白色念珠菌侵染内皮细胞引发炎症反应的机制
白念珠菌粘附上皮细胞的机制
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二、 白念珠 菌侵 袭酶 （ ） 泌 型灭冬 氨酸 蛋 白酶 一 分
白念珠 菌 的 分 泌 陆天 冬 氢 酸 蛋 白 酶 （Ａ ） Ｓ Ｐ 在 １６ 被 首 次 描 述 ， 已 被 证 明 是 毒 力 的 主 要 因 ９５年 现
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白色念珠菌凋亡机制现代研究进展
白色念珠菌凋亡机制现代研究进展杨懿;宁玉梅【摘要】The apoptosis mechanism of Candida albicans was elucidated based on biological characteristics and pathogenic mechanism of Candida albicans by consulting domestic and foreign literatures to give an insight to the further study and clinical medication.%参考国内外文献,以白色念珠菌的生物学特性,致病机制为铺垫;重点阐述白色念珠茵的凋亡机制,以期在后期实验研究以及临床用药方面,能够进一步深入研究.【期刊名称】《西部中医药》【年(卷),期】2012(025)001【总页数】4页(P106-109)【关键词】白色念珠菌;凋亡机制;综述【作者】杨懿;宁玉梅【作者单位】浙江中医药大学第二临床医学院,浙江杭州,310005;浙江中医药大学附属第二医院【正文语种】中文【中图分类】R379.4白色念珠菌(candida albicans)是妇科常见致病菌，白色念珠菌性阴道病(VVC)，大约85%由白色念珠菌引起［1］。
目前临床上治疗VVC虽然疗效确切，但其感染率与复发率逐年上升，日益严重的耐药现象，也仍然困扰着临床工作者。
能否找到使白色念珠菌凋亡的方法，从而降低复发率，成为国内外学者的研究方向之一。
本文以白色念珠菌的生物学特性、发病机制作为铺垫，着重论述白色念珠菌凋亡机制的现代研究，以期为后期进一步应用中药黄连抗白色念珠菌的实验研究和临床研究提供线索。
1 白色念珠菌的生物学特性白色念珠菌的菌体为单细胞、圆形或卵圆形，直径3～6μm，革兰阳性，但着色不均。
以芽生孢子出芽繁殖，孢子生长成芽管，但不与母体脱离，形成较长的假菌丝为生长方式。
病原微生物侵袭机制及对人类健康的危害
病原微生物侵袭机制及对人类健康的危害病原微生物是引起疾病的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
它们通过一系列生物学机制侵入人体，并对人类健康造成一定的危害。
本篇回复将围绕病原微生物的侵袭机制以及对人类健康的危害进行详细阐述。
一、病原微生物的侵袭机制1. 细菌侵袭机制：细菌通过多种途径进入人体，包括通过呼吸道、消化道、生殖道和皮肤等。
它们通过黏附、侵入细胞内、分泌毒素等方式进一步侵袭人体。
例如，肺炎球菌可以通过黏附并侵入肺泡上皮细胞，导致肺炎的发生。
大肠杆菌可以通过结合并分泌毒素，引发食物中毒。
2. 病毒侵袭机制：病毒主要通过侵入寄主细胞并复制自身来侵袭人体。
它们以细胞为寄生宿主，进入人体后通过感染宿主细胞并释放病毒粒子来完成自身复制。
病毒感染后会破坏宿主细胞构造，干扰细胞内的代谢功能，并释放新生病毒继续感染其他细胞。
例如，流感病毒通过黏附并进入上呼吸道的上皮细胞，利用细胞内的机制复制并导致流感症状。
3. 真菌侵袭机制：真菌主要通过感染人体组织并生长来侵袭人体。
