稻纵卷叶螟经Bt水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化

稻纵卷叶螟经B t 水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化吴志红１,２㊀杨亚军１㊀徐红星１㊀郑许松１㊀田俊策１㊀鲁艳辉１㊀吕仲贤１,∗(１浙江省植物有害生物防控重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地/浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所,杭州３１００２１;２杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州３１００３６;∗通讯联系人,E Ｇm a i l :l u z x m h ２００４＠a l i yu n ．c o m )C h a n g e s i nG r o w t ha n dD e v e l o p m e n t a n d M a i nE n z y m eA c t i v i t i e s i n M i d g u t o f C n a p h a l o c r o c i sm e d i n a l i s I n t e r m i t t e n t l y T r e a t e dW i t hL o w A m o u n t o f B tR i c e L e a v e s o v e rG e n e r a t i o n sW U Z h i Ｇh o n g １,２,Y A N G Y a Ｇj u n １,X U H o n g Ｇx i n g １,Z H E N G X u Ｇs o n g１,T I A N J u n Ｇc e １,L U Y a n Ｇh u i １,L V Z h o n gＧx i a n １,∗(１S t a t e K e y L a b o r a t o r y B r e e d i n g B a s e f o r Z h e j i a n g S u s t a i n a b l e P e s ta n d D i s e a s e C o n t r o l /I n s t i t u t eo f Pl a n t P r o t e c t i o n a n d M i c r o b i o l o g y ,Z h e j i a n g A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e s ,H a n g z h o u３１００２１,C h i n a ;２S c h o o l o f L i f e a n dE n v i r o n m e n tS c i e n c e ,H a n g z h o uN o r m a lU n i v e r s i t y ,H a n g z h o u３１００３６,C h i n a ;∗C o r r e s p o n d i n g au t h o r ,E Ｇm a i l :l u z x m h ＠g m a i l ．c o m )WUZ h i h o n g ,Y A N G Y a j u n ,X U H o n g x i n g ,e t a l ．C h a n g e s i n g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t a n dm a i ne n z ym e a c t i v i t i e s i n m i d g u t o f C n a ph a l o c r o c i sm e d i n a l i s i n t e r m i t t e n t l y t r e a t e dw i t h l o wa m o u n t o fB t r i c e l e a v e so v e r g e n e r a t i o n s ．C h i nJ R i c eS c i ,２０１５,２９(４):４１７Ｇ４２３．A b s t r a c t :T h e d e v e l o p m e n t a l i n d i c e sa n d m a i ne n z y m ea c t i v i t i e s i n m i d g u to f C n a ph a l o c r o c i sm e d i n a l i s t r e a t e dw i t h l o wa m o u n t o f B t r i c e l e a v e s o fT ２A Ｇ１(h a r b o r i n g c r y２A g e n e )f o r t h r e e g e n e r a t i o n s (５h f o r e v e r yg e n e r a t i o n )w e r e i n v e s t i g a t e d t ou n d e r s t a n dt h er e s p o n s eo f C ．m e d i n a l i s t oB tr i c e ．R e s u l t ss h o w e dt h a td e v e l o p m e n t a ld u r a t i o no f ３r d －５t h i n s t a r C ．m e d i n a l i s f e do nB t r i c e l e a v e s i n t h e １s t g e n e r a t i o nw e r e p r o l o n g e da n d t h e e m e r ge n c e r a t e s of C ．m e d i n a l i s s h a r p l y d e c r e a s e dc o m pa r e dw i t ht h eu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s ．H o w e v e r ,t h e s e t w o i n d i c e s r e t u r n e dt o t h e l e v e l o f t h e u n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s w i t h t h e i n c r e a s i n g ge n e r a t i o n s ．