EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析解析

•表1 FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较
FISH
IHC
（- ） 6
19 20
（1+） 5
5 10
（2+） 2
1 3
（3+） 2
0 2
合计
（+）
（-） 合计
15
25 40
40例NSCLC标本中，FISH显示为阳性的15例，其中IHC检测EGFR表达为（—）的6例 （40%），阳性的9例（60%）；FISH显示为阴性的25例，其中IHC检测EGFR表达为 （—）的19例（76%），阳性的6例（24%）。 IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无统计学意义（x2=5.184，P＞0.05）。
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材料
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标本来源：广州医科大学第一附属医院2010 年1月～2011年1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病 例，其中男性21例，女性19例；年龄30～85岁， 中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马 林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行连续切片 ，同时行FISH检测与免疫组化检测。
主要试剂与仪器
讨论
• FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标 本受影响较少，可以定量判读结果。 IHC法是临床常用的EGFR蛋白表达的方法。该方法操 作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内 检测EGFR蛋白表达的主要方法。但IHC法在标本固定和处 理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假 阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组 化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的 差异而导致结果差异，不同抗体可使结果范围从12％变至 14％[4]。
统计学处理
• 采用SPSS 17.0统计软件进行描述性分析。 • FISH技术与IHC法检测结果的比较使用x2检验。
结果 FISH
图1.EGFR FISH（+） （高多体） 图2.EGFR FISH（+） （点簇状 ）
图3.EGFR FISH（-）
结果 IHC
+++
++
+
-
Байду номын сангаас 结果
• FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较见表1。
FISH阴性：Ratio＜2为无扩增。
结果判断
• （2）IHC结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞 百分率和阳性染色程度评价。 • 着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分；6～25%阳性细胞为 1分；26～50%阳性细胞为2分；＞50%阳性细胞为3分。 • 再结合染色强度，无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕 褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分 相乘，为其最后得分。 • 同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。 0～1分为阴性（－），2～3分为弱阳性（1+）， 4～6分为中等阳性（2+），6分以上为强阳性（3+）。
室温下2×SSC中漂洗2次， 每次5min
在组织上滴加蛋白酶K工作液，在 37℃预热的孵育盒中消化3～5min
第二天46℃水浴箱中2×SSC10min， 0.1%NP40溶液洗涤5min，室温70% 乙醇3min 暗处自然干燥玻片后加DAPI复染 液，放于暗盒中复染5min
Olympus BX51型荧光显微镜在 DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激 发下观察间期细胞荧光杂交信号
讨论
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综上所述，免疫组化法对于评价患者是否 使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手 段，但可作为筛选检查。
参考文献
• [1] Reiter J L, T hreadgill D W, Eley G D, et al. Comparat ivegenomic sequence analysis and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR transcripts encoding truncated recept or isofornls[J] . Genomics, 2001, 71(1): 1. [2］Jorissen RN,Walker F,Pouliont N,et al.Epidemal growth factor receptor ：Mechanisms of activation and signaling[J].Exp Cell Res,2003，284（1） :31. [3] Cunningham D, Humblet Y, S iena S, et al . Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer [J] . N Engl J Med , 2004, 351( 14) :337- 345. [4]Buckley AF。Kakar s．comparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed EGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinoma[J] ．Appllmmunohistochem Mol Mor_phol，2007，15(3)：305—309． [5]周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功. 非小细胞肺癌耘郧云砸基因 和蛋白检测的比较分析[J]. 临床与实验病理学杂志，2012,28（10）：1124-1132. [6]刘艳辉.乳腺癌组织HER-2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价[J].循证医学 ，2006，6(2)：81-83.
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蛋白酶 K，探针：GLP EGFR/CSP7探针（北京 金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗EGFR单克 隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。Dako 杂交仪、观察用 Olympus BX51型显微镜和Nikon H600L荧光显微镜。
检测方法
• （1）FISH检测：
3μm组织切片TO脱蜡至水 煮沸去离子水处理15min 在温度80℃的自动杂交仪中变性 5 min，42℃杂交16小时 避光环境中，探针混合液滴于玻 片杂交区域
讨论
表2.2963 例乳腺癌HER-2 的IHC和FISH检测结果比较
以 FISH作为标准IHC 与之比较，其阳性预测值在IHC阳性(+++以上)标本中为 91.6%，阴性预测值在 IHC 阴性(0或+)标本中为97.2%，在IHC弱阳性和阳性(0或 +)标本中其敏感性为92.6%，在IHC阳性标本中其敏感性为98.8%[6]。
EGFR荧光原位杂交与免疫组化检 测的比较分析
广州医科大学附属第一医院 林毅妍 病理科
前言
• 近年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在 非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可以为分子靶向药 物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以 及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中， 对EGFR基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂 交（FISH）技术、免疫组化（IHC）检测技术、PCR扩增检 测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进 行比较分析。
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讨论
• 以FISH为标准，IHC与之比较： • 2例IHC法强阳性（3+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增均为阳 性，阳性预测值为100%； • 3例IHC中等阳性（2+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阳性为 2例，阳性预测值为66.67% ； • 10例IHC弱阳性标本（1+），FISH检测EGFR基因扩增阳性为5例 ，阴性预测值为50%； • 25例IHC阴性（-）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阴性为19例 ，阴性预测值为76%。 • 总体而言，两种方法的符合率较低。但其中IHC法EGFR表达（ 3+）及（2+）的标本，尤以强阳性（3+）标本与FISH检测EGFR 基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同[5]，但该类 标本例数较少，仅占总例数的12.5%，其一致性是否可靠需要 进一步验证。
讨论
• 表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位 于第7号染色体p13～22区, 全长200kb, 由28个外显子组成， 编码1186个氨基酸[1] ,广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内 胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR 的异常高表达可 见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子, 引起细胞的 增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤 进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用[2]。 EGFR酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活EGFR的酪氨酸激酶活性，从 而阻断EGFR的功能，阻碍肿瘤的发生发展[3]。多数文献提示， 分子靶向治疗晚期NSCLC疗效明显，而且治疗明显的患者中， EGFR基因突变的发生率明显高于治疗无效的患者，EGFR基因检 测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在NSCLC 个性化治疗过程中提供重要信息。
室温下用2×SSC溶液中洗涤2次，每 次5min，乙醇梯度脱水，自然干燥
检测方法
• （2）IHC检测：
3μm组织涂胶片，57℃烤片过夜， 浸于二甲苯中脱蜡至水
在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在 37℃预热的孵育盒中消化30min
采用EnVision二步法， 严格按照说明书操作
结果判断
• （1）FISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色 信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数 100个细胞，统计Ratio值（100个细胞核中红色信号数 /100个细胞核中绿色信号数）。 FISH阳性分为：EGFR基因扩增： ①Ratio≥2为阳性结果； ②≥15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上； ③出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio＜2，但≥4 个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。