真菌可以利用人体组织的受损或免疫系统的下降，进一步感染宿主。
它们通过分解组织、霉菌丝的侵入，进而在体内生长。
真菌感染会导致皮肤炎症、呼吸道感染等疾病。
例如，白色念珠菌可以通过黏附并融入宿主细胞内，引发念珠菌感染。
4. 寄生虫侵袭机制：寄生虫主要通过宿主体表、饮食和空气传播等方式侵袭人体。
它们以人体内为宿主，通过分泌毒素、破坏组织、摄取寄主营养等方式侵袭人体。
寄生虫感染会造成不同的疾病，如疟疾、血吸虫病等。
例如，疟原虫可以通过感染蚊子叮咬进入人体血液，寄生在红细胞中繁殖并引起疟疾。
二、病原微生物对人类健康的危害1. 引发感染疾病：病原微生物在侵袭人体后，会引发一系列感染症状，如发热、咳嗽、腹泻、皮疹等。
不同的病原微生物会导致不同类型的感染疾病，包括肺炎、流感、腹泻等。
这些感染疾病会造成人体免疫系统的负担，严重的情况下可能危及生命。
2. 毒素产生：某些病原微生物能够分泌毒素，如大肠杆菌产生的肠毒素、白喉杆菌的白喉毒素等。
杜仲抗菌肽EuCHIT1对白色念珠菌的抑菌作用及机制研究
·基础研究·杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌的抑菌作用及机制研究△赵丹１，２，张湘燕１，２，罗振华２，３，董旋４，赵德刚４１ 贵州省人民医院呼吸与危重症医学科／贵州省呼吸疾病研究所，贵州 贵阳 ５５０００２；２ 肺脏免疫性疾病诊治国家卫健委重点实验室，贵州 贵阳 ５５０００２；３ 贵州省人民医院中心实验室，贵州 贵阳 ５５０００２；４ 贵州大学生物工程研究院／贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 ５５０００２［摘要］ 目的：研究杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌的抗菌活性及机制。
方法：通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增ＥｕＣＨＩＴ１蛋白的编码区，构建原核表达质粒并转化到大肠杆菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３），经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，采用镍亲和色谱法纯化得到可溶性的ＥｕＣＨＩＴ１；采用二倍最小抑菌浓度（ＭＩＣ）法稀释ＥｕＣＨＩＴ１并测定其对白色念珠菌的抑菌圈直径；采用荧光分光光度计和酶标仪分别检测ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌细胞膜的去极化作用及对细胞膜通透性的影响；通过鲎试验动态浊度法和高效液相色谱法分别测定白色念珠菌中（１，３） β Ｄ 葡聚糖和麦角甾醇含量；酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌感染的ＳＤ大鼠肺上皮ＷＴＲＬ１细胞中白细胞介素 １β（ＩＬ １β）、ＩＬ ６及肿瘤坏死因子 α（ＴＮＦ α）表达的影响。
结果：纯化得到的杜仲抗菌肽ＥｕＣＨＩＴ１相对分子质量为７７２１０，对白色念珠菌ＭＩＣ值为３２μｇ·ｍＬ－１，ＥｕＣＨＩＴ１质量浓度与抑菌活性之间具有量效关系；ＥｕＣＨＩＴ１可增加白色念珠菌细胞壁的去极化及通透性，降低白色念珠菌细胞壁（１，３） β Ｄ 葡聚糖及麦角甾醇的含量，同时ＥｕＣＨＩＴ１可降低白色念珠菌感染的ＷＴＲＬ１细胞中ＩＬ ６及ＴＮＦ α水平（Ｐ＜０ ０５）。
结论：ＥｕＣＨＩＴ１对白色念珠菌具有抑菌作用，主要机制可能是破坏细胞壁，导致细胞膜去极化、通透性增加，并降低白色念珠菌感染的肺上皮细胞ＩＬ ６及ＴＮＦ α水平。
病原微生物致病机理及其对人类的危害
