饮用水大肠杆菌测试
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）
5.水中大肠杆菌的检测（多管发酵法）第一篇：5.水中大肠杆菌的检测(多管发酵法)水中大肠杆菌群书的监测（发酵法）一、试验目的：1.了解和学习水中大肠杆菌的测定原理和测定意义。
2.学习和掌握水中大肠杆菌的监测方法。
二、试验原理：水的微生物学的检验，特别是大肠杆菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水的标准规定饮用水中大肠杆菌群书每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水中大肠杆菌的检验方法，常用多管发酵发和滤膜法。
多管发酵发可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅用于自来水和深井水。
操作简洁快速，但不适用于杂质较多，易于阻塞滤孔的水样。
三、试验材料：1.培养基：乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基2.器材：灭菌三角瓶、无菌平皿、无菌吸管、无菌试管等。
四、试验内容第一天：1.水样的采集自来水洗将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，在开放水龙头取水流5ｍｈ，以灭菌山角瓶接水取样以备分析。
2.用发酵法检查大肠杆菌（1）生活饮用水的检验①初步发酵试验：在2个各装有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中，以无菌操作各自加水样10ｍｈ。
摇匀后，37℃培养24ｈ第二天：②平板分离：经24ｈ培养后。
特产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板（EMD培养基上），37℃培养18～24ｈ。
大肠杆菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深，挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。
第三天：③复发酵试验：将革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同一类型菌群1～3个，37℃培养24ｈ，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。
第四天：④报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管，查附录1或2，报告每升水样品中大肠菌群数（MPN）五、思考题记录试验结果，并对所测样品作出评价。
水质大肠杆菌检测标准
水质大肠杆菌检测标准
根据国家标准《自来水卫生标准》（GB 5749-2006），以下是关于水质大肠杆菌检测的标准：
1. 生活饮用水中每升水样不得检出大肠杆菌。
矿泉水、天然矿泉水、纯净水、瓶装饮用水、桶装饮用水等也适用此标准。
2. 饮用水中若发生大肠杆菌超标，应采取相应措施，进行处理和消毒后方可使用。
3. 大肠杆菌是评价饮用水卫生指标的重要细菌指标之一，它的检测结果能够反映水样是否受到了粪便污染。
4. 大肠杆菌的检测方法通常采用培养方法，通过培养样品中的大肠杆菌并观察生长情况来判断水样是否存在细菌。
5. 大肠杆菌的检测应严格遵循操作规程，确保结果的准确性和可靠性。
除了以上国家标准，不同地区和国家可能有不同的水质大肠杆菌检测标准，具体的标准应根据当地的相关法规和标准来执行。
纯净水大肠杆菌检测方法
纯净水大肠杆菌检测方法纯净水是一种用于饮用和工业用途的水，在生产和配送过程中，可能会暴露于各种潜在的微生物污染源，其中包括大肠杆菌。
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，它可以被用来作为环境卫生和水质卫生的指标微生物。
因此，检测纯净水中的大肠杆菌含量是必要的，以确保水质符合国家标准和消费者的安全需求。
纯净水大肠杆菌检测方法包括传统培养和分子生物学技术两种方法。
下面将详细介绍这两种方法的原理和应用。
1. 传统培养法传统培养法是一种基于培养大肠杆菌菌落的定量和质量检测方法。
该方法是最常用的水质检测方法之一，可以检测出细菌数量较低的水样品，并且相对简单易行，分析成本较低。
传统培养法的原理是将样品接种到肉汤或营养琼脂培养基中，然后在恰当的条件下孵育，使大肠杆菌繁殖形成典型的圆形、平坦、有光泽、直径约为2mm的蓝色或暗紫色菌落，最终通过计数菌落的数量来确定样品中大肠杆菌的含量。
该方法的优势在于其简单、直观、可重复，并且可以根据环境状况进行某些微生物特定测试。
但是，此测试方法需要培养菌落，所以需要较长时间，必须在8-24小时内进行读数，这可能会影响检测的准确性和效率，尤其是当仅检测少量样品时。
2. 分子生物学技术分子生物学技术是一种基于DNA分析的方法，可以检测到细胞和病毒等微生物的DNA序列。
作为一种新型的检测技术，分子生物学技术的优点在于其高灵敏度、快速性和精确性，它可以解决传统培养法缺点，提高检测灵敏度和准确性。
此外，分子生物学技术还有助于检测未能在传统培养法中检测到的微生物。
分子生物学技术主要包括聚合酶链式反应（PCR）、即时PCR、荧光定量PCR、基因芯片技术等，这些方法可以测量纯净水中微生物或微生物DNA的含量，从而确定大肠杆菌是存在于样品中，其数量的多寡、菌株的种类和亚型、具体DNA 分布等相关信息。
此外，为了提高检测的准确性，还可以使用核苷酸序列分析、基因测序等进一步验证检测结果。
总结在纯净水生产和配送前，进行大肠杆菌检测是必要的。
实验 水中细菌总数的测定 水中大肠杆菌的测定
