配置Sf9细胞培养液方法
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
sf9细胞冻存方法
sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。
下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。
2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。
3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。
根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。
4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。
5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。
6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。
最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。
7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。
使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。
为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。
请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。
Sf9细胞的培养及转染
?
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存
? 简易程序：
?
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系
以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按
每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至 液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
细胞复苏方法
? （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～ 38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。
? （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
? （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
Sf9细胞的传代
? 判断分离（散）细胞培养物是否需要传代 的主要指标就是观察培养物是否已基本长 满培养瓶皿的底壁。
? 一般来说，原代培养物未达到生长基质的 80%表面面积，不要急于传代，对于拟行 首次传代的培养物更如此。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B19-XA? 株VP1蛋白在Bac-to?-B?ac系统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac? Baculovirus Expression System 实验流程》
Sf9传代的方法
? 3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多 个培养瓶皿内。
? 有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传 代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下， 传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养 液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。
? （以1：5或更多为宜，每 2-3天传代一次） 28℃培养（不用 CO2培养箱）。
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
申科sf9 hcp残留检测试剂盒 （一步酶联免疫吸附法）说明书
SHENTEK®Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）说明书货号：1301310在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点和常见问题！版本：A/0仅供研究用湖州申科生物技术股份有限公司⏹产品名称通用名：Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）。
⏹包装规格96测试/盒。
⏹预期用途Sf9HCP残留检测试剂盒（一步酶联免疫吸附法）适用于昆虫细胞Sf9来源的宿主蛋白残留定量检测，如基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的生物制品，包括但不限于重组蛋白、疫苗，基因治疗AAV载体等。
该试剂盒仅供研究使用，不可用于临床。
⏹检测原理本试剂盒基于固相酶联免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA），采用双抗体夹心的方式对样品中残留Sf9HCPs进行定量检测。
该试剂盒内的多克隆抗体是通过裂解sf9细胞所得HCPs作为抗原，免疫绵羊获得血清，进而通过亲合纯化方法得到高质量抗体。
抗体通过目前主流的覆盖率分析法规方法评估其覆盖率水平。
该分析方法通过在预包被抗Sf9HCPs多克隆抗体的酶标板中加入校准品或待测样品、HRP标记的抗Sf9HCPs多克隆抗体进行共孵育；洗涤后，利用加入的TMB底物进行显色反应，最后使用终止液终止酶催化反应。
利用酶标仪在450nm波长下测读吸光度值，其吸光度与校准品和样品中的HCPs浓度成正相关，通过剂量-反应曲线可计算得出样品中Sf9HCPs的浓度。
本试剂盒对实际样品无需进行特殊处理，仅需通过合适的稀释比例进行适用性验证即可直接使用。
本试剂盒检测步骤少，快速，专一性强，性能稳定可靠。
图1检测原理示意图试剂盒组分表1.试剂盒组分组分产品号规格说明Sf9HCP 校准品PNB0112瓶冻干粉。
精确量取500μL复溶液，溶解，静置约5分钟，溶液应该澄清透明，无肉眼可见不溶物。
具体浓度见瓶身标注。
抗Sf9HCP 预包被酶标板PNA0128孔×12条已包被适量的绵羊抗Sf9HCPs多克隆抗体，铝箔袋密封包装，含干燥剂。
sf-9细胞培养2
血清中含有: 血清中含有: 多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ①多种蛋白质(白蛋白,球蛋白,铁蛋白等) ②多种金属离子 激素; ③激素; 促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白, ④促贴附物质,如纤粘蛋白,冷析球蛋白,胶 原等. 原等. ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
血清质量好坏是实验成败的关键. 血清质量好坏是实验成败的关键. 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 常用血清有胎牛血清,新生牛血清,小牛血清, 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好. 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物, 无细菌,支原体,病毒污染. 无细菌,支原体,病毒污染. 血清的灭活(消除补体活性): ):56 血清的灭活(消除补体活性):56 ℃ ,30 min 血清的消毒: 血清的消毒:过滤除菌
实验要求: 实验要求:
进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 进实验室先洗手,签到.进细胞培养室要换鞋. 洗手 必须保持显微镜,试验桌,超净台以及其它用具 的清洁和整齐,各种药品,试剂按照规定的用量 进行使用.用完后要恢复摆放位置 进行使用.用完后要恢复摆放位置. 恢复摆放位置. 严格遵守显微镜使用的注意事项,否则损坏物镜, 同时也影响试验的进行. 离开实验室前,必须检查水龙头和电开关,避免 发生事故.