T h em o r t a l i t i e s of t h e ３r d －５t h i n s t a r C ．m e d i n a l i s l a r v a e a n d t h ew e igh t o f f e m a l e p u p a l o w e r e d ,a n dt h ew ei g h to fm a l e p u pad i dn o td i f f e r f r o mt h a to fu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s ．F u r t h e r m o r e ,t h em o r t a l i t y o f t h e ３r d －５t h i n s t a r C ．m e d i n a l i s l a r v a e a n dw e i g h t o fm a l e a n d f e m a l e p u pa d i dn o t r e t u r n t oo r r e m a i n t h e l e v e l s o f t h eu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s a s t h e t r e a t e d g e n e r a t i o n s i n c r e a s e d ．T h e s e i n d i c e s f o r t h e t r e a t e d３r d g e n e r a t i o n C ．m e d i n a l i s w e r e l o w e rt h a nt h o s eo fu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s ．T h et o t a l p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s i n C ．m e d i n a l i s l a r v a em i d g u t ju i c e f e d o nB t r i c e l e a v e sw e r e l o w e r t h a n t h o s e i nu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s ,b u t t h e t o t a l p r o t e i n a s e a c t i v i t i e s f o l l o w e da n i n c r e a s i n g t r e n dw i t ht h e i n c r e a s i n gge n e r a t i o n s ,a n dt h es i m i l a r t r e n dw a s o b s e r v e d i n t h ec h y m o t r y p s i n Ｇl i k ee n z y m ea c t i v i t y of C ．m e d i n a l i s ．W h i l et h ea c t i v i t i e so f t r y ps i ni nt h et r e a t e d C ．m e d i n a l i s w e r eh i gh e rt h a nt h a t i nu n t r e a t e d C ．m e d i n a l i s a n di n c r e a s e da st r e a t e d g e n e r a t i o n s i n c r e a s e d ,a n dt h e s i m i l a r t r e n dw a s o b s e r v e d i n t h e a m i n o p e p t i d a s e a c t i v i t y o f C ．m e d i n a l i s ．T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t C ．m e d i n a l i s h a s p o t e n t i a l a d a p t i v e a b i l i t y u n d e r e x p o s u r e t o l o wa m o u n t o fC r y２A p r o t e i n ．K e y w o r d s :C n a p h a l o c r o c i sm e d i n a l i s ;B t r i c e ;g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t ;a c t i v i t y o fm i d g u t e n z y m e s ;a d a p t a t i o n 吴志红,杨亚军,徐红星,等．稻纵卷叶螟经B t 水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化．中国水稻科学,２０１５,２９(４):４１７Ｇ４２３．摘㊀要:为明确稻纵卷叶螟对B t 水稻的适应能力,用转c r y２A 基因水稻T ２A Ｇ１低强度(每代饲喂５h )处理稻纵卷叶螟三代,观察其幼虫主要生长发育指标并测定其体内主要中肠酶的活性.与未经B t 水稻处理的稻纵卷叶螟相比,B t 水稻处理的第１代稻纵卷叶螟３~５龄历期显著延长,蛹羽化率显著降低,但随着处理代数的增加,这两个指标均恢复至对照水平;B t 水稻处理第１代的３~５龄幼虫存活率㊁雌蛹重均低于对照,雄蛹重与对照无显著差异,但这些指标并未随处理代数的增加而收稿日期:２０１４Ｇ０９Ｇ１１;修改稿收到日期:２０１５Ｇ０３Ｇ１２.基金项目:国家水稻产业技术体系(C A R S Ｇ０１Ｇ１７);浙江省植物有害生物防控重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地开放基金资助项目(２０１０D S ７００１２４ＧK F １３０７);转基因育种重大专项(２０１４Z X ０８００１Ｇ００１).