实验2 水中大肠菌群数的测定一、目的要求1．了解大肠菌群数量在引用水中的重要性2．学习掌握多管发酵法和滤膜法测定大肠菌群数二、原理若水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容易死亡与变异，因此数量较少，要从中特别是自来水中分离出病原菌常较困难与费时，这样就要找到一个合适的指示菌，此指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。
若指示菌在水中不存在或数量很少，则大多数情况也保证没有病原菌。
最广泛应用的指示菌是大肠菌群，它的定义是：一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖培养基中，经37ºC、24～48h培养能产酸产气，根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得检出；若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得超过10000个。
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤膜法两种。
多管发酵法使用历史较久，又称水的标准分析方法，为我国大多数卫生单位与水厂所采用；滤膜法是一种快速的替代方法，而且结果重复性好，又能测定大体积的水样，目前国内已有很多大城市的水厂采用此法。
三、实验仪器和材料1．锥形瓶（500 ml）、试管（18 mm×180 mm）、大试管（容积150 ml）、移液管1 ml 及10ml、培养皿（直径90 mm）、接种环、试管架1个。
2．革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液3．显微镜4．自来水（或受粪便污染的河、湖水）400ml5．蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂、无水亚硫酸钠、牛肉膏、氯化钠、1.6％溴甲酚紫乙醇溶液、5％碱性品红乙醇溶液、2％伊红水溶液、0.5％美蓝水溶液。
6．10％NaOH、10％HCl、精密pH试纸6.4～8.4。
大肠杆菌检测实验报告
大肠杆菌检测实验报告一、实验目的掌握大肠杆菌的检测方法，了解其在水质检验中的重要性。
二、实验原理1. 大肠杆菌大肠杆菌是一种常见的肠道杆菌，是一类嗜热性、厌氧性以及革兰阴性杆菌。
该菌种常常是肠道菌群的组成部分，同时也是水污染的重要指示菌之一。
（1）标准培养基法经过富营养培养基的生长，大肠杆菌会形成显性和隐性的群体。
这种检测方法适用于水质样本、地球样品以及饮用水。
（2）膜过滤法样品通过过滤器滤过后，将过滤后的膜放入培养基上培养。
这种方法既适合于生物质量较小的样品，也适用于分析浓度高的样品。
（3）MPN法通过使用3组不同浓度的小管，并观察哪个浓度的小管有生长曲线的所有格子都被满足，来计算菌落形成单位的浓度。
可以适用于样品浓度较低的环境。
三、实验操作1. 实验材料大肠杆菌标准菌株、优化阳性对照菌株、培养基、蒸馏水、实验器材、滤纸、吸管、离心机、洗涤液和细胞硬度试剂。
2. 实验步骤（1）制备纯菌液：将大肠杆菌基配合缓冲液跳接种到营养琼脂平板上，并在37℃的恒温培养箱中培养过夜。
将菌落划入脱色水中，通过洗涤和离心的方式，获得纯化的细胞菌悬液。
（2）制备样品：将需要检测的水样分别过滤，过滤膜使用巨孔滤纸。
滤膜被慢慢放在脱色水上U型板中间的孔里，然后浸泡（3）培养过程: 将U型板接入温度为37℃的有氧培养箱内，在24 - 48小时内观察细菌进行生长，并做出相应的计数和检测。
四、实验结果与分析按照实验操作规程进行样品处理和培养后，确认样品中是否存在大肠杆菌。
如果在实验中产生的试样中出现了大肠杆菌生长，且其生长优于阳性对照；或者在某些水样中不能检测出大肠杆菌，说明该水质品质不满足相关规范的要求。
五、实验结论本实验通过不同的大肠杆菌检测方法，较为全面地了解了大肠杆菌的检测方法及其在水质检验中的重要性。
在实验的基础上，我们有理由相信，通过科学准确的操作，人们可以更好地保证饮用水的健全和安全。
饮用水大肠杆菌检测
水中总大肠杆菌的测定1 原理总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。
多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖，产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，求得水样中的总大肠菌群数，实验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。
2 仪器2.1 高压蒸汽灭菌器。
2.2 恒温培养箱，冰箱。
2.3 生物显微镜，载玻片。
2.4 酒精灯，镍铬丝接种棒。
2.5 培养皿(直径100mm)，试管(5×150mm)，小倒管，吸管(1，5，10ml)，烧杯(200，500，2000ml)，锥形瓶(500，1000ml)，采样瓶。
3 培养基及染色剂的制备3.1 乳糖蛋白胨培养液：将10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化钠加热溶于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于试管（内有倒管）中，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，贮存于冷暗处备用。
3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。
除蒸馏水外，各组分用量增加至三倍。
3.3 品红亚硫酸钠培养基3.3.1 贮备培养基的制备于2000mL烧杯中，先将20-30g琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充到1000mL调节溶液pH至7.2-7.4。
趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加10g乳糖，混匀，定量分装于250或500mL锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存与冷暗处备用。
3.3.2 平皿培养基的制备将上法制备的贮备培养基加热融化。
根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1：50比例吸取5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中；再按1：200比例称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（灭菌）。
对生活饮用水细菌总数、总大肠菌群的检测
POPULAR SCIENCE大众科普近年来，上海建科检验微生物实验室参加了由中国国家认证认可监督管理委员会组织的、中国检验检疫科学研究院测试评价中心负责实施的饮用水中微生物的检测能力验证。
能力验证是指利用实验室间比对来确定实验室检测/校准能力的活动，它是确保实验室维持较高的校准和检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动[1]。
为了提高生活饮用水细菌总数检测和总大肠菌群生化鉴别水平，并顺利通过国家组织的能力验证考核，上海建科检验微生物实验室从“人、机、料、法、环、测”几个方面，制定了一份全新的符合检测项目考核的实施方案，并最终顺利通过了能力验证考核。
本文就如何提高生活饮用水细菌总数检测和总大肠菌群生化鉴别水平，制定特殊方案，以及解决能力验证考核过程中遇到的难点。
1 细菌总数和总大肠菌群检测方案1.1 明确岗位职责（1）在检测项目考核前，对仪器设备做好调试，确保状态稳定。
（2）在检测项目考核过程中，时刻做好自身安全的防护，检查冲眼器和冲淋器能否使用，并在试验结束后做好试验场所消杀工作。
（3）检测人员必须仔细地填写数据和原始记录，确保出具的结果准确无误。
作者简介：吴丽萍，工程师，主要研究方向为环境工程检测。
对生活饮用水细菌总数、总大肠菌群的检测吴丽萍上海建科检验有限公司，上海 201108科技视界SCIENCE & TECHNOLOGY VISION样和上述稀释度的水样1 mL 分别注入灭菌平板内，且做平行样。
倾注约12～15 mL 营养琼脂，并立即旋摇平板，使水样和培养基充分混匀。
同时，做空白对照。
在36 ℃±1 ℃的培养箱中，培养48 h [3]。
检测计数时，可用眼睛直接观察，或用放大镜检查，以防遗漏。
选择适当 稀释倍数的平板，读取菌落数量，求出同稀释度的平均菌落数[4]。
表2 生活饮用水样品中细菌总数检测实验操作（3）总大肠菌群检测实验操作（多管发酵法）[5]在做总大肠菌群检测实验操作（表3）时，先用10 mL 无菌移液管吸取待测样品到双料乳糖蛋白胨，再用1 mL 无菌移液管吸取待测液到10 mL 单料乳糖蛋白胨。
EHS-M-W-002.0生活饮用水中大肠菌群检测细则(多管发酵法)W
1适用范围及标准1.1适用于生活饮用水、水源水、游泳池水中大肠菌群的测定。
1.2技术标准GB/T 5749-2006 《生活饮用水卫生标准》GB/T 5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法微生物指标》DB 31/890-2015《公共游泳场所卫生管理规范》2检测原理2.1 总大肠菌群指一群在37 ℃、24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2 耐热大肠菌群指一群在44.5 ℃仍能生长且发酵乳糖产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.3大肠埃希氏菌是指一群能生长发酵乳糖产酸、产气且在含有荧光底物的培养基上44.5 ℃培养24 h产生β-葡萄糖醛酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3仪器和设备3.1 高压蒸汽灭菌器3.2 冰箱：2 ℃—8 ℃3.3 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃3.4 天平3.5PH试纸3.6恒温水槽：44.5 ℃3.7生物安全柜3.8紫外光灯：6W、波长366nm3.9平皿：直径为9cm3.10试管3.11刻度吸管3.12小倒管3.13 金属接种环4培养基和试剂4.1乳糖蛋白胨培养基：称取乳糖蛋白胨于蒸馏水中加热溶解，充分混匀，分装到带有倒管的试管中(每管10 mL)，115 ℃高压灭菌20min。
（注：双料乳糖蛋白胨即蒸馏水不变，乳糖蛋白胨的成分量加双份。
）4.2伊红美兰琼脂平板：称取伊红美兰琼脂，加热溶解，倾注灭菌平皿，每皿约15ml。
冷凝后，倒置4℃冰箱保存，待用。
4.3革兰氏染色液（染色方法见试剂使用说明书）4.4EC培养基：称取EC培养基干粉，加热溶解，调PH为6.9±0.2，分装到带有倒管的试管中(每管10ml)，121 ℃高压灭菌20 min，备用。
4.510 %（m/m）硫代硫酸钠溶液：121 ℃高压灭菌20 min。
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多管发酵法测大肠杆菌群
一、实验目的
1、学习测定水中大肠杆菌群数量的国标测试法（主要为多管发酵法）
2、了解大肠杆菌群的数量在水中的重要性
二、实验原理
我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中关于生活饮用水的细菌标准具体规定如下：
1、细菌总数1ml水中不超过100个。
2、大肠杆菌数1L水中不超过3个。
3、若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过1000
