细菌生理生化实验

培养基配制方法：
蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(K2PO4):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0～7.2，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。
试剂：40%NaOH(或KOH)，a-萘酚。
试验方法：
将试验菌接种于上述培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.8～6.9，然后加入酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。
细菌生理生化试验—小木虫
微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示：
(一)糖、醇发酵试验
原理：
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。
结果记录：阳性：+，阴性：-。
(五)菌膜形成试验
有些菌在液体培养基中能形成菌膜，利用这一特征可进行不同细菌的区别。
培养基配制方法：蛋白胨：5g；氯化钠：5g；牛肉膏：10g；蒸馏水：1000mL；pH：7.2。121℃灭菌15～30min。
试验方法：接种后于30℃培养24小时，观察培养物是否有菌膜形成，有菌膜为阳性。
试剂：甲基红:0.1g，95%乙醇：300mL，蒸馏水：200mL。
试验方法：
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3～5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阳性、即可判定结果。
注意：以上亦可用液体培养基。
接种和观察结果：
用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。
结果记录：
产酸：+，产气：○，不产酸长气：-。
(二)淀粉水解试验
原理：
某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。
培养基配制：
一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：
蛋白胨：2g，K2HPO4 :0.2g，NaCl:5g，糖（醇、糖苷）：1%，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。
芽孢杆菌培养基配制：
(六)明胶（Gelatin）液化试验
原理：
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
培养基配制方法：蛋白胨：5g，明胶：120g，蒸馏水：1000mL。PH:7.2～7.4，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。
试验方法：
淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。
结果记录：分解：+，不分解：-。
(三) V-P试验
原理：
菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
(NH4)2HPO4:1g，MgSO4:0.2g，KCl:0.2g，酵母膏：0.2g，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。
将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm，115℃灭菌20min。
测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。
原理：
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
培养基配制方法：
蛋白胨：1 g；NaCl：5 g；KH2PO4：2 g；葡萄糖1 g；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水1000 ml。
培养基配制：
牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2
121℃灭菌20min。
试验方法：
以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。
结果记录：阳性：+，阴性：-。
(四)甲基红（Methyl Red）试验
原理：
有些细菌能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
培养基配制方法：
与V-P试验培养基一致。
挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。否则为阴性。
Байду номын сангаас(七)尿酶（Urease）试验