７１４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i ),２０１５,２９(４):４１７－４２３h t t p ://w w w．r i c e s c i ．c n D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００１Ｇ７２１６．２０１５．０４．０１１恢复至对照水平或维持对照水平,且第３代均低于对照.处理后稻纵卷叶螟中肠总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性较对照有所降低,但随着处理代数的增加其总蛋白酶活性呈上升趋势.处理后的稻纵卷叶螟中肠内强碱性类胰蛋白酶和游离氨肽酶活性较对照有所增加,且随着处理代数的增加其活性继续增强.这些结果表明稻纵卷叶螟对低强度的C r y２A蛋白具有一定的应对能力.关键词:稻纵卷叶螟;B t水稻;生长发育;中肠酶活性;适应性中图分类号:Q７８５;S４３５ １１２＋ １㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１５)０４Ｇ０４１７Ｇ０７㊀㊀稻纵卷叶螟(C n a p h a l o c r o c i s m e d i n a l i s G u e née)属鳞翅目(L e p i d o p t e r a)螟蛾科(P y r a l iＧd a e),为水稻上最主要的害虫之一,是一种分布地域广㊁对环境适应性强的迁飞性害虫[１],其危害是影响水稻的光合作用,严重影响水稻生长发育,造成瘪谷率增加㊁千粒重降低[２,３].一般情况下,稻纵卷叶螟可造成水稻减产２０％~３０％,严重的可达５０％以上[４,５].农业的改制㊁品种变更及水肥条件的改善,以及连年多次使用农药,降低了自然天敌的控制作用,导致农田生态系统朝着有利于该虫发生的方向变化,致使其为害逐年加重[６],造成生态系统积累性污染的恶性循环,更为严重的是导致害虫产生抗药性.近年,苏云金芽孢杆菌(B a c i l l u st h u r i n g i e nＧs i s,B t)的杀虫基因被成功地转入水稻以防治水稻螟虫[７].转入水稻中的B t基因有多种,包括c r y１A a㊁c r y１A b㊁c r y１A c㊁c r y１B㊁c r y１C㊁c r y２A和c r y１A b/c r y１A c融合基因等[８,９].种植B t水稻可以减少杀虫剂的使用㊁减轻环境污染㊁促进粮食安全生产,对发展优质无公害稻米生产具有重要的经济㊁社会和生态效益,为无公害稻米生产提供了保障和支撑[１０Ｇ１３].B t作物中发挥杀虫作用的主要是C r y蛋白,C r y蛋白经昆虫取食后,在昆虫中肠酶液的作用下酶解成毒性多肽,然后与中肠上皮细胞上的特异受体结合,引起昆虫中肠上皮细胞的裂解[１４].关于C r y蛋白具体的作用机制主要有２种假说:孔洞模型[１５]和信号传导模型[１６].孔洞模型认为C r y蛋白主要通过形成四聚体在中肠膜上形成空洞导致昆虫死亡;而信号传导模型则认为C r y蛋白与受体的结合作用诱导了A C/P K A介导的信号传导从而启动了细胞程序性死亡最终导致害虫死亡.然而不管何种模型,C r y蛋白进入中肠后与中肠液的相互作用以及与中肠上功能受体的相互作用,在C r y蛋白的毒力形成过程中都起着非常重要的作用.中肠酶液与C r y蛋白的相互作用是造成C r y蛋白毒力差异的第一步,中肠酶液对C r y蛋白的消化速率以及消化后C r y蛋白的活力大小等都会引起毒力的变化.昆虫中肠液中主要成分为酶液,包括胰蛋白酶㊁胰凝乳蛋白酶等,中肠蛋白酶主要参与C r y蛋白的消化与降解[１７],在昆虫抗性发生的早期阶段较易发生变化.靶标害虫对C r y蛋白的敏感性下降或抗性上升是B t制剂或B t作物面临的一大威胁.目前从室内到田间已有多种害虫对B t制剂或B t作物产生抗性[１８,１９].稻纵卷叶螟对B t蛋白或B t水稻的潜在适应能力关系到B t蛋白或B t作物的使用效率和使用寿命.本研究通过在室内连续三代用B t水稻低强度(每代处理５h)饲喂稻纵卷叶螟幼虫,以探索其对B t水稻的适应潜力,为研究稻纵卷叶螟对B t水稻的适应性发展提供依据.１㊀材料与方法１．１㊀供试水稻品系B t水稻品系T２AＧ１(含c r y２A基因)和常规对照水稻品种明恢６３(MH６３)均由华中农业大学提供.两个水稻品种(系)定期种植于浙江省农业科学院试验田内,常规管理,以备试验所用,种植期间不使用任何农药.１．２㊀供试虫源稻纵卷叶螟幼虫于２０１３年采自杭州市郊常规水稻田.在人工气候培养室内(温度２６ħʃ１ħ,１４h光照/１０h黑暗,相对湿度７０％ʃ１０％)饲养至成虫后,饲以１０％蜂蜜水,采用郑许松等[２０] 烧杯＋湿纱布 方法收集卵.卵孵化后的初孵幼虫,采用离体的水稻叶片饲养至所需龄期,选择大小一致㊁３龄初幼虫供试.１．３㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理的稻纵卷叶螟的生长发育为了保证稻纵卷叶螟经B t水稻处理后有一定的存活率,以进行多代别的试验,经预实验确定间歇处理时间为５h,第１代处理存活率在４０％~５０％.将饥饿２h的稻纵卷叶螟３龄初幼虫转移到T２AＧ１８１４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第４期(２０１５年７月)水稻叶片(４５日龄完全展开的倒１叶)上取食５h 后,转移至非转B t水稻MH６３上继续饲养至化蛹.蛹羽化后,成虫交配产卵,其后代在MH６３上饲养至３龄初再作上述处理,共处理３代.试验在人工气候培养室内(温度２６ħʃ１ħ,１４h光照/８h黑暗,相对湿度７０％ʃ１０％)进行,至成虫对饲以１０％蜂蜜水.每代随机选择２００头观察记录其各龄期存活率㊁３~５龄历期㊁蛹重㊁羽化率.以未经T２AＧ１处理的稻纵卷叶螟作为对照.１．４㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理的稻纵卷叶螟的中肠酶活性取１．３中每代处理后５龄中期幼虫测定其中肠酶液活性.每５头幼虫中肠酶液为一个处理,每个处理３次重复.１．４．１㊀稻纵卷叶螟中肠液的提取取供试幼虫在冰上解剖,用预冷的０ １５m o l/L N a C l溶液冲去体液,截取中肠内含物,测试前用０ １５m o l/LN a C l溶液冰浴中匀浆,匀浆液在４ħ㊁１５０００r/m i n下离心１５m i n,取上清液作为测试用的中肠酶液.