镰刀型细胞贫血症基因的检测方法
镰刀型细胞贫血症基因突变类型
镰刀型细胞贫血症基因突变类型
1 前言
镰刀型细胞贫血症（MDS）是一种常见的遗传性血液病，它可导致血液中细胞贫乏，从而导致血液功能紊乱、出血以及免疫功能的严重障碍。
MDS由一系列遗传突变造成，这些突变可影响细胞凋亡、细胞分化等。
2 MDS基因突变
通常情况下，MDS是由一个或多个基因突变引起的，这些突变可能会改变细胞凋亡、分化及增殖的功能。
最常见的MDS基因突变有以下几种：
（1）TP53基因突变。
TP53基因具有细胞凋亡和细胞生长的调节作用，它在MDS中是最常见的突变基因。
（2）RPS15基因突变。
RPS15基因是一种细胞内的蛋白，它的缺失会导致细胞的凋亡，从而导致MDS。
（3）CD11B基因突变。
CD11B基因参与了细胞形成及免疫反应，突变后可导致细胞分化反应减弱，从而引起MDS。
（4）SF3B1基因突变。
SF3B1基因参与细胞分化，可能会导致细胞凋亡过程的损害。
3 结论
MDS是一种常见的遗传性血液病，其发病机理是复杂的。
通常情况下，这种疾病是由一次基因突变或多次基因突变引起的，其中常见的基因突变有TP53基因突变、RPS15基因突变、CD11B基因突变和SF3B1基因突变。
因此，为了更好地了解MDS发病原因，制定有效的治疗方法，需要进一步研究MDS基因突变机制。
镰状细胞贫血症的分子机制
镰状细胞贫血症的分子机制镰状细胞贫血症，这个名字听起来是不是有点拗口？咱们聊聊这病，就像讲个故事一样。
想象一下，咱们的血液里有很多红细胞，像小船一样在血管里悠哉游哉地游着，运送氧气，让咱们活力满满。
可是，有些小船却变成了镰刀的形状，怎么回事呢？这就得从咱们的基因说起了。
基因就像是身体的说明书，告诉细胞怎么做它们该做的事情。
镰状细胞贫血症的根本原因，就是这些基因出了点小问题。
有一段时间，科学家们发现，镰状细胞贫血症和一种叫“β珠蛋白”的蛋白质有关。
平常的红细胞里，β珠蛋白和α珠蛋白结合，形成一种叫“血红蛋白”的东西。
正常的血红蛋白像个快乐的小伙伴，帮助红细胞保持圆润的形状，顺利通过血管。
但是，等到基因出问题了，β珠蛋白就变得不那么友好了。
这一变，血红蛋白的形状就跟原来的不一样了，红细胞也就变成了镰刀的模样。
你想想，镰刀形状的红细胞在血管里走动，那可不是轻松的事，简直就像在狭窄的巷子里搬家，走哪都不顺！更有趣的是，这种镰刀状的细胞还特别容易“结伴”，一旦聚在一起，咱们的血管就像被堵住了一样。
哎呀，真是让人心慌慌的。
不仅如此，这些镰刀细胞的寿命也短得可怜，正常的红细胞能活个120天，而镰状细胞可能几天就“退休”了。
这下好了，身体里总是缺少红细胞，导致贫血，身体就像是缺了水的花儿，显得无精打采。
镰状细胞贫血症不光是让人感觉疲惫，还会引起各种麻烦。
比如，疼痛。
那些镰刀形状的细胞在血管里聚集，压迫周围的组织，疼痛感就来了，真是让人恨不得跳脚。
不过，不同的人体验疼痛的感觉不一样，有些人痛得厉害，有些人却只是小痛小痛的，真是个看心情的病。
咱们能不能治好它呢？虽然现在没有彻底根治的办法，但有些治疗方法还是能帮忙。
比如，医生会给病人开一些药物，帮助缓解疼痛，改善生活质量。
有些人甚至接受骨髓移植，换个“新的说明书”，让身体重新开始。
这就像换了个新电脑，运转起来可顺畅多了。
还有些人选择通过饮食来增强身体的抵抗力，像吃些富含叶酸和维生素的食物。
镰刀型细胞贫血病指南(罕见病诊疗指南)
106.镰刀型细胞贫血病概述镰刀型细胞贫血病（sickle cell disease，SCD）是一种常染色体显性遗传血红蛋白（Hb）病。
由于β-肽链第6位的谷氨酸被缬氨酸替代，使血红蛋白S （hemoglobin S，HbS）异常，以致红细胞呈镰刀状得名。
临床表现为慢性溶血性贫血、慢性局部缺血导致器官组织损害、易感染和再发性疼痛危象（以前也称为镰状细胞危象）。
镰状细胞综合征通常用于描述与链状细胞改变现象有关的所有疾病，包括纯合子状态、杂合子状态、HbS与其他异常血红蛋白的双杂合子状态3种主要表现形式，而镰状细胞贫血病这一术语则通常用于描述HbS的纯合状态。
病因和流行病学镰状细胞贫血病是1949年世界上发现的第一个分子病，由此开创了疾病分子生物学。
正常成人血红蛋白是由两条α链和两条β链相互结合成的四聚体，α链和β链分别由141和146个氨基酸顺序连接构成。
镰状细胞贫血患者因β链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，形成了异常HbS，取代了正常血红蛋白（HbA），在脱氧状态时HbS分子间相互作用，聚集成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）。
这种多聚体形似长绳状，由于其HbS的β链与邻近的β链通过疏水链连接，结构非常稳定，水溶性较氧合HbS 降低5倍以上。
纤维状多聚体与细胞膜平行紧密接触，也常与其他纤维连成线，所以当有足够多的多聚体形成时，红细胞即由正常的双凹圆盘状扭曲变为典型的新月形或镰刀形，并导致红细胞变形性显著下降。
脱氧HbS的聚合是慢性缺血、血管阻塞现象的必要条件。
红细胞内HbS浓度、脱氧程度、酸中毒、红细胞脱水程度等许多因素与红细胞镰变有关。
红细胞镰变的初期是可逆的，给予氧即可逆转镰变过程。
但当镰变已严重损害红细胞膜后，镰变就变为不可逆，即使将这种细胞置于有氧条件下，红细胞仍保持镰状。
镰变的红细胞僵硬，变形性差，可受血管的机制破坏和单核巨噬系统吞噬而发生溶血。
镰变的红细胞还可使血液黏滞性增加，血流缓慢，加之变形性差，易堵塞毛细血管引起局部缺氧和炎症反应导致相应部位产生疼痛危象，多发生于肌肉、骨骼、四肢关节、胸腹部，尤以关节和胸腹部为常见。
镰刀形红细胞贫血
外周血干细胞(PBSC)的采集方法与成分血的单采术类似，即用血