个；经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用水的水源水，大肠杆菌群数平均每升不得超过10000个。
多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN 来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
三、适用范围：
大肠菌群系指一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
通常用此法作为粪便污染指标来评价食品以及饮用水的卫生质量。
四、检验程序：
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→→
→→
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五、操作方法：
5.1 以无菌操作，将检样10ml被测液放于含有90ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭
菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
5.2 用1ml 灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水
或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均
（均液的PH值应在6.5～７.5之间，必要时分别用1mol/L 匀，做成1：100的稀释液。
氢氧化钠（NaoH）或(1mol/L)盐酸（HCL）调节。
5.3 另取1ml 灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，
即换用1支1ml灭菌吸管。
5.4 根据食品卫生标准要求或对检污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接
种3管。
5.5初发酵（扩大）（推测试验）：将待检样品接种于月桂基硫盐胰蛋白胨发酵管内，接
种量在1ml，每一稀释度接种3管，置36±1℃文箱内培养24±2h，观察倒管内是
否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h.记录在24h和48h内产气的LST
肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
2、平皿分离（分离）（证实试验）
（1）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。
（2）将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 ºC培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。
5.6 复发酵试验(完成实验
用按种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于
BGLB肉汤管中，36±1℃培养48h±2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳
性管。
5.7 报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表（见GB/T4789.3附表B），
报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
五、保证措施
（1）要保证水样在采集、运输、保存过程中不受污染。
（2）实验过程中所用的玻璃仪器均要灭菌。
（3）带菌培养基应在灭菌后再弃去，其他均遵守实验室安全制度。
（4）检验开始前要充分摇匀混合水样，这样可以确保细菌在水样中均匀分布，以保证自来水大肠杆菌数量的准确性，这对检验结果的真实性是十分重要的。
六、实验流程图
一、为什么不可以直接测试饮用水中大肠杆菌的数目？
直接测试由于数量较少，无法准确测量，会造成测量结果误差偏大，培养之后，我们可以根据培养时间和菌群数量来计算初始的菌种数量，这样可以得到更准确的检测结果。
二、检测大肠杆菌有三种方法，为什么要选用多管发酵法？ 多管发酵法 滤膜法 酶底物法 时间 24-72h 24-48h 24-28h 验证试验 需要 需要 不需要 步骤 较繁 较简便
简便 特殊设备
显微镜
显微镜、过滤设备
压膜机
各3支
3x
1x
1x
1x
1支
10ml x 100 1ml x 100
1ml x 10-1
1ml x 10-2
三、扩大培养时为什么要选择LST（月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基）而不选择一直以来应用的乳糖蛋白胨培养基？
LST比后者要灵敏得多，比胆盐稳定性好，抑制G阳性菌生长，易观察结果，对损伤菌有修复作用，检出率提高，乳糖发酵培养基基本上不具备修复已损伤的细胞的作用,而月桂基硫酸盐胰蛋白胨则可以,因此,后者较前者检出的概率也会大很多.
四、革兰氏染色的原理？
革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。
革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。
当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。
而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。
五、检测大肠杆菌时为什么会出现假阳性？
因为能产酸产气的不仅仅只有大肠菌群，例如沙门菌的部分也产酸产气。
六、培养基的存放问题？
在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。