以牛血清蛋白(B S A)为标准蛋白,采用B r a d f o r d[２１]考马斯亮蓝GＧ２５０法测定中肠酶液中总蛋白含量.１．４．２㊀总蛋白酶活性的测定中肠总蛋白酶活性测定用氨苯磺胺偶氮酪蛋白为底物.偶氮酪蛋白以２０m g/m L浓度溶于０ １５m o l/LN a C l溶液,在１ ５m L离心管中分别加１０μL中肠酶液㊁１００μL偶氮酪蛋白溶液和４０μL０ １m o l/L甘氨酸Ｇ氢氧化钠缓冲液(p H１０ ５),３０ħ恒温箱温育３h,加入冰预冷的０ １g/m L三氯乙酸１５０μL中止反应.１２０００g下离心１５m i n,取２００μL上清溶液加入酶标板点样孔中,在酶标仪４１５n m处测定吸光值.１．４．３㊀强碱性类胰蛋白酶活力的测定强碱性类胰蛋白酶活力测定以B A P N A作为底物.B A P N A(２０m g/m L)溶于二甲基亚砜,在酶标板点样孔中依次加入１００μL底物㊁４０μL０ １m o l/ L甘氨酸Ｇ氢氧化钠缓冲液(p H１０ ５)和１０μL中肠酶液后立即置于酶标仪上,于４０５n m处开始读取吸光值,每１０s读取一个点,持续２０m i n.１．４．４㊀类胰凝乳蛋白酶活力的测定类胰凝乳蛋白酶活力测定以S A A P F p N A为反应底物.S A A P F p N A(２m g/m L)溶于０ １５m o l/L N a C l溶液,在酶标板点样孔中依次加入４０μL底物㊁９０μL０ １m o l/L甘氨酸Ｇ氢氧化钠缓冲液(p H １０ ５)和１０μL中肠酶液后立即置于酶标仪上,于４０５n m处测定吸光值,每３０s读取一个点,持续２５m i n.１．４．５㊀氨肽酶活力的测定氨肽酶活力测定以T M E M D为反应底物, T M E M D溶液用甲醇稀释,在酶标板点样孔中依次加入５０μL底物㊁７０μL０ １m o l/L T r i sＧH C l缓冲液缓冲液(p H１０ ０m o l/L)和１０μL中肠酶液后立即置于酶标仪上,于４１０n m处测定吸光值,每３０s 读取一个点,持续３０m i n.１．５㊀B t蛋白含量测定采用E n v i r o l o g i x公司试剂盒测定T２AＧ１稻叶中的C r y２A蛋白含量.１．６㊀数据分析采用软件S P S S１８ ０进行方差分析,并用T u k e y多重比较法测验各参数不同处理间的差异显著性.百分率先进行反正弦平方根转换后再作方差分析.２㊀结果与分析２．１㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理稻纵卷叶螟的生长发育稻纵卷叶螟３龄幼虫每代用转c r y２A基因水稻处理５h后,３龄存活率仅第３代低于对照;４龄存活率３代与对照均无显著差异;５龄存活率均低于对照,且３代间无显著差异;３~５龄存活率均显著低于对照,且第３代显著低于第２代(表１).稻纵卷叶螟３~５龄历期㊁蛹羽化率第１代与对照有显著差异,第２㊁３代与对照无显著差异(表１㊁表２).雌㊁雄蛹体质量３代间没有显著差异,但第３代雄蛹体质量显著低于对照,第１代和第３代雌蛹体质量显著低于对照(表２).２．２㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理对稻纵卷叶螟中肠液酶活性的影响稻纵卷叶螟用转c r y２A基因水稻处理后,总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶较对照有所降低,但随着处理代数的增加其总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性呈上升趋势(图１ＧA~B).经处理后稻纵卷叶螟强碱性类胰蛋白酶和氨肽酶活性较对照有所增加,且随着处理代数的增加其强碱性类胰蛋白酶和氨肽酶活９１４吴志红等:稻纵卷叶螟经B t水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化表１㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理稻纵卷叶螟不同代别３~５龄幼虫存活率和历期T a b l e１．S u r v i v a l r a t e a n d l a r v a l d u r a t i o n f o r t h e３r d－５t h i n s t a r o f C n a p h a l o c r o c i sm e d i n a l i s f r o md i f f e r e n t g e n e r a t i o n s i n t e r m i t t e n t l y t r e a t e d w i t h l o wa m o u n t o f B t r i c ew i t h c r y２A g e n e．世代G e n e r a t i o nC r y２A含量C r y２Ac o n t e n t/(μg g－１)３龄存活率S u r v i v a l r a t eo f３r d i n s t a rl a r v a e/％４龄存活率S u r v i v a l r a t eo f４t h i n s t a rl a r v a e/％５龄存活率S u r v i v a l r a t eo f５t h i n s t a rl a r v a e/％３~５龄存活率S u r v i v a l r a t e o f３r d－５t h i n s t a rl a r v a e/％３~５龄历期D u r a t i o no f３r d－５t h i n s t a rl a r v a e/dC K－９６．７４ʃ３．２６a９４．６１ʃ２．４８a９０．０３ʃ２．２３a８２．１６ʃ１．８５a１０．８ʃ０．５bF１７．３ʃ０．６a８０．２１ʃ１．８０a８６．３２ʃ２．７６a５８．１４ʃ５．５４b４０．１０ʃ２．７４b c１３．２ʃ１．４aF２８．５ʃ０．８a９４．４５ʃ２．３５a９０．６８ʃ３．３２a６０．９５ʃ４．２９b５２．８８ʃ６．２３b１１．０ʃ０．３bF３７．０ʃ０．７a６３．６４ʃ２．７４b８５．７１ʃ２．５８a６２．５０ʃ６．２３b３４．０９ʃ１．８１c１０．８ʃ０．６b㊀㊀同一列中具相同字母者表示不同处理之间在P＜０．０５水平上差异不显著.下同.F i g u r e s i n t h e s a m e c o l u m n f o l l o w e db y a s a m e l e t t e rw e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t P＜０．