分子标记发展简史
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。
通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。
分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。
分子标记技术
多组学数据整合
采用降维技术对高维数据进行处理，如主成分分析、t-SNE等，以降低数据复杂度并提高可视化效果。
数据降维处理
结合多种分析方法对整合后的数据进行联合分析，如聚类分析、差异表达分析、功能注释等，以深入挖掘数据中的生物学意义。
02
CHAPTER
DNA分子标记方法
利用随机引物对基因组DNA进行PCR扩增，通过电泳等方法检测扩增产物多态性。
原理
特点
应用
实验操作简便、快速、成本低，但稳定性较差，重复性有待提高。
适用于遗传多样性分析、品种鉴定、基因定位等研究。
03
02
01
基于DNA单链在非变性条件下的构象多态性，通过电泳等方法检测不同构象的DNA单链。
前景展望
随着基因组学、转录组学等高通量测序技术的不断发展，未来分子标记技术将更加精准、高效和便捷。同时，随着人工智能和大数据技术的融合应用，分子标记技术将在更多领域发挥重要作用，如精准医疗、个性化治疗、生态环境监测等。此外，随着合成生物学和基因编辑技术的不断发展，利用分子标记技术进行基因定位和编辑将成为可能，这将为遗传性疾病的治疗和农作物遗传改良提供新的思路和方法。
原理
微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）是两类重要的非编码RNA，它们在基因表达调控中发挥关键作用。miRNA通过靶向mRNA导致其降解或抑制其翻译来发挥作用，而lncRNA则通过多种机制调节基因表达。
原理
miRNA和lncRNA作为分子标记在疾病诊断、预后评估和治疗靶点筛选等方面具有潜在应用价值。例如，在癌症研究中，特定miRNA或lncRNA的表达水平与癌症的发生、发展和转移密切相关，可作为癌症诊断和治疗的生物标志物。此外，miRNA和lncRNA还可用于研究细胞分化、发育和逆境胁迫等生物学过程。
分子标记的应用及其发展
分子标记的应用及其发展班级：生物工程摘要：扩增片段长度多态性是Zabeau等(1992)发展的一种新DNA指纹技术.该技术原理简单,引物设计巧妙,既具有RFLP技术的可靠性又具有RAPD技术的高效性,被称为“最有力的分子标记”.系统介绍了AFLP分子标记基本原理、技术流程和优化措施,对AFLP标记在植物居群生物学、保护生物学、分子系统学等领域中的应用作了简要介绍,并对其应用及发展前景进行了展望.关键词:分子标记技术;AFLP;应用；研究进展；PCR；DNA近十年来，现代分子生物学技术迅猛发展，尤其是PCR方法的建立，引起了分子生物学发展史上的一场革命，以PCR为基础的DNA指纹技术大大加快了人类研究遗传多样性的步伐，为不同来源和不同复杂程度基因组的分析提供了有力的工具。
AFLP结合了RFLP和RAPD的特点，既具有RFI尸可靠性好、重复性高的特点，同时又具有PCR的高效性、安全性和方便性的优点，不需要了解基因组信息，且只需少量纯化的基因组DNA即可对整个基因组DNA酶切片段进行选择性扩增，扩增结果产生大量的序列经电泳形成复杂的DNA指纹，得以反映基因组细微的变化，适合所有生物基因组的检测，因此被认为是迄今为止最有效最理想的一种DNA分子标记技术，已广泛应用于动植物及微生物的遗传多样性研究品系分析[s]、高密度遗传图谱的构建、抗性育种、动物近交系选育、疾病诊断、生态分析等各个方面。
1AFLP标记的基本原理及特点1.1AFLP标记的基本原理AFLP (Amplified fragment length polymor-phism)是RFLP与RAPD相结合的一种分子标记技术,既具有RFLP标记的专一性、可靠性,又具有RAPD标记的随机性、方便性,因此被称为“最有力的分子标记”或“下一代分子标记”[10～12].由于该标记是通过选用不同的内切酶达到选择性扩增的目的,因此又被称作选择性限制片段扩增标记(Selec-tive restriction fragment amplification, SRFA).AFLP技术的基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增[13].1.2AFLP标记的特点(1)理论上可产生无限多的AFLP标记.(2)多态性高. AFLP标记具有比RFLP[18]、RAPD[19]、SSR[20]标记可靠、经济、有效的揭示物种多态性水平的能力.(3)DNA用量少,检测效率高.一个0.5mg的DNA样品可做4 000个反应, FayerC.(1996)报道他们以一人仅用三个月时间的速度构建了玉米的AFLP图谱,共产生了1 032个标记.(4)可靠性好,重复性高. AFLP分析采用特定引物扩增,退火温度高,使假阳性降低,可靠性增高.(5)对DNA模板质量要求高,对其浓度变化不敏感.AFLP反应对模板浓度要求不高,在浓度相差1 000倍的范围内仍可得到基本一致的结果.(6)选择上为中性.可用于亲本对后代群体种质贡献及基因追踪的研究.引物在不同物种间是通用的,可用于没有任何分子生物学研究基础的物种.2.AFLP技术的发展2.1内切酶的应用内切酶的选择决定了接头和引物的设计、扩增条件的设定及扩增形成DNA 片段的数目。
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。
通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。
分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。
观赏植物分子标记研究进展
观赏植物分子标记研究进展1 遗传标记的发展19世纪后半叶，孟德尔（G.Ｊ. Mendel）以豌豆为材料，发现了生物遗传的分离规律和独立分配规律，即著名的孟德尔定律。
1910年以后，摩尔根证实了“遗传因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。
1941年，美国遗传学家G. W. Beadle和生化学家E. L. Tatum提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。
1953年，J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA 分子结构的双螺旋模型,宣布了分子遗传学时代的到来。
1990年，J.G.K. Williams等和J. Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD 分子标记。
随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现，使得DNA标记走向商业化、实用化。
2 遗传标记的种类2.1形态标记形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相对差异。
形态标记基因的染色体定位最初是通过经典的二点、三点测验进行的。
通过判断不同性状间的遗传是否符合独立分配规律，来确定控制这些性状的基因是否连锁。
采用这种方法把相互连锁在一起的基因定为一个连锁群，并与染色体相对应，以性状间重组率作为这些基因在染色体上的相对距离，并确定其毗邻关系。