细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞组分。目前最常用的细 胞分离机机型是FewnalCS—3000(或CS—3000Plus)。多采用分离淋巴
细胞的程序分离。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺 困难(尤其是小儿)时需中心静脉穿刺。 采集成人时的血流速度为50—60m1/min，每次分离4—6循环(约3— 4h)，分离血液的总容积9L，依据情况连续或隔日采集。对儿童采 集时的血流速度和分离的总容积依年龄和体重而定。
羊膜穿刺术
取样时间：
1.中孕羊膜腔穿刺：以在妊娠16 ～21周进行最佳。在孕15周时， 羊水容量已达200ml，一般抽吸 羊水20ml。
2.早孕羊膜腔穿刺：在妊娠9～13 周进行。7～10周时抽取羊水5ml ，10周后抽取羊水量可达10ml。 该方法对胚胎发育可能有影响， 所取的标本量少，故目前很少应 用。
镰形红细胞贫血&疟原虫
猜测：
寄生虫感染的红细胞选择性发生镰变，使单核巨噬细胞系统能更 加有效地清除感染的红细胞，通过钾流失增加，红细胞PH降低 ，寄生虫感染的红细胞对内皮细胞粘附增加等，对寄生虫的生长 产生抑制效应。
高空缺氧
平原进入高原后，红细胞和血红蛋白显著 增加，增加的程度与海拔高度、居住时间 、劳动强度及性别有关。
什么是HLA配型？
HLA抗原是人类主要组织相容性复合物抗原，它们与同种异体移 植中的排斥反应有密切关系，故又称为移植抗原。
HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子均是主要移植抗原，但这两类抗原在移植中 所起的作用是不相同的。体外实验表明，供受体Ⅱ类分子不同时 ，供体Ⅱ类抗原能直接刺激受体CD4+T细胞增殖和淋巴因子分泌 ，即MLR。这一反应是免疫应答的中心，因为B细胞抗体的生成及 CD8+T细胞发育和分化，都有赖于CD4+T细胞的活化以及淋巴因 子的分泌。而Ⅰ类分子不同以及次要组织相容性抗原不同，就会 诱发CD8+T细胞增殖和分化成熟，导致移植物的破坏。
简述镰刀型细胞贫血症是怎样引起的其检测机理是什么文档
机理：镰刀型细胞贫血症是一种遗传性贫血症，属隐性遗传。
是基因突变产生的血红蛋白质分子结构改变的一种分子病。
正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。
α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。
镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。
英格兰姆发现镰刀型细胞贫血症是因为链中第六个氨基酸发生变化引起的。
正常健康的人第六个氨基酸是谷氨酸，而患镰刀型贫血症的人则由一个缬氨酸代替谷氨酸。
一般用来诊断及侦测镰刀型贫血症患者的分析测试包括：·全血球计数分析(Complete blood count , CBC) ·S血红素筛选测试(Hemoglobin S screening test) ·血红素电泳分析(Hemoglobin electrophoresis) ·镰形细胞分析测试(Sickle cell test)用聚合酶链反应(PCR)和寡核苷酸探针(ASO)方法或采用PCR和限制性内切酶.疾病检查1.外周血血红蛋白为50～100g/L，危象时进一步降低。
网织红细胞计数常在10%以上。
红细胞大小不均，多染性、嗜碱性点彩细胞增多可见有核红细胞、靶形红细胞异形红细胞、Howell-Jolly小体。
镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。
红细胞渗透脆性显著降低白细胞和血小板计数一般正常。
2.骨髓象示红系显著增生，但在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变3.血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显著增高。
本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。
4.血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高。
5.红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15天[正常为(28±5)天]6.血红蛋白电泳显示HbS占80%以上HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如。
镰状细胞贫血症
致病机理
♦ 病人的红细胞会变成镰刀形是由
于红细胞中的血红蛋白存在先天 缺陷所致。 缺陷所致。血红蛋白有四条链共 574个氨基酸 其中一个谷氨酸 个氨基酸， 574个氨基酸，其中一个谷氨酸 缬氨酸所取代 所取代， 被缬氨酸所取代，破坏了血红蛋 白的分子结构。 白的分子结构。
♦ 这个氨基酸所构成的血红蛋白链由一对基因
控制，正常人的基因为HbAHbA， 控制，正常人的基因为HbAHbA，而病人的则 HbAHbA HbSHbS，HbS的溶解性低于HbA， 的溶解性低于HbA 为HbSHbS，HbS的溶解性低于HbA，而脱氧后 HbS溶解性又进一步降低 溶解性又进一步降低， 的HbS溶解性又进一步降低，在氧张力低的 毛细血管区，HBS形成管状凝胶结构 形成管状凝胶结构（ 毛细血管区，HBS形成管状凝胶结构（如棒 状结构），导致红细胞扭曲成镰刀状（ ），导致红细胞扭曲成镰刀状 状结构），导致红细胞扭曲成镰刀状（即镰 ）。这种僵硬的镰状红细胞不能通过毛细 变）。这种僵硬的镰状红细胞不能通过毛细 血管，加上HBS HBS的凝胶化使血液的粘滞度增 血管，加上HBS的凝胶化使血液的粘滞度增 阻塞毛细血管，机体免疫系统激活， 大，阻塞毛细血管，机体免疫系统激活，清 除变异红细胞，导致贫血。 除变异红细胞，导致贫血。