０５l e v e l b y t h eT u k e y s t e s t．T h e s a m e a s i n t a b l e s b e l o w．性呈上升趋势(图１ＧC~D).３㊀讨论㊀㊀B t作物已经在世界多个国家种植,种植面积从１９９６年的１１０万h m２增至２０１３年的７５００万h m２,另外还有许多B t作物处于田间试验阶段[２２].B t作物种植以来,田间至少有９种害虫对B t作物产生了抗性,分别是棉铃虫(H e l i c o v e r p aa r m i g e r a)㊁棉红数据为平均数ʃ标准误.不同小写字母表示在P＜０．０５水平上差异显著(T u k e y检验).F i g u r e sw e r e s h o w na sm e a nʃS E．D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a t P＜０．０５l e v e l b y t h eT u k e y s t e s t．图１㊀B t水稻低强度处理稻纵卷叶螟不同代别幼虫中肠酶活性F i g．１．A c t i v i t i e s o fm a i ne n z y m e s i nt h em i d g u to f C n a p h a l o c r o c i sm e d i n a l i s l a r v a ef r o m d i f f e r e n t g e n e r a t i o n s i n t e r m i t t e n t l y t r e a t e dw i t hl o wa m o u n t o f B t r i c e．０２４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第４期(２０１５年７月)表２㊀转c r y２A基因抗虫水稻低强度处理稻纵卷叶螟不同代别雌雄蛹质量和蛹羽化率T a b l e２．W e i g h t o f p u p a a n d e m e r g e n c e r a t e o f C n a p h a l o c r o c i sm e d i n a l i s i n t e r m i t t e n t l y t r e a t e dw i t h l o wa m o u n t o f B t r i c ew i t h c r y２A g e n e．世代G e n e r a t i o n雌蛹质量W e i g h t o f f e m a l e p u p a/m g雄蛹质量W e i g h t o fm a l e p u p a/m g蛹羽化率E m e r g e n c e r a t e/％C K１９．６ʃ０．４a２０．３ʃ０．３a９６．３０ʃ２．３０a F１１６．７ʃ０．５b１８．０ʃ０．６a b６１．０４ʃ７．３３b F２１８．４ʃ０．４a b１８．７ʃ０．４a b８１．２１ʃ５．８９a F３１６．３ʃ０．９b１６．４ʃ０．９b８６．６７ʃ２．４８a铃虫(P e c t i n o p h o r a g o s s y p i e l l a)㊁美洲棉铃虫(H．z e a)㊁澳洲棉铃虫(H．p u n c t i g e r a)亚洲玉米螟(O sＧt r i n i a f u r n a c a l i s)㊁小蔗螟(D i a t r a e as a c c h a r a l i s)㊁蛀褐夜蛾(B u s s e o l a f u s c a)㊁草地贪夜蛾(S p o d o p tＧe r a f r u g i p e r d a)㊁玉米根萤叶甲(D i a b r o t i c av i r g i fＧe r av i r g i f e r a)[２３].室内筛选研究也表明有多种害虫可以对B t蛋白产生抗性[１９].本研究通过B t水稻的叶片对稻纵卷叶螟３龄幼虫间歇处理３代,探索稻纵卷叶螟对B t水稻的潜在适应能力.由于目前田间稻纵卷叶螟对B t水稻的敏感性较高,且需保证处理幼虫可以化蛹㊁羽化,经预试验为保证第１代处理幼虫存活率在４０％~５０％,设置了３龄幼虫处理５h的处理强度.与对照相比,第１代处理后稻纵卷叶螟的幼虫历期缩短㊁蛹羽化率降低;随着处理代别的增加,稻纵卷叶螟幼虫历期与对照组无显著差异,且蛹羽化率也恢复到对照组的水平.但３~５龄幼虫存活率㊁蛹质量等指标并未随着处理代别的增加而升高,均以第３代最低.这些结果表明稻纵卷叶螟在第１代接触B t蛋白后,其生态适应性显著降低,随着处理代数的增加,部分指标显示对B t水稻T２AＧ１的适应能力似呈增强趋势,但是否导致短期内产生抗性尚不清楚.在甜菜夜蛾上观察到,取食含低浓度C r y１A c的饲料(５μg/g,１０μg/g)的甜菜夜蛾(S p o d o p t e r ae x i g u a)对C r y１A c杀虫蛋白适应得很快,到第４代这两个种群的幼虫期已经开始短于对照[２４].昆虫中肠液中主要成分为酶液,参与食物的消化与利用,中肠酶液可以将蛋白质肽链上的肽键酶解成多肽.鳞翅目害虫中肠液皆含有胰蛋白酶㊁胰凝乳蛋白酶㊁弹性蛋白酶㊁羧肽酶A㊁羧肽酶B和亮氨酸氨基肽酶等[２２].不同类型的蛋白酶对C r y蛋白的消化剪切可以改变C r y蛋白的结构,导致蛋白的活化与失活.中肠酶液中不同组分的变化也可以导致害虫抗性的产生.小菜蛾中肠液中硫代葡萄糖苷硫酸酯酶含量增加与C r y１A c的抗性有关[２５].中肠液金属蛋白酶活性的降低以及胰蛋白酶㊁羧肽酶和亮氨酸氨肽酶活性增加与埃及伊蚊(A e d e sa eＧg y p t i)对C r y蛋白抗性有关[２６,２７].中肠酶液的组成以及其对与受体结合后的C r y蛋白的剪切均可以影响C r y蛋白在中肠膜上的孔洞形成能力进而影响毒力[２８,２９].本研究测定了不同处理代别稻纵卷叶螟中肠主要酶活性的变化,其中,总蛋白酶含量较未处理的稻纵卷叶螟低,这表明C r y蛋白处理诱导稻纵卷叶螟体内总蛋白酶活性的降低,但随着处理代数的增加,稻纵卷叶螟体内总蛋白酶活性逐渐增强.中肠蛋白酶中类胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶主要与蛋白质的分解有关.