2.2细胞学标记细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。
染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。
用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料进行杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。
因此，染色体结构和数目的特征可以作为一种遗传标记。
2.3蛋白质标记许多蛋白质分子分析简单快捷，是有用且可靠的遗传标记。
用作遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种。
分子诊断发展简史
分子诊断发展简史：一场由“螺旋双杰”引发的发明分子诊断发展四阶段第一阶段：利用分子杂交技术进行遗传病基因诊断：通过婴儿胚胎期进行产前诊断，超早期预知某些疾病发生、发展和预后。
1978年著名没计划以科学家简悦威等应用液相DNA 分子杂交成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断。
第二阶段：以PCR为基础的分子诊断：PMullis发明PCR技术后迅速发展，标志着传统基因诊断发展到更全面的分子诊断技术。
第三阶段：以生物芯片技术为代表的高通量检测技术：1992年美国Affymetrix制作出第一章基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片技术阶段。
生物芯片技术解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量的问题。
第四阶段：以NIPT为代表的第二代测序技术：Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其均为通过DNA 片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。
1代、2代测序区别分子诊断三座丰碑1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，使遗传的研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。
在以后的近50年里，分子遗传学、分子免疫学、细胞生物学等新学科如雨后春笋般出现，一个又一个生命的奥秘从分子角度得到了更清晰的阐明。
DNA双螺旋结构的出现时分子生物学行程的重要标志，对人们认识蛋白质合成、DNA复制和突变具有重要意义，为分子诊断的蓬勃发展奠定基础。
“DNA之父”Wa tson、Crick50年前，科学界的“八大恶棍”之一凯利•穆利斯还只是美国某制药公司的小职员，整天做着把先天致病基因给剔除掉的白日梦，然而先要复制DNA，才有足够的时间慢慢修复。
分子标记技术
食安0801 02 邓凯近年来，现代生物技术，特别是分子标记技术发及其产品的检验检疫工作中，分子标记技术也得到展迅速，已被广泛应用于生物进化、系统分类、物种了越来越广泛的应用。
本文综述了分子标记技术在多样性、遗传育种、品种鉴定、基因组作图或基因定植物检疫实践中的应用和发展前景。
位、基因定位克隆（map-based cloning）等领域的研1分子标记技术发展概况究。
广义的分子标记（molecular markers）是指可遗传遗传标记（geneticmarkers）的发展经历了4个阶的并可检测的DNA序列或蛋白质标记；狭义的分子段：①形态标记（morphological markers），主要指植标记概念只是指DNA标记。
蛋白质标记包括种子储物学形态特征；②细胞标记（cytological markers），主藏蛋白、同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的要是染色体核型和带型等；③生化标记（biochemical 不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同markers），主要是同工酶和储藏蛋白等生化物质；等位基因编码的酶的不同分子形式）。
在出入境植物④分子标记（molecular markers），即核苷酸。
分子标记是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。
理想的分子基于“3S”技术的数字化烟草农业标记所具有的优点：①多态性高；②遍布整个基因③检测手段简单、迅速；④无基因多效性；⑤能够明确辨别等位基因；⑥实验重复性好；⑦直接以试论林木病虫害防治信息的数DNA的形式表现，不受植物的生长条件和发育阶段的影响，在植物的任何生长阶段都可检测。
第一代分子标记（以Southern杂交技术为核心）对数字农业的认识及其基本构想现代农为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写20世纪80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。
分子标记法
SSR基本步骤： (1)构建小片段或大片段的基因组。 (2)筛选阳性克隆。通过传统的影印或挑单菌落 点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固 定后，用标记过的序列重复寡核苷酸或含微卫 星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选 出其中的阳性克隆。 (3)测序、设计引物、优化PCR反应条件，获得 的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑选 后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域的 序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得稳 定、可靠的SSR标记。
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。 2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
新遗传资源的鉴定： 李松涛等对抗锈病的两个小冰麦进行RAPD分析， 从40个引物中筛选到一个与抗锈基因连锁的
RAPD标记。分析结果有力地说明，小冰 麦是从冰草获得抗锈基因的易位系。
目的基因的定位与分离： 利用与目标质量性状紧密连锁的分子标记进行 质量性状选择是一种有效途径。标记目标性状 基因日前主要是利用分离群体分组分析法 (Bulked Segregant Analysis.简称RsA)和近 等基因系法(Near Isogenis Lines.简称NILS)。 近年来各主要农作物上均有许多重要的质量性 状基因被标记，如水稻上的抗稻瘟病基因、光 敏不育基因、矮秆基因、小麦上的抗白粉病基 因、抗叶锈基因、春化反应基因及耐盐基因等。
目的基因的分离
——分子标记法
一、分子标记发展简史
1869年，瑞士医生Miescher就开始了核酸的研究。 1930年提出两种核酸(RNA和DNA)的概念。 1953年Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构及其半保留 复制模型,之后，对基因的DNA序列及其表达和调控等方 面的研究取得了长足进展。 20世纪60年代中期,从细胞中分离基因的工作拉开了基因工 程的序幕。 60年代末和70年代初,主要致力于研究基因的体外分离技术。 1980年Bostern将生物个体之间DNA序列的差异作为标记 用于遗传作图，从此开创了在DNA水平上研究遗传变异 的新阶段。 近10年来，在人类基因组研究计划的推动下，分子标记的 研究与应用得到厂迅速的发展。
