常见荧光定量PCR仪汇总讲解
四种常见PCR仪的区别及运用-科邦实验室-2020.6.24
四种常见PCR仪的区别及运用PCR扩增仪（俗称PCR仪）PCR：PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。
PCR扩增仪又称为PCR基因扩增仪、PCR核酸扩增仪、聚合酶链反应核酸扩增仪，是利用PCR(Polymerase chain reaction，聚合酶链反应)技术对特定DNA扩增的一种仪器设备，被广泛运用于医学、生物学实验室中，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定等。
根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
1). 普通PCR仪（2万以下，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪称作传统PCR仪，也叫普通PCR仪。
如果要做不同的退火温度需要多次运行。
主要是用于简单的、对目的基因退火温度的扩增。
该仪器主要应用于科学研究、教学、医学临床、检验检疫等机构。
如:启步BSW-2P,BSW-3P,BSW-6P-I/II ,ABI 2720型2). 梯度PCR仪（2万-8万，赛默飞、伯乐、大龙，艾本德）一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度，通常有12种温度梯度）的PCR仪称作梯度PCR仪。
因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度是不同的，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。
用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。
PCR仪的种类
PCR仪的种类1. 实时定量PCR仪实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称实时定量PCR）是一种用于快速、敏感且准确测定DNA、RNA拷贝数目的方法。
实时定量PCR仪是进行实时定量PCR实验的关键设备之一。
实时定量PCR仪的主要特点是能够对PCR反应过程中产生的荧光信号进行即时检测和分析，从而实现实时监测PCR反应的进程，并测定样品中目标序列的拷贝数。
实时定量PCR仪的应用非常广泛，包括基因表达检测、病原体检测、单核苷酸多态性分析等。
其高灵敏度、高特异性以及广泛的应用领域使其成为现代分子生物学和遗传学研究的重要工具。
2. 普通PCR仪普通PCR仪是进行普通聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）实验的基本设备。
普通PCR仪可以进行常规PCR实验，即通过PCR反应在体外扩增目标DNA片段。
普通PCR仪的特点是温控系统可以实现快速、精确的温度调节，从而使PCR反应在不同温度下的环境条件得以满足。
普通PCR仪的操作简单、成本较低，适用于常规PCR 实验的需求。
普通PCR仪的应用广泛，包括基因克隆、DNA测序、基因检测等。
它已成为分子生物学、医学和生物技术等领域中的一种基础设备。
3. 数字PCR仪数字PCR仪是一种相对较新的PCR仪器，它采用数字分析的方法对PCR产物进行定量，具有极高的准确性和可靠性。
数字PCR仪的工作原理是将PCR反应体系分成数百、甚至上千个微小反应体，从而形成多个独立的PCR反应。
每个微小反应体内含有目标序列与参考序列，通过数百或数千个微小反应的计数结果进行定量分析。
这种方法可以极大地降低PCR反应中的误差，提高PCR反应的准确性。
数字PCR仪的应用主要集中在绝对定量PCR、稀释样品的精确定量、病原体检测等领域。
其高准确性和可靠性使其在遗传学研究和临床诊断中得到广泛应用。
常见荧光定量PCR仪汇总讲解
而3320为双通道检测（FAM，HEX），支持三种荧光染料
杭州 博日FQD-48a
性能描述
FQD-48a具有单通道和4通道两种规格，通
过硬件转换可升级至4通道，支持0.2mlPCR 管，支持本公司体系：40ul 梯度温度范围：1℃~24℃ 升温速率：4.0℃/S 光路：LED激发+PMT检测
杭州 博日FQD-66A
孔数：96孔（10-100ul）检测1小时,384孔（5-20ul）检
测40min 材料：专用板，理论支持本公司PCR体系：40ul
集多个优点于一身，目前市面上最强悍的PCR仪
LightCycler Nano
优缺点：
检测通道：12个以上 加热模式：空气加热/冷却
升温：20℃/S
孔数： 32孔（4×8联管） 理论支持本公司PCR体系：40ul,价格为LC480的一半
进口定量PCR仪器厂商
市 场 占 有 率
ABI
ROChe （罗氏）
Bio-Rad （伯乐）
市 场 价 格
ROChe ABI Bio-Rad
ROChe
厂家介绍：
市 场 罗氏公司始创于1896年，总部位于瑞士巴塞尔，主要涉及药品、医疗诊 占 断、维生素和精细化工、香精香料等四个领域。LightCycler以运行速度 有 快而著称，在国内市场占有率单款最高 率