病原微生物致病机理及其对人类的危害病原微生物是一类能够引起传染病的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
这些微生物通过不同的途径进入人体，通过特定的致病机理引起疾病。
研究病原微生物的致病机理对于预防和控制传染病至关重要。
不同的病原微生物具有不同的致病机理，下面将对几种常见的病原微生物及其对人类的危害进行介绍。
1. 细菌：细菌致病机理主要包括分泌毒素、侵袭性和激活宿主免疫系统。
分泌的毒素可直接损害人体细胞，并引起感染部位的炎症反应。
例如，葡萄球菌产生的肺炎腺毒素可导致严重的肺损伤，引起肺炎。
细菌还能通过侵袭宿主细胞或组织来造成感染。
例如，大肠杆菌通过结肠黏膜附着并侵入宿主细胞，引发腹泻。
某些细菌还能激活宿主免疫系统的炎症反应，引起发热等全身症状。
2. 病毒：病毒依赖宿主细胞进行繁殖，它们通过侵入人体细胞并改变宿主细胞代谢来引起感染。
病毒进入宿主细胞后，其遗传物质（RNA或DNA）会被复制和转录，在细胞内进行繁殖，最终导致细胞的破裂和死亡。
病毒感染会引起细胞和组织的破坏，导致一系列的疾病。
例如，流感病毒感染呼吸道上皮细胞后，引起上呼吸道感染的症状，包括咳嗽、流涕和发热。
肝炎病毒感染肝细胞会导致肝炎。
3. 真菌：真菌是一类寄生性微生物，常见的包括念珠菌、白色念珠菌和皮肤真菌等。
真菌感染多发生在人体的皮肤、头发和指甲等部位。
真菌通过侵入宿主细胞、产生毒素和引发宿主免疫反应等方式引起疾病。
例如，白色念珠菌感染常引起阴道炎，外阴瘙痒等症状。
某些真菌还会释放出毒素，损害宿主组织，导致疾病的发生。
4. 寄生虫：寄生虫是一类依赖寄主生活的生物体，包括原生动物和多细胞动物。
寄生虫感染通常通过摄取被寄生虫卵污染的食物、饮水或皮肤接触等途径进行传播。
寄生虫比较复杂，它们通过对宿主的侵入、吸食宿主组织、破坏宿主免疫系统等方式引起疾病。
例如，疟原虫通过蚊子的叮咬进入人体，寄生于红细胞内，引起疟疾的发作。
病原微生物对人类的危害主要体现在以下几个方面：1. 引起疾病：病原微生物通过侵入宿主细胞和组织，破坏宿主的正常生理功能，引发一系列的疾病，如肺炎、流感、肝炎、阴道炎等。
念珠菌病
复发性外阴阴道念珠菌病
二、临床表现——黏膜念珠菌病
（三）念珠菌性包皮龟头炎（candidal balanoposthitis） 1.好发人群 包皮过长或包茎的男性。 2.传播途径 接触传播。 3.典型皮损及症状 （1）包皮内侧及龟头弥漫性潮红，附着乳 白色斑片，可有多发性针帽大的红色小丘疹。 （2）自觉瘙痒或无明显自觉症状。
二、临床表现——黏膜念珠菌病
（二）外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis） 1.好发人群 育龄期妇女。 2.传播途径 接触传播。 3.典型皮损及症状 （1）外阴及阴道黏膜红肿，白带增多，呈豆渣样、 凝乳块状或水样，带有腥臭味。 （2）自觉瘙痒剧烈或灼痛。 （3）部分患者可反复发作，妊娠、糖尿病、长期 应用广谱抗生素等是复发的主要原因。
四、治疗及预防
治疗原则：祛除诱发因素、积极治疗基础疾病，必要时给予支持疗法。 1.外用药物治疗 主要用于皮肤黏膜浅部感染。 口腔念珠菌病：可外用1%～3%克霉唑液、制霉菌素溶液或1%～2%甲紫溶液。 皮肤间擦疹和念珠菌性龟头炎：可外用抗真菌溶液或霜剂。 阴道念珠菌病：制霉菌素、克霉唑或咪康唑栓剂。
（二）发病机制
皮肤黏膜屏障作用↓ 长期、滥用药物
内分泌紊乱 免疫功能↓
一、病因及发病机制
宿主因素 真菌毒力
条件致病菌 念珠菌感染
念珠菌病
二、临床表现
皮肤念珠菌病 黏膜念珠菌病 系统念珠菌病