从本研究结果看,随着处理代数的增加,稻纵卷叶螟中肠类胰凝乳蛋白酶活性的变化较第１代弱,而强碱性类胰蛋白酶则显著增强.随着棉铃虫取食含C r y２A b饲料时间的增加,中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加[３０].史艳霞等[３１]发现３龄抗性棉铃虫中起溶解B t蛋白作用的类胰蛋白酶活力和类胰凝乳蛋白酶较敏感种群增强.而亚洲玉米螟抗感种群中肠弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力差异不显著,但其抗性种群强碱性类胰蛋白酶的活性显著高于敏感种群[３２].可见,在不同昆虫中或者在与B t蛋白的相互作用过程中类胰凝乳蛋白酶与强碱性类胰蛋白酶的作用有所差异.蛋白酶活性的降低不利于B t蛋白的活化,而蛋白酶活性增强则有助于快速降解B t 蛋白以保护虫体[３３].袁灿等[３４]认为棉铃虫取食C r y１A c后期体内类胰蛋白酶活性下降是其应对C r y１A c的早期反应,以影响B t蛋白在中肠中的酶解活化过程来保护昆虫.K a r u m b a i a h等[３５]也发现抗C r y１A c的烟芽夜蛾(H e l i o t h i s v i r e s c e n s)类胰蛋白酶活性缺失和抗C r y２A a的烟芽夜蛾类胰凝乳蛋白酶活性缺失.本研究的结果也表明在C r y２A的１２４吴志红等:稻纵卷叶螟经B t水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化作用机制中或者稻纵卷叶螟应对C r y２A过程中类胰凝乳蛋白酶与强碱性类胰蛋白酶的作用有所差异.但也有中肠酶液对C r y蛋白无降解作用的报道[３６,３７].经T２AＧ１低强度处理的稻纵卷叶螟中肠游离氨肽酶活性比未处理的高,且随着处理代数的增加,游离氨肽酶活性进一步增强.中肠上皮细胞刷状缘膜(B B MV)上氨肽酶是B t蛋白的受体之一, V a l a i t i s[３８]发现B t蛋白可以诱导舞毒蛾(L y m a n tＧr i ad i s p a r)中肠液中游离氨肽酶活性增加,与B B MV上B t蛋白受体竞争结合位点,起到抑制剂的作用以阻止B t蛋白与B B MV上的受体作用.本研究结果表明稻纵卷叶螟通过增加体内游离氨肽酶的活性以应对C r y２A蛋白,可能降低C r y蛋白与中肠B B MV上氨肽酶等B t蛋白受体的结合几率.C r y蛋白在昆虫体内经过蛋白酶的消化过程主要有两种作用,一是活化,即消化特定氨基酸以让C r y蛋白具有更强的杀虫活性;另一是降解,即将C r y蛋白分解成不具活性的多肽,甚至是氨基酸.昆虫通过调节自身的体内酶的活性来应对C r y蛋白的作用过程.本研究通过B t水稻间歇处理稻纵卷叶螟三代来探索其对T２AＧ１的潜在适应能力,从本研究中对稻纵卷叶螟的低强度处理来看,稻纵卷叶螟对C r y蛋白表现出了一定的适应能力,这对于进一步研究稻纵卷叶螟对B t蛋白的适应性发展有重要启示意义.然而,B t水稻在整个生育期高强度表达B t蛋白,目前稻纵卷叶螟对B t水稻产生抗性的可能性较小.害虫对B t蛋白的抗性产生是多方面因素形成的结果,为了明确稻纵卷叶螟对B t蛋白的适应状况和抗性发展状况,仍需进行长期系统的监测和深入的研究.参考文献:[１]张孝羲,陆自强,耿济国．稻纵卷叶螟迁飞途径的研究．昆虫学报,１９８０,２３(２):１３０Ｇ１４０．[２]蔡国梁．稻纵卷叶螟连年大发生的原因及防治对策．中国稻米,２００６,１２(２):４９Ｇ５０．[３]林秀秀,金道超,陈祥盛．稻纵卷叶螟室内饲养观察．江苏农业科学,２０１２,４０(３):１０７Ｇ１２９．[４]凌路,廖晓兰．稻纵卷叶螟控制方法研究进展．生物灾害科学,２０１３,３６(２):１８５Ｇ１８７．[５]张帅,邵振润,沈晋良,等．加强水稻主要病虫科学用药防控的原则和措施．农药,２０１１,５０(１１):８５５Ｇ８５７．[６]王艳青．近年来中国水稻病虫害发生及趋势分析．中国农学通报,２００６,２２(２):３４３Ｇ３４７．[７]陈浩,林拥军,张启发．转基因水稻研究的回顾与展望．科学通报,２００９,５４(１８):２６９９Ｇ２７１７．[８]C h e nM,S h e l t o nA,Y eGY．I n s e c tＧr e s i s t a n t g e n e t i c a l l y m o d iＧf i e dr i c e i nC h i n a:F r o m r e s e a r c ht oc o mm e r c i a l i z a t i o n．A n nR e vE n t o m o l,２０１１,５６:８１Ｇ１０１．[９]C o h e n M B,C h e n M,B e n t u r J S,e t a l．B t R i c e i nA s i a:P oＧt e n t i a l B e n e f i t s,I m p a c t,a n dS u s t a i n a b i l i t y//R o m e i s J,S h e lＧt o nA M,K e n n e d y GG(e d s．),I n t e g r a t i o no f I n s e c tＧR e s i s t a n tG e n e t i c a l l y M o d i f i e d C r o p s w i t h i nI P M P r o g r a m s．S p r i n g e rS c i e n c e＋B u s i n e s sM e d i aB．V．N e w Y o r k．２００８:２２３Ｇ２４８．[１０]H u a n g JK,H uRF,R o z e l l e S,e t a l．I n s e c t r e s i s t a n tGMr i c ei n f a r m e r s f i e l d s:A s s e s s i n gp r o d u c t i v i t y a n dh e a l t h e f f e c t s i nC h i n a．S c i e n c e,２００５,３０８(２９):６８８Ｇ６９０．[１１]Z h a n g Q F．S t r a t e g i e sf o r d e v e l o p i n g G r e e n S u p e r R i c e．P N A S,２００７,１０４(４２):１６４０２Ｇ１６４０９．[１２]L u C M．