支持本公司体系：40ul
杭州 博日 linegene-3310/3320
性能描述
linegene-3310/3320具体的型号为FQD -33a 。最多检测33个样本， 支持0.2mlPCR管和8联管，支持本公司体系：40ul 升温速率：6℃/秒，通过Peltier技术控温 光路：LED激发+PMT检测 其中3310为单通道检测（FAM），支持两种荧光染料 （FAM/SYBR）
Gene_6000_荧光定量PCR仪介绍
Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介
例子：正常和肿瘤组织50ngRNA得到的cDNA用来分析p53（目标基因）和
GAPDH（参照基因）。 研究表明GAPDH在正常和肿瘤组织中没有差异。
样品 正常（校准样本） 肿瘤（试验样本） 值进行归一化：
△ Ct（正常）=15.0-16.5=-1.5 △ Ct（肿瘤）=12.0-15.9=-3.9
完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT 分析界面，选择show，此时，软件的向导界面会
提示使用者一步完成设置：
第一项：Validation Run Performed，提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该 定量方法进行分析。选择Yes； 第二项：Gene of Interest Quantitation，选中Page 1 或Page 2 中编辑了目的基因的那一
页；
第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1 或Page 2 中编辑了看家基因的那一页； 第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C 三个样品中用来作为对照组的一个。
Comparative Delta-delta Ct 定量流程简介
完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如图所示：
“优化采集”将只校正该反应中所用
到的通道（循环和熔解）； 通道设置：这是一个下拉式的菜单， 允许你向增益值校正窗口中添加新的 通道，选中需要的通道并点击添加 。
设置一个运行
总结反应的总体情况。
确定参数设置。
点击Start Run开始反应。
设置一个运行
此时会弹出文件保存<Save as>窗口
该文件包括一次运行的所有信息
仪器培训-荧光定量PCR
3’
SG SG
Emission
SG
5’
3’
SG
SG
Part II 荧光定量PCR原理
SYBR-Green I
Excitation
SG
5’ 3’
SG
Emission
3’ 5’
SG SG
SG
Part II 荧光定量PCR原理
双标记探针（Taqman Probe）
5’端标记荧光分子（如：FAM），在3’端标记一个吸收
仪器培训
——荧光定量PCR仪
二○○七年九月
Part I 中心仪器简介 Part II 荧光定量PCR原理
Part III 荧光定量PCR仪操作规程
Part I 中心仪器简介
普通PCR仪
荧光定量PCR仪 Rotor gene 3000
Gene AMP System 9700
Part I 中心仪器简介
信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
SYBR-Green I
5’
Excitation
SG
Emission
3’
SG
SG
3’
5’
SG
SG
SYBR-Green I
Excitation
Emission
SG
5’ 3’
SG
3’ 5’
SG
SG
SG
Part II 荧光定量PCR原理
SYBR-Green I
5’
点Perform last run, new
点36-well Rotor,并选中No Domed 0.2ml Tubes 前面的复选框，点 next 设定自己的反应体系，点next 点Edit profile,按自己预实验的每个基因的最佳条件设置hold 和 cycling, 设好后点OK. 点next, 点Start Run, 将当次实验保存至自己的文件夹中。
实时荧光定量PCR仪介绍
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
东胜创新
27
Opticon 实时荧光定量PCR仪之 结果分析-样品模板定量
确定初始模板的浓度
初始 DNA量越多, 荧光 达到某一值（域值）时 所需要的循环数越少 Log浓度与循环数呈线 性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数就可 计算出样品中所含的模 板量
东胜创新
39
Opticon 实时荧光定量PCR仪之 应用
研究方面的部分应用（1）： 药物及医疗相关 ： 新药开发研究 超早期感染用药物及疗法的研究与开发 药物疗效研究 新临床诊断及检验试剂的开发 个人基因型与药物疗效之间的关系
Opticon及Opticon 2 实时荧光定量PCR仪介绍
聂尚海 博士
东胜创新生物科技有限公司