念珠菌性间擦疹 念珠菌性甲沟炎 其他皮肤念珠菌病 口腔念珠菌病及口角炎 外阴阴道念珠菌病 念珠菌性包皮龟头炎
二、临床表现——皮肤念珠菌病
（一）念珠菌性间擦疹（candidal intertrigo） 1.好发人群 婴幼儿、肥胖多汗者和糖尿病。 2.好发部位 腹股沟、会阴、腋窝、乳房下等皱 褶部位。 3.典型皮损及症状 （1）局部潮红、浸渍、糜烂，界限清楚，边缘附 着鳞屑，外周常有散在炎性丘疹、丘疱疹及脓疱。 （2）自觉瘙痒或疼痛。
痰培养有念珠菌，临床医生千万不要这么做！
痰培养有念珠菌，临床医生千万不要这么做！肺念珠菌病是念珠菌属引起的急性、亚急性或慢性支气管、肺部感染。
在肺部真菌感染中较为常见，多为院内感染。
病原主要为白色念珠菌，其次为热带念珠菌、高里氏念珠菌和星状念珠菌。
据报道，念珠菌感染占真菌感染的79%，尤其在重症监护室、灼伤和肿瘤科发病率较高。
| 肺念珠菌病的原因 |(一)发病原因迄今为止，已发现有270余种念珠菌，其中引起人类致病的念珠菌主要有白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropical)、假热带念珠菌(C.pseudotropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、克柔念珠菌(C.kruseii)、星形念珠菌(C.stellatoidea)、光滑念珠菌(C.glabrata)、高里念珠菌(C.guilliermondii)，均为条件致病菌，其中以白色念珠菌毒力最强，也最常见。
念珠菌在普通培养基上生长较快，为椭圆形芽生细胞，在特殊培养基上形成菌丝。
菌种的鉴别需依靠生化试验。
念珠菌的致病力与菌体形态和黏附能力有关，酵母型一般不致病，菌丝型有致病性。
黏附力强的念珠菌致病力亦强。
某些念珠菌能分泌毒素和水解酶，破坏组织。
正常人皮肤、口腔、胃肠道等均有念珠菌寄生，正常情况下不致病，当人体免疫防御功能下降，寄殖于口腔、上呼吸道的念珠菌可侵入呼吸道引起内源性感染。
饮食不洁，院内交叉感染可致外源性感染。
留置导管、黏膜溃疡等破坏黏膜完整性，也可使念珠菌侵入体内。
肺可为原发性感染，也可为血源播散性念珠菌的一部分。
(二)发病机制支气管肺念珠菌病的感染途径主要为吸入(原发)，即定植于口腔和上呼吸道的念珠菌在机体防御机制削弱时吸至下呼吸道和肺泡所致。
念珠菌入侵组织后转为菌丝型，大量繁殖，菌丝念珠菌有抗吞噬能力，引起白细胞浸润为主的急性炎症反应，形成溃疡、多发性微小脓肿和组织坏死。
慢性感染则以肉芽肿病变和纤维组织增生为主。
血源播散型则是菌丝和酵母向血管内侵入，引起双肺弥漫性损害，典型表现为坏死的肺组织和大量繁殖的念珠菌组成的出血性结节。
病原微生物病理机制
病原微生物病理机制病原微生物是指那些能够引发疾病的微生物，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等。
这些微生物在人体内引发感染，具有一定的病理机制。
本文将从细菌、病毒、真菌和寄生虫四个方面，介绍病原微生物引起疾病的机制。
一、细菌细菌是一类单细胞的原核生物，具有细胞壁和细胞膜。
它们通过不同的机制引发疾病，包括：1. 感染性破坏机制：某些细菌通过直接侵袭受体细胞，引发细胞破坏和组织损伤，如金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染。
2. 毒素产生机制：很多细菌在感染过程中释放毒素，直接损伤宿主细胞或刺激免疫反应，如白喉杆菌产生的白喉毒素引起的白喉病。
3. 免疫抑制机制：一些细菌通过酶的产生、调控宿主的免疫系统，抑制宿主的免疫功能，从而使宿主更易感染其他病原微生物，如结核分枝杆菌抑制巨噬细胞的活性，降低宿主对其他感染的抵抗能力。