培养皿和培养板等表面消毒
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒, 使空气得到净化. 净化空气徐徐通过工 作台面,使工作台内 构成无菌环境.
生化培养箱
生化培养箱设定的条件为28 ℃ . 使用生化培养箱培养细胞时应注 意的问题: 1)保持培养箱内空气干净.定 期消毒 (90 ℃ ,14 h). 2)箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏 水槽中以保持箱内湿度,避免培 养液蒸发.
细胞培养液的配制
RPMI1640培养液配制过程
准备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45μm,0.22μm),磁 力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培养粉,1N HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎 牛血清,新5μm和0.22μm滤膜, 包装, 高压 蒸气消毒
培养液配制过程 （以RPMI1640为例）
1. 物品准备
(1）滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、 量筒、pH计、贮液瓶等。
(2) 培养粉、 NaHCO3、
1N HCl、青霉素、链霉
素、血清、新鲜制备的
三蒸水
2. 滤器消毒准备
取孔径为0.45μm和0.22μm滤膜各一张，浸入三蒸水中
(5) 按要求加血清 30min灭活）
（血清一般需经56℃，
例如: 10%胎牛血清
无血清培养液 900ml
灭活胎牛血清
100ml
(6) 正压过滤除菌 (气压适当, 防止滤膜破裂) (7) 分装,贮存于4℃，2周内用完。 (8) 无菌试验 : 取样 , 37℃放置 24－ 72h, 无细 菌、霉菌污染方可使用
细胞培养液的配制
培养基的选择
依据: 经验、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM 培养基的来源 市售干粉培养基---自己配制 液体培养基---直接使用(注意有效期)
培养基的除菌方法 过滤除菌: (1) 正压过滤---效率高 (2) 负压过滤---效率低 高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加 培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、 PDGF等
注意事项
SF9细胞的建立及生物学特性的鉴定
2020年第8期 吉林畜牧兽医97·经验交流·JingYan JiaoLiuSF9细胞的建立及生物学特性的鉴定李来旭1，刘鑫莹1、潘添博2，李 睿31.重庆永健生物制品有限公司，重庆市 400000；2.重庆市合川区合阳城街道办事处畜牧兽医站，重庆市 400000；3.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150000摘 要：自菌种保藏中心引进1株SF9细胞系，扩大培养，保存于液氮，建立SF9细胞基础细胞库。
对细胞进行形态、生长曲线、纯净性、染色体分析及致瘤性等特性进行研究。
结果表明，细胞呈圆球形；细胞呈S 型生长曲线；无细菌、支原体及外源病毒污染；细胞的染色体数目主要分布在170～190之间；无致瘤性。
关键词：SF9细胞系；基础细胞库；生物学特性杆状病毒表达系统(BEVS)被广泛用于疫苗开发及外源蛋白表达。
BEVS 因其操作简便、安全性及适用于大规模生产等优势, 具有极大的应用前景。
杆状病毒表达的受体为昆虫细胞，目前应用较广的细胞系为SF9细胞。
目前兽用疫苗领域针对猪圆环病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒及鸡新城疫病毒等多疫苗在SF9 细胞中表达，极大程度上缓解了畜牧业的养殖风险和生产成本。
本研究自菌种保藏中心引进SF9细胞系，进行细胞生物学特性研究，为开展SF9细胞系及及传染性法氏囊VP2疫苗的研究与开发提供细胞资源和理论依据。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞SF9细胞，购自美国菌种保藏中心ATCC。