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分子标记发展简史作者：周宇爝来源：《现代农业科技》2009年第11期摘要比较详细地介绍了分子标记的概念、理论基础和目前常用的分子标记的的发展过程和技术特点。
关键词分子标记;概念;基本原理;特点中图分类号Q78文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0264-07随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展,越来越多的遗传标记被发现,遗传标记的种类和数量越来越多。
主要分为4种类型,即形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。
显然,前3种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。
与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制,数量丰富,遗传稳定,对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。
分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础[1-2]。
1分子标记的来源及定义1.1分子标记的来源“标记”一词,根据汉语大词典的解释,是“便于识别的标识或者记号”。
随着人们对生命本质认识的一步步加深,在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列,甚至占到了全序列的90%以上。
这些非编码序列具有特殊的一级结构,如串联重复、回文结构、Alu序列(反向重复序列)、CpG岛等,并且全基因组分布[3]。
随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序,一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位,整个基因组内的标记密度越来越高,并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁,所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。
1.2分子标记的定义广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。
蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(不同基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式)。
狭义的分子标记仅仅指DNA标记,一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。
这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。
蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。
构成蛋白质的氨基酸有几十种,而构成DNA的碱基只有4种,通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异,且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。
并且到目前为止,蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟,可控性也不高。
因此,蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。
但从更严格的意义上讲,蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记,因为其更稳定、多态性更高,每种蛋白质都是唯一的(序列唯一、构象唯一)。
1.3理想的分子标记理想的分子标记必须达到以下要求:①具有高多态性;②共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;③能明确辨别等位基因;④遍布整个基因组;⑤除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;⑥选择中性(即无基因多效性);⑦检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);⑧开发成本和使用成本尽量低廉;⑨在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)[5]。
特别需要提出的是,所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁(连锁程度越高越好)甚至共分离。
但是,目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。
使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。
2目前常用分子标记的基本原理2.1限制性片断长度多态性(RFLP)限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。
此技术基于生物个体的基因组的变异,是研究不同基因组间的差异的技术,由Grod-zicker于1974年首先提出。
其基本原理是:物种经过长期的进化,各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同,或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。
若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化,这样该位点就不能被切开,使得DNA片段比亲本长;若突变后形成新的酶切位点,则酶切后的片断变短。
这样,通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。
对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异,但对于核DNA而言,DNA片断呈连续分布,无法辨别差异,需通过Southern杂交转移至支持膜上,用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术,发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。
检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱,即为RFLP[5,6]。
这种特定的限制性片断与DNA探针的组合,便可以作为遗传标记。