二、病毒病毒是一种非细胞的微生物，它通过寄生于宿主细胞复制繁殖。
病毒的病理机制包括：1. 细胞感染机制：病毒侵入宿主细胞后，利用细胞内的资源复制自身，造成细胞损伤甚至死亡，如流感病毒感染呼吸道上皮细胞。
2. 免疫抑制机制：某些病毒感染后可以影响宿主的免疫系统，抑制宿主的抗病毒反应，如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染后破坏宿主的免疫系统，导致免疫功能低下。
3. 疫苗逃逸机制：病毒通过发生基因变异，改变抗原性，逃避宿主的免疫攻击，如流感病毒的变异导致疫苗的失效。
三、真菌真菌是一类含有真核细胞结构的微生物，它们引发疾病的机制主要包括：1. 侵袭性生长机制：真菌通过侵袭并破坏宿主的组织结构，引发组织炎症反应，如白色念珠菌引起的口腔念珠菌病。
2. 毒素产生机制：某些真菌产生毒素，直接损伤宿主细胞，引发组织损伤和炎症反应，如毒性变形菌素引起的真菌中毒。
3. 过敏反应机制：真菌可以产生过敏原，在一些个体中引发过敏反应，如支原体引起的支气管哮喘。
四、寄生虫寄生虫是一类以宿主为寄生对象的微生物，引发疾病的机制主要包括：1. 组织损伤机制：寄生虫通过侵袭宿主的组织和器官，破坏宿主的组织结构，导致组织损伤和炎症反应，如疟原虫引起的疟疾。
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白色念珠菌侵染内皮细胞引发炎症反应的机制摘要：内皮细胞可以通过宿主炎症反应对抵制血液传播微生物病原菌产生重要的影响。
之前，我们发现内皮细胞对体外侵染白色念珠菌通过分泌白细胞介素8（IL-8），表达选择蛋白、细胞间附生分子1（ICAM-1）、血管附生分子1（VCAM-1）。
我们确定白色念珠菌刺激内皮细胞合成瘤坏疽因子a（TNF-a），他能通过自分泌机制依次诱导那些侵染细胞分泌IL-8和表达选择蛋白。
VCAM-1的表达不仅受到TNF-a的调节，还有IL-1a和IL-1B的作用，所有这些内皮细胞合成的物质都是对白色念珠菌的回应。
这三类细胞活素保持主要的细胞关联而不是被隐藏。
ICAM-1表达的白色念珠球菌的感应与TNF-a 、IL-1a和IL-1B是独立的这些都证明了内皮细胞对白色念珠菌的不同的炎症反应是通过截然不同的机制导致的。
对这些机制的一个很重要的的认知就是内皮细胞对白色念珠菌反应的治疗缓解或是对其他引起造血传播的机会致病菌的治疗。
白色念珠菌是一种造血传播的条件致病菌，能在病人体内导致严重的侵染。
大多数的有这种病原菌侵染危险的病人包括嗜中性白血球减少症的癌症患者，出生重量较低的婴儿，以及那些近期做过腹内手术或静脉导管的个人。
内在的中心静脉导管的作用和光谱抗生素的治疗是这种病原菌侵染额外的危险因素。
随着医药技术发展的结果，造血传播的念珠菌病危险的人近几年增长很快，念珠菌属是现在从临床病人血液中分离的第四种常见的有机体。
尽管抗真菌治疗不断发展，造血传播的念珠菌病的必死性仍约为38%。
因为这种不能接受的高的致死率，预防和治疗这种侵染的新的方法需要加快发展。
一种潜在的策略是能够提高宿主对这种侵入软组织之前，处在血管间隔时能发生血液传染的病原菌的炎症反应。
据此，我们观察了白色念珠菌对内皮细胞侵入的体外实验。
根据别人及我们自己的研究，导致造血性传播的白色念珠菌侵染的模型得到了发展。
首先进入了血液的有机体黏附在脉管系统的内皮细胞的细胞衬里。
内皮细胞和白色念珠菌的这种直接接触特别可能发生在中性粒细胞减少或中性粒细胞功能不全患者。
依附的有机体然后通过导致他们自己的吞噬作用击穿内皮细胞。
吞噬作用的诱导要求完整的内皮细胞的细胞微丝和微管，它不要求有机体血清组分的调理作用。
一旦在内皮细胞的细胞里面，有机体有可能伤害和最终杀害这些细胞和从而获得的深组织。