T h ef i r s ta p p r o v e dt r a n s g e n i cr i c ei n C h i n a．G MC r o p,２０１０,１(３):１１３Ｇ１１５．[１３]T a nT,Z h a o JT,C h e nC．T h e i m p a c t o f c o mm e r c i a l i z a t i o n o f GMr i c e i nC h i n a．A m E u r J A g r iE n v i r o nS c i,２０１１,１０(３):２９６Ｇ２９９．[１４]P a r d oＧLóp e zL,S o b e rón M,B r a v o A．B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i si n s e c t i c i d a l t h r e eＧd o m a i n C r y t o x i n s:M o d eo fa c t i o n,i n s e c tr e s i s t a n c e a n d c o n s e q u e n c e s f o r c r o p p r o t e c t i o n．F E M SM i c r oＧb i o lR e v,２０１３,３７(１):３Ｇ２２．[１５]B r a v o A,Góm e zI,P o r t a H,e ta l．E v o l u t i o n o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s C r y t o x i n si n s e c t i c i d a la c t i v i t y．M i c r o b i a lB i oＧt e c h,２０１２,６(１):１７Ｇ２６．[１６]Z h a n g XB,G r i k oNB,C o r o n a SK,e t a l．E n h a n c e d e x o c y t oＧs i s o f t h er e c e p t o rB TＧR(１)i n d u c e db y t h eC r y１A bt o x i no fB a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s d i r e c t l y c o r r e l a t e st ot h ee x e c u t i o no fc e l lde a t h．C o m p B i o c h e m P h y s i o l,２００８,１４９(４):５８１Ｇ５８８．[１７]邵宗泽,喻子牛．昆虫中肠液性质对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒力的影响．昆虫学报,２００２,４５(３):３８４Ｇ３９０．[１８]T a b a s h n i k B E,V a n R e n s b u r g JBJ,C a r r ièr e Y．F i e l dＧeＧv o l v e d i n s e c tr e s i s t a n c et oB tc r o p s:D e f i n i t i o n,t h e o r y,a n dd a t a．JE c o nE n t o m o l,２００９,１０２(６):２０１１Ｇ２０２５．[１９]F e r réJ,V a nR i e J．B i o c h e m i s t r y a n d g e n e t i c s o f i n s e c t r e s i s tＧa n c e t o B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s．A n n uR e vE n t o m o l,２００２,４７:５０１Ｇ５３３．[２０]郑许松,陆婷,徐红星,等．一种采集稻纵卷叶螟卵的高效简便新方法．昆虫知识,２０１０,４７(６):１２５３Ｇ１２５６．[２１]B r a d f o r d M M．Ar a p i d a n d s e n s i t i v em e t h o d f o r t h e q u a n t i t aＧt i o no fm i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i nＧd y e b i n d i n g．A n a lB i o c h e m,１９７６,７２(１):２４８Ｇ２５４．[２２]J a m e sC．G l o b a l S t a t u so fC o mm e r c i a l i z e dB i o t e c h/GM C r o p s:I S A A AB r i e fN o．４６．I n t e r n a t i o n a l S e r v i c e f o r t h eA c q u i s i t i o no fA g r iＧb i o t e c hA p p l i c a t i o n s(I S A A A),I t h a c a,N Y．２０１３．[２３]W uY D．D e t e c t i o na n d M e c h a n i s m so fR e s i s t a n c eE v o l v e d i nI n s e c t s t oC r y T o x i n sf r o m B a c i l l u st h u r i n g i e n s i s//D h a d i a l l aT S,G i l lS(E d s),I n s e c t M i d g u ta n dI n s e c t i c i d a l p r o t e i n,C h a p t e r６．A d v a n c e si nI n s e c tP h y s i o l o g y．A c a d e m i cP r e s s,U K,２０１４,４７:２９７Ｇ３４２．２２４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２９卷第４期(２０１５年７月)[２４]蒋晴．不同浓度的C r y１A c杀虫蛋白对连续多代甜菜夜蛾生长发育㊁繁殖及体内酶活性的影响．扬州:扬州大学．２０１２．