1.1.2 试验试剂：SF9无血清培养基，胎牛血清，DMSO 购自美国gibco 公司；无菌培养基，重庆永健生物制品有限公司制备。
1.2 方法1.2.1 细胞传代：取对数生长期的SF9细胞，以900 r/min 离心5 min，弃去上清，用SF9无血清培养基稀释细胞密度为0.8×106个/mL 分装到三角培养瓶中。
培养转速为150 r/min，置27 ℃培养箱中培养。
1.2.2 基础细胞库的建立 取生长状况良的好SF9细胞进行离心，加入冻存液，吹打混匀细，调节细胞密度为1.2×107个/m L ，每只冻存管分装1 mL。
Sf9细胞的培养及转染解析
超净台
超净工作台的工作原 理是利用鼓风机驱动 空气遁过高效滤器除 去空气中的尘埃粒， 使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
生化培养箱
• 生化培养箱设定的条件为28℃ 。 • 使用生化培养箱培养细胞时应注
意的问题：
• 1）保持培养箱内空气干净。定 期消毒（90 ℃ ，14 h)。
转染基本步骤
• 1、接种细胞并使其贴壁 • 2、制备重组Bacmid与Cellfectin Reagent
（ ）复合物 Invitrogen公司转染试剂 • 3、加入复合物 • 4、去掉复合物混合液，加入完全培养基，
培养细胞直到细胞出现病毒感染迹象 • 5、取上清液分离纯化得目的蛋白
• 4）送入培养箱中继续培养。
细胞培养－换液
• 对于像Sf9这样的半贴壁的培养物，可按如 下步骤操作：
• 吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。 • 加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的
量相同。 • 放回原来的培养箱中继续培养。
转染
• 转染(transfection)指真核细胞由于外源DNA 掺入而获得新的遗传标志的过程。
病毒重组，获得重组病毒（酶切酶连转化） 2、将重组的病毒纯化 3、感染昆虫细胞或虫体（转染） 4、外源基因随着病毒的复制而获得表达
*《人细小病毒B19- XA株VP1蛋 白在Bac- to-Bac系 统中的表达及其反应原性》 *《Bac-toBac® Baculovirus Expression System 实验流程》
• （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10 倍以上。
• （3）低速离心10分钟。 （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的 细胞。
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Sf9细胞培养液配置方法
1.消毒烘干下列用品
500毫升玻璃瓶：两个（其中一个灌装500 毫升高洁水备用）
玻璃烧杯：一个、玻璃量筒：一个
2.准备下列设备
天平、搅拌器、称量纸、量勺、75%酒精、酒精棉球、试验用手套
3.UV消毒
用清洁液擦净洁净台；工作区域用酒精拭擦一遍。
所有准备好的用品和设备预先放进
洁净台；UV消毒至少2个小时；工作前关闭UV灯，打开内置灯和风扇
4.称量
用称量纸称出相当于制备250毫升培养液的粉末(约11.7g)，倒入玻璃烧杯中
5.溶解、定容
将玻璃烧杯至于搅拌器上，缓缓加入约100-150毫升的清洁水。
将搅拌器调至低速，
缓缓搅拌；溶解过程中不能产生泡沫，产生泡沫意味着蛋白变性；将溶解后的培养液
加入到量筒内；必要时补充水量直至250毫升。
6. 调节pH
按4.7mL 7.5%NaHCO3/L培养液的比例加入NaHCO3，逐滴加入1N NaOH至pH值为
5.9。
过滤后培养液pH值为
6.2左右。
7.过滤
用无菌针筒将培养液缓缓通过0.22m的过滤膜过滤，必要时更换新的过滤器；过滤液
直接进入消毒玻璃瓶中。
8.加入双抗和FBS
按照相应比例，加入1%双抗和10%胎牛血清。
9.标记、保存
过滤后的培养液要标明制备日期。
根据使用需要可将培养液分别保存在4度或-20度。
4度保存的培养液使用不超过1周；-20度保存的培养液使用不超过一个月。