内皮细胞损伤也可能导致内皮下的细胞矩阵的暴露，可以绑定其他生物。
我们发现血管内皮细胞不是被动的在这处理，而是通过白细胞黏附分子的表达积极回应念珠菌的入侵，例如，细胞间粘附表示的白细胞粘附分子分子 1 (ICAM-1) ,E-选择蛋白和血管细胞黏附分子 1 (VCAM-1)。
对白色念珠菌的回应，内皮细胞还分泌白细胞介素6(IL-6), IL-8、单核细胞趋化蛋白1 与前列腺素。
这些炎性介质可能提高活性血管入侵白细胞的补充，他们能够帮助宿主防御。
如果存在足够数量的功能白细胞，入侵的有机体可以被杀死和感染可以被中止。
因为内皮细胞对白色念珠菌的回应可能是对有机体炎症反应的数量和组成的测定很重要，我们检测白色念珠菌刺激内皮细胞分泌IL-8和ICAM-1,E-选择蛋白与VCAM-1表达。
我们当前的结果表明这个有机体通过不相连的机制刺激各个不同的炎症调节子的合成。
调解这些响应的机制是不同的那些调解其他微生物对血管内皮细胞的反应病原体如巨细胞病毒、立克次氏体。
这种信号转导机制的多样性可能提供内皮细胞的细胞以重要能力根据传染的有机体选择性地调整激动的反应。
材料和方法有机体：白色念珠菌ATCC36082,一个临床分离菌株,是从美国文化收集库获得.一个萌发缺陷型白色念珠菌菌株V6 ,由Helen Buckley提供。
所有的有机体都生长在25℃的酵母氮基础鱼汤另外还加有0.5%（质量/体积）的葡萄糖的培养基中摇床过夜培养。
通过离心收集芽生孢子并用磷酸盐缓冲液冲洗两遍.冲洗得到的生物体用计数板计数。
白色念珠菌36082的3×106个/ml芽生孢子接种到RPMI1640培养基置于37℃的摇床上孵化90min用于准备被杀死的、发芽的生物。
超过90%的生物体在这种条件都会产生萌发管。
萌发的生物体之后暴露于室温条件下20mM的高碘酸钠溶液30min以杀死生物体。
用之前加入到内皮细胞的磷酸缓冲液冲洗。
部分的生物体注射葡萄糖以证明所有的生物体都已被杀死。
我们之前的结论表明用这种方法杀死的白色念珠菌细胞被内皮细胞所吞噬。
内皮细胞：通过Jaffe等的方法用胶原酶收获人类脐静脉内皮细胞。
他们用M-199补充10%的牛胎儿血清，10%的旧的牛血清以及2Mm的有青霉素合链霉素的谷氨酸盐的培养基培养组织生长。
细胞生长在多井的组织培养皿中，上面涂上一层纤维连接蛋白。
所有的实验都采用紧紧汇合三分之一的内皮细胞。
根据计数板计数，大约有5×104个/cm2内皮细胞在汇合的培养基表面。
所有组织的内毒素浓度和真菌培养基用鲎溶解物试验测定。
在所有培养基中内毒素的浓度都低于0.1IU/ml。
另外，内皮细胞样品中单核细胞/巨噬细胞的存在用非特异性酯酶染色测定。
准备所有的内皮细胞包括低于0.1%的这些细胞。
内皮细胞刺激：实验那天，内皮细胞上面的组织培养基吸出，并用新鲜的含有白色念珠菌的培养基重新加入。
在所有的实验中，白色念珠菌与内皮细胞的比例接近1:1.5。
所有的生长均是在含5%的CO237℃条件下孵化8h。
每组实验至少重复3次，用不同脐带上的内皮细胞。
为了确定到底是IL-1还是TNF-a是白色念珠菌刺激内皮细胞表达白细胞粘附分子或分泌IL-8,IL-1ra所必需的和用于对准TNF-a，IL-1a，或IL-1B的中和鼠单克隆抗体。
用重组的细胞活素到指定的抑制剂中的滴定实验确定每种抑制剂的浓度。
每一种抑制剂所用浓度要求能够对内皮细胞刺激产生大于95%的抑制力，通过E-选择蛋白和IL-8分泌来确定。
IL-1ra的最终浓度是300ug/ml,Mabs 是2.5ug/ml。
在MAbs的实验中同样浓度的IgG1加入到内皮细胞的控制井。
所有的抑制剂在色质之前直接加入内皮细胞和出现在培养基内持续实验的进行。