♦
骨质疏松， 骨质疏松，导致脊柱 变而另形呈双凹形或 鱼嘴形股骨头无菌性 坏死一方面骨骼梗死 又可导致骨小梁增加 和骨质硬化。 和骨质硬化。
眼部症状由视网膜 梗死、眼底出血、 梗死、眼底出血、 视网膜脱离等病变 引起。 引起。神经系统表 现有脑血栓形成、 现有脑血栓形成、 蛛网膜下隙出血。 蛛网膜下隙出血。
镰状细胞贫血症
课题主讲： 课题主讲：张琴 课件制作： 课件制作：张明 资料收集：张文博、张朋、张茜、张谦、 资料收集：张文博、张朋、张茜、张谦、张曦
基因治疗
腺病毒可插入的外源基因可达7.5kb。
人们对腺病毒的基因组构造非常了解，以它作
为基因治疗的载体比较容易控制。
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腺病毒作为基因载体也存在某些缺点： ①重组的病毒DNA是以游离的形式存在于细胞 中，因而基因表达的时间较短，不能满足基因 长期表达的需要；如需进行长期表达，必须反 ②重组腺病毒载体的反复使用，有可能会诱发
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治疗基本步骤:
ADA基因+逆转录病毒载体
导入患者淋巴细胞
体外扩增
回输病人体内
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%
维持免疫系统功能,改善病人症状
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腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID)
第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)
• 病因: • 淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积
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这项研究揭示了基因治疗方法的潜力，但是同时也表 现出了基因治疗的有限性，产生的毛细胞可以像正常细胞
那样产生电信号，并且与神经元联系；然而当幼年小鼠使
用基因治疗后两周，Atoh1基因的效应就会减弱。相关研究 成果刊登在了5月9日的国际杂志Journal of Neuroscience 上。
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四川大学华西医学中心研究人员采用反 义核酸阻断生物钟基因表达的方法，对小鼠进 行戒毒实验，发现可以阻断生物钟基因参与调
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张康的研究小组比较了600例视网膜萎 缩和非萎缩病人之间TLR3的差异. 发现 TLR3某些突变可以保护病人免受进一步的 炎症性萎缩。携带保护型突变TLR3的病人 比正常基因型的病人罹患视网膜萎缩的危 险低得多,程度取决于携带突变的比例.而相 比之下,携带非保护型突变的病人则更容易 被小RNA诱发出萎缩。
镰刀型细胞贫血症 基因
镰刀型细胞贫血症基因
镰刀型细胞贫血症是一种遗传性疾病，主要是由于基因突变引
起的。
这种基因突变导致了血红蛋白分子结构的改变，使得红细胞
在缺氧的情况下变得畸形，呈现出镰刀状的形态。
这种突变主要发
生在血红蛋白β基因上，导致了血红蛋白分子中第六位的氨基酸由
谷氨酸变为缬氨酸，这种突变形成了血红蛋白S（HbS）。
这个突变
基因是以常染色体显性遗传方式传递的。
镰刀型细胞贫血症的基因突变导致了一系列的生理和临床表现。
在缺氧的条件下，变异的血红蛋白S分子会聚集在一起形成长链，
导致红细胞形状变得畸形，并且易于堵塞血管，引起缺血性损害。
这会导致患者出现贫血、疼痛危机、感染易感性增加等临床症状。
此外，镰刀型细胞贫血症的基因突变也可以导致其他临床表现，比如溶血性贫血、肝脏和脾脏的功能异常等。
由于这是一种遗传性
疾病，患者需要通过家族史和基因检测来进行诊断，同时遗传咨询
也是非常重要的。
针对镰刀型细胞贫血症的基因突变，目前也有一些基因治疗的
研究和临床试验，希望可以通过基因修复或基因治疗的方式来治疗
这种疾病。
总的来说，镰刀型细胞贫血症的基因突变是导致这种疾病的根本原因，对于这一基因突变的研究和治疗具有重要的意义。
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湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性
内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。
当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。
如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生
了改变。
检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶B.DNA 连接酶C.限制性内切酶D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。
采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。