[２５]Y a m a z a k i T,I s h i k a w aT,P a n d i a nG N,e t a l．M i d g u t j u i c e o f P l u t e l l ax y l o s t e l l a h i g h l y r e s i s t a n t t o B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i sC r y１A c c o n t a i n s a t h r e e t i m e s l a r g e ra m o u n to f g l u c o s i n o l a t es u l f a t a s ew h i c hb i n d s t oC r y１A c c o m p a r e d t o t h a t o f s u s c e p t iＧb l e s t r a i n．P e s t iB i oc h e m P h y s i o l,２０１１,１０１(２):１２５Ｇ１３１．[２６]T e t r e a u G,B a y y a r ed d y K,J o ne sC M,e ta l．L a r v a lm i d g u t m o d if i c a t i o n s a s s o c i a t e dw i t hB t i r e s i s t a n c e i n t h e y e l l o wf e v e r m o s q u i t o u s i ng p r o t e o m i c a n d t r a n s c r i p t o m i c a p p r o a ch e s．B M CG e n o m,２０１２,１３:２４８Ｇ２６２．[２７]T e t r e a uG,S t a l i n s k i R,D a v i d J P,e t a l．I n c r e a s e i n l a r v a l g u t p r o t e o l y t i ca c t i v i t i e sa n d B t ir e s i s t a n c ei nt h e D e n g u ef e v e r m o s q u i t o．A r c hI n s e c tB i o c h e m P h y s i o l,２０１３,８２(２):７１Ｇ８３．[２８]L i g h t w o o dDJ,E l l a rDJ,J a r r e t t P．R o l e o f p r o t e o l y s i s i nd eＧt e r m i n i n gp o t e n c y o f B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s C r y１A cd e l t aＧe nＧd o t o x i n．A p p lE n v i r o nM i c r o b i o l,２０００,６６(１２):５１７４Ｇ５１８１．[２９]B r u ne t JF,V a c h o nV,M a r s o l a i sM,e t a l．M i d g u t j u i c e c o mＧp o n e n t s af f e c t p o r e f o r m a t i o nb y t h e B a c i l l u s t h u r i ng i e n s i s i nＧs e c t i c i d a l t o x i nC r y９C a．JI n v e r t e b rP a th o l,２０１０,１０４(３):２０３Ｇ２０８．[３０]魏纪珍,梁革梅,高希武,等．C r y２A b及C r y１A c杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响．应用昆虫学报,２０１２,４９(４):８３９Ｇ８４６．[３１]史艳霞,张永,窦宝峰,等．B t抗性和敏感棉铃虫幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶基因克隆及半定量测定．应用与环境生物学报,２００９,１５(５):６３０Ｇ６３３．[３２]徐艳聆,王振营,何康来,等．对B 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y１A b t o x i n b y m i d g u t e x t r a c t s a n d p u r iＧf i e d t r y p s i n s f r o mt h eM e d i t e r r a n e a n c o r n b o r e r S e s a m i a n o n aＧg r i o i d e s．JI n s e c tP h y s i o l,２００７,５３(５):４２８Ｇ４３５．[３７]K a i s e rＧA l e x n a tR．P r o t e a s e a c t i v i t i e s i n t h em i d g u t o fW e s t e r nc o r nr o o t w o r m(D i a b r o t i c av i r g i f e r av i r g i f e r a L e C o n t e)．J I n v e r tP a t h o l,２００９,１００(３):１６９Ｇ１７４．[３８]V a l a i t i sA P．B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s p o r eＧf o r m i n g t o x i n s t r i gＧg e rm a s s i v e s h e d d i n g o fG P IＧa n c h o r e da m i n o p e p t i d a s eNf r o mg y p s y m o t hm i d g u t e p i t h e l i a l c e l l s．I n s e c tB i o c h e m M o lB i o l,２００８,３８(６):６１１Ｇ６１８．３２４吴志红等:稻纵卷叶螟经B t水稻低强度处理多代后幼虫生长发育和中肠主要酶活性的变化。