Opticon系列实时荧光定量PCR仪之
图片
生产商：美国MJ Research 公司
东胜创新
2
Opticon系列实时荧光定量PCR仪之
组成介绍
热循环仪（PCR仪） 荧光检测系统 计算机及软件系统
东胜创新
致冷方式： 水致冷 空气致冷 压缩机致冷 半导体致冷
5
Opticon系列实时荧光定量PCR仪之
样品模块 电阻丝
循环仪温控系统
PTC200 加热:电热丝+ 半导体 制冷:半导体
东胜创新
Peltier 模块 散热槽
风扇
6
Opticon系列实时荧光定量PCR仪之
程序
温度及热盖模式
东胜创新
31
Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（1）
实验时间： 2002年8月16日 地点： 北京红十字血液 中心 试剂： PG公司 HIV及 HCV试剂盒 样本： 血液中心-20度 保存 东胜创新
荧光定量仪的结构原理及应用介绍
QPCR荧光实时定量仪1 StepOnePlus™ Real-Time PCR System 极易操作的扩增仪；高度精确、可靠的结果。
●96个反应孔以提供更高的反应通量●四色系统以提供更多的灵活性●VeriFlex™ 加热模块技术提供灵活的热循环模式StepOnePlus™ 系统包括：➢预校准的仪器➢ RNA酶P仪器验证反应板➢仪器操作和分析软件，以及Primer Express® 引物和探针设计软件➢包括入门指南在内的丰富的文件集，适用于各种主要的实时荧光定量PCR 应用领域系统特点➢在2小时内完成标准模式的PCR反应，40分钟内完成快速模式PCR反应➢直观灵活的软件和向导，指导新用户通过三个简单的步骤完成实时荧光PCR实验➢极紧凑的设计，适用于各种实验室环境➢LCD 触摸屏和USB 驱动使配置更加灵活，并可实现无PC 操作➢基于LED 的长寿命四色光学系统可记录FAM™/SYBR Green、VIC®/JOE™、NED™⁄TAMRA™ 和ROX™ 等染料发出的荧光➢采用了VeriFlex™ 加热模块技术，包含6 个可独立控制的温控区域，可同时扩增6 个不同退火温度的PCR 产物➢方便远程监控和电子邮件通知实验开始及结束功能，可以帮助节省时间此系统价格适中，适合各种操作经验水平、需要中等通量系统的实验室使用。
1.1仪器组成➢激发光源灯LED灯：具有长达10年的连续使用寿命。
➢滤光镜➢荧光检测器光敏二极管（PHT）：➢加热元件半导体加热：基于peltier技术的控温系统，特点是准确性好，但均一性不佳。
➢耗材8联管96孔板PCR单管毛细样品管1.2光学结构原理传统半导体顶部采光：1.3荧光检测标记探针的荧光分子的选择：StepOnePlus™系统可以检测FAM™、VIC®/JOE™、NED™⁄TAMRA™ 和ROX™染料标记的荧光探针。
荧光检测系统具有极高的灵敏度和特异性，可以很好的完成实时定量、基因表达、基因分型以及多重PCR反应等实验。
荧光定量PCR仪使用说明
7500荧光定量PCR 仪使用说明注意事项：实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。
PCR 反应所用的96孔板、8联管或单管必须为ABI7500专用，凸盖PCR 管禁止使用。
使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。
实验数据用光盘刻录，禁止U 盘拷取，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D 盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于FUWU 文件夹下的子文件夹中。
操作步骤开机放入反应板注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。
按压此处 ！ 待电脑启动稳定后，按压7500仪器电源按扭，等待仪器启动（约30 s ）。
当仪器只显示Power 状态指示灯时，方可按压托盘以打开它。
（以下过程按字母顺序a →q 进行操作）创建反应板文件双击电脑桌面上SDS 软件图标打开SDS 软件；a. 从 Assay 下拉列表中选择反应板类型c. 单击Next 反应板文件类型有以下几种：1. Relative Quantification (ddCt) Plate（相对定量） 2. AbsoluteQuantification(StandardCurve)（绝对定量，标准曲线）3. Allelic Discrimination （等位基因鉴别）4. Plus/Minus （阳性/ 阴性实验）d. 选择要添加到反应板文件的探针（引物），单击Add 添加选中探针e. 如果在列表中未列出所需探针，请单击New Detector 创建新探针f. 单击Nextb. 为反应板文件命名为反应孔设置样品名g.选取探针相同的反应孔h.点击反应孔对应的探针。
i.单击 Task栏的下边指定探针任务。
j.选择Use （使用）。
k.单击Finish （完成）。
ghijkl.选取反应孔，直接输入相应样品名（也可右键，调出反Well Inspector对话框，在Sample Name中进行修改）设定PCR循环参数、运行程序1.实验结束后关闭软件。