、0.25、0.5、1、3 ppmDON毒素控制标准液(黄色标签)；1瓶DON毒素-HRP轭合物溶液(兰色标签)；1瓶24ml底物溶液(绿色标签)；1瓶32ml红色终止液（红色标签）4.2需要但未提供的材料提取材料；蒸馏水或去离子水；100ml量筒；150ml的具塞三角瓶；滤纸；样品收集具塞试管；漏斗；粉碎机；称量为5～25克的秤；带450nm滤光片的酶标仪；200μl移液器；200μl吸咀；纸巾或等效的吸水材料；计时器；防水记号笔；洗瓶；移液器用的试剂槽；蒸馏水或去离子水；计时器等5.注意事项本测试盒不使用时应在2～8℃下存放。
畜禽饲料中霉菌毒素的检测
2018年第7期霉菌毒素具有很多种类,并在自然界中广泛分布,常会污染饲料。
当霉菌污染饲料后就会导致其含有大量的霉菌毒素,从而能够导致畜禽发生中毒死亡,或者导致畜禽的免疫机能降低,长时间处于亚健康状态,生产性能下降,引起免疫失败,并经常发病,还可经由肉、蛋、奶等食物链危害人类健康,实际工作中应该注意采取相应的检测手段。
1主要霉菌毒素饲料、油籽、谷物以及加工的粮食容易污染霉菌,特别是在温度超过25℃,相对湿度达到80%以上时,通风较差以及阴雨季节,更容易污染。
在饲料原料或者饲料中常见的霉菌主要是曲霉菌、镰刀菌和青霉菌。
这些霉菌通常可产生黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、单端孢霉烯(T-2毒素)、呕吐霉素、腐马菌素、串珠镰刀菌素等。
这些霉菌及其产生的毒素常会导致饲料中的常用原料被污染,如曲霉菌分泌的黄曲霉毒素B1(A FB1)、黄曲霉毒素B2(A FB1)、黄曲霉毒素G1(A FG1)以及黄曲霉毒素G2(A FG2),是导致大部分数动物发生霉菌毒素中毒的主要原因;青霉菌属中的多个菌种分泌的赭曲霉毒素,对家禽具有十分强的毒力,且常与黄曲霉毒素一起污染饲料。
每种霉菌或者霉菌毒素基本不会单独存在,常是同时存在2种或者多于2种,多种毒素共同产生的毒性作用会明显大于任何单一毒素产生的毒性,普遍将这种作用称为霉菌毒素的相乘作用。
动物吸收霉菌毒素后会进入血液,并通过血液循环输送到全身各处,甚至是侵入胎盘。
2常用的检测方法在畜禽饲养过程中,如果出现减少采食,饲料结块谷物和饲料发热,颜色变暗,以及散发出较小异味等情况,就可怀疑饲料可能发生霉变。
饲料及其污染霉菌的菌丝体能够纵横交织,编织成菌丝蛛网状物,这种结构导致饲料形成结块。
在肉眼观察发现这些菌丝网状物之前,菌丝体就已经在饲料中大量生长繁殖,由此说明其中已经含有霉菌毒素。
因此,判断饲料发生霉变一种最简易实用的方法就是饲料存在结块。
不同霉菌菌落会形成的特有形态,并具有不同的生物学特征,通过光学显微镜观察能够进一步确认。
霉菌毒素的检测方法概述
菌量一般为 １ ０ 个／ ｇ 左右。有８ ４ ． ４ ％的样品中检出曲 霉属 ，有６ ６ ． １ ％的样 品中检出青霉属 ，有４ ０ ． ０ ％的
样 品 中检 出镰 刀菌 属 ，有 ３ ０ ． ６ ％的样 品 中检 出毛 霉
（ Ｆ Ａ Ｏ） 估计全世界粮食每年由霉菌造成 的直接经 济损失达数百亿美元 ，而且逐年递增 。 由霉变饲 料所致畜禽中毒而造成的经济损失更不计其数 。
当人 或 畜 、禽采 食 了霉 变 的粮 食 制 品 或饲 料 后 就 会 发生 多种 中毒 病 ，统称 为真 菌毒 素 中毒 。
真 菌毒 素检测方 法大致包括化学检验方法 、
免 疫学 检验 方法 和生 物学 检验方 法 。
１ 化 学 检 验 方 法
即利用化学方法检验真菌毒素 ，主要包括提 取 、脱脂 、净化 、分离 、鉴定和定量等程序。 １ 。 １ 取样和样品的制备 ：取样必须有代表性 ，应 尽量将样品磨细 ，以利提取。 １ ． ２ 提取 ：根据 水溶剂 能渗透 到亲水性植 物组 织 的原 理 ，用氯仿一 水 、二氯甲烷一 水等作为萃取
２ ０ １ ３ 年 第１ 期
综述
霉菌毒素的检测方法概述
张 德 安
（ 吐鲁番地 区畜牧工作站 ，新疆 吐鲁番 ８ ３ ８ ０ ０ ０ ）
摘要 ｉ通过对饲料 中霉菌毒素 的中毒危 害的现状分析 ，介 绍 了化 学检验 方法、免疫学检验方法和生物 学检验方法等３ 种
真茵毒素检测方法 。
关键词 ：真 菌毒素 ；中毒 ；检测 ；化学检验
中图分 类号 ｉ￥ ８ ５ ９ ． ８ ７
文献标识 码 ：Ｂ
变的饲料或饲草被动物食用后 ，常可 引起各种真
菌 毒 素 中 毒病 。据 张海 彬 （ １ ９ ９ ４）等对 江苏 省 各 地 区 的饲料 （ 草 ）样 品调查 研 究 ，在 １ ８ ０ 份 样 品 中