由于RFLP起源于DNA的变异,不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响,具有遗传的专一性和稳定性的特点,在数量上不受限制,可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记,而且每个标记变异大,检测方便。
用于检测RFLP的克隆探针可随机选取,可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA,也可以是总DNA。
这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性,为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析,遗传图谱的构建提供了有力的工具。
并且RFLP是共显性标记,能够区别出杂合体与纯合体[7]。
虽然RFLP具有结果稳定可靠,重复性好,特别适合建立连锁图等优点,但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。
并且RFLP 对DNA多态性检出的灵敏性不高,RFLP连锁图谱上还有很大的空间区(gap),甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等,这些都是需要进一步完善的地方。
2.2随机扩增多态性DNA(RAPD)随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美国杜邦公司的Williams 和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。
此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DNA片段的遗传标记技术。
这一技术建立于PCR反应基础之上,以随机的短脱氧核苷酸(通常为10个碱基)作为PCR引物,对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。
扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开,经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。
在基因组上,每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段,对一个特定的基因型来讲,这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。
它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到不同的带谱。
仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。
事实上,不同基因组DNA总是有一定差异的,所以用RAPD即可进行分子标记研究。
理论上讲,在一定的扩增条件下,扩增的条带数取决于基因组的复杂性。
对特定的引物,复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同,但对于某一特定引物来说,它同基因组DNA序列有特定的互补区域。
这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话,即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内,就可以扩增出这一片段。
如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变,通过对PCR产物的检测,即可找出基因组DNA在这些区域内的多态性[10]。
由于RAPD分析时所用的引物数量极大,并且引物序列随机,虽然对某一引物而言检测的区域有限,但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。
与RFLP是从一系列酶切片段中寻找多态性片段不同,RAPD是利用PCR随机合成多态性DNA片段,检测被扩增区域内的遗传特征变化。
其具体优点体现在:①极大的丰富性,能反映整个基因组的变化;②强大的可探测性,无需合成特定的引物;③高效性与灵敏性。
短期内可以得到大量的扩增片段,只要是遗传特异性的发生变化,即使亲缘关系很近的个体也可以识别出[11]。
RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的,所用引物通常多达几百种,并且1套引物可以用作多个物种或者群体,所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。
因此,用来鉴定品种纯度是很有用的。
据报道[9],从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DNA片段;中国科学院遗传所陈洪等利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度,鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。
RAPD 技术反应灵敏、多态性强,操作简便,速度快,费用低,既有大量的随机引物可供筛选之用,又不受种属的限制,被广泛用于多种作物的种子鉴定[9,11,12]。
由于是随机引物对整个基因组进行多态性检测,在技术上简单易行不需要克隆制备、同位素标记、Southern印记等预备性工作,所需DNA样品量少,安全性好,价格便宜,是继RFLP之后应用最广的分子标记。
由于引物没有特异性,1套引物可用于不同生物基因组的的分析,分析速度快,短期内可得到大量的遗传标记,并克服了同工酶位点少和RFLP操作技术复杂的弊端,已经广泛应用于遗传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染色体区段的鉴别和分离以及动植物育种等方面,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。
水稻的Xa-21 基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RAPD标记,然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
与PCR相比,RAPD具有以下特点:①RAPD使用的是随机引物,不需要预先了解目的基因和相应的序列;②操作简便,实验周期短,能在较短的时间筛选大量样品;③引物具有普遍适应性,适用于自动化操作分析。
与RFLP相比,RAPD具有以下特点:①RAPD分析只需要少量模板,1次扩增仅需20~100ng,这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。
比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA 分析是切实可行的。
②RAPD标记具有更大的随机性,亦有利于图谱的构建。
对于DNA含量大的和多倍体物种,RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交,所得到的混合指纹会对其他等位基因的阐明带来困难。
而且由于DNA量较大,进行单拷贝的Southern杂交不很实际,至少需要很长的曝光时间,并且已知的探针数量有限。
RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。