解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。
而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。
必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。
根据DNA 分
子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。
2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。
从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。
所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的
限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上
三段对应的已标记的mRNA 进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。
利用相关知识点命题的请看如下高考试题。
〔2007江苏·38〕单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。
镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。
已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。
有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。
下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示
意图。
(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A 变成T) 引起的。
巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。
正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。
(2)DNA或RNA分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。
利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA… 。
(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。
这对夫妇4次妊娠的胎
儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。
解析:比较基因B 和和突变后的基因b 的碱基组成，发现它们的差别仅是B 基因一条链某一位点上的碱基A 突变成b 基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。
据图观察，正常基因B 经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b 经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。
所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4 的基因型时，可以这样认为：基因型Bb 的个体同时带有B 基因和b 基因，所以其应同时含有与B 基因对应的二条带谱，与b 基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1 和Ⅰ-2 得到验证）。
符合这个条件的仅有Ⅱ-3。
同理，基因型为BB 的个体应仅有与B 基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1 和Ⅱ-4。
bb 的个体是只能是含有与 b 基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。
作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。
既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA 链上的碱基是A 时，作探针用的RNA 链上的碱基应为U。
通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA 探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两
种技术的综合分析方法。
核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。
限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇 B 组病毒B1-B6 型检测及分型中的应用---- 利用GCG 软件对柯萨奇B1-B6 型病毒cDNA 全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现, 所以特别提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。
---ACGT ．GTT--- ---ACGAGTT--- 正常的血红蛋白基因B 突变的血红蛋白基因b 图注:↑限制酶酶切点·突变碱基探针杂交区域带谱I II 1 1 2 2 3 4 凝胶电泳分离酶切片与探针杂交显示的带谱。