因为血小板活性因子（PAF）已经有报道能够调节内皮细胞在对一些色质发生反应时ICAM-1的表达，PAF受体拮抗剂WEB2086检测它抑制念珠菌ICAM-1表达的能力。
我们发现仅PAF不能引发内皮细胞的刺激。
因此，WEB2086的最佳浓度由它抑制10umPAF感应的血小球聚集的能力所决定。
血小板聚集的程度用Yeaman等人的方法用血小板凝集计测定。
WEB2086的浓度为50um是发现可以完全抑制PAF诱导的血小板聚集。
因此，这个浓度可以用于内皮细胞实验。
在所有的用WEB2086的实验，内皮细胞的对照组血小板暴露在相同的稀释浓度下（0.1%二甲基亚砜）。
条件培养基的准备：为了得到适宜内皮细胞和或白色念珠菌生长的培养基，采用含有6ml的组织培养基的25cm2组织培养瓶。
培养瓶中，有或者没有内皮细胞的存在，接种上1.67×106的白色念珠菌。
接种后8h，收集条件培养基，冰上冷却，之后500g离心7min，收集上清液，储存在-70℃下备用。
RT-PCR:内皮细胞细胞素和白细胞粘附分子mRNA表达用RT-PCR检测。
内皮细胞在24井组织培养皿中暴露于白色念珠菌或500ul条件培养基中8h。
在培养基被吸出和细胞被冷的平衡盐溶液冲洗掉后，总的内皮细胞RNA用异硫氰酸盐提取。
在之前的实验中，我们已经测定用这种方法只从内皮细胞而不是白色念珠菌中提取的RNA。
所有的反转录和PCR都在同样的离心管中，用10-200ng总的内皮细胞RNA。
用于扩增目的mRNA的引物列在表2.PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化已錠显色，光密度法定量。
为保证每个条件的等量的RNA被扩增，对结果规范3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的结构基因表达(表2)。
在之前的实验，每一组引物的反应条件进行优化，以便RNA输入的量和PCR产物呈线性关系。
白细胞粘附分子表达和细胞活素合成的测量：生长在96井组织培养皿中内皮细胞的E-选择蛋白，ICAM-1和VCAM-1的表面表达由Noel等人ELISA方法进行测定。
ELISAs实验中所用的Mabs见表1。
试验中监测内皮细胞分泌IL-8,细胞生长在48井的组织培养皿中。
细胞用白色念珠菌刺激之后，收集培养基，4℃下500g离心5min，去除细胞核杂质，储存在-70℃下。
之后，用ELISA检测培养基中IL-8的浓度。
关于白色念珠菌在分泌数量上的影响和内皮细胞相关的IL-1a，IL-1B和TNF-a采用内皮细胞生长在6＃的组织培养皿上测定。
随后暴露于白色念珠菌收集培养基并按照上述的IL-8实验进行。
内皮细胞之后用冰的平衡盐溶液冲洗并溶解在含有100 mM Igepal CA-630，10 mM NaN3, 和10 mM苯基氟化物的PBS溶液中。
培养基中不同细胞活素类的浓度和溶解产物用ELISA 测定。
内皮细胞损伤的衡量：在各种不同抑制剂存在的由白色念珠菌引起的内皮细胞损伤的程度采用之前所述的铬释放化验测定。
孵化时间，抑制剂的浓度，有机体与内皮细胞的比例都与内皮细胞刺激实验相同。
数据分析：内皮细胞对不同条件的反应采用多重比较的方差分析来评估。
P 值≤0.05认为是有意义的。
结果受白色念珠菌感染的内皮细胞的条件培养基对未感染的内皮细胞的影响：首先，我们观察是否是白色念珠菌刺激内皮细胞分泌IL-8和通过溶解因子表达白细胞粘附分子.这些被选为研究的免疫调节剂，因为它们可能在白色念珠菌侵染人造成造血传播的地方有助于混合化脓性肉芽肿反应。
用白色念珠菌侵染内皮细胞8h。
在孵化过程中，白色念珠菌的芽生孢子萌发并且菌丝侵入到内皮细胞当中。
在孵化期结束时，收集并保藏以上侵染内皮细胞的条件培养基。
之后加入到未侵染的内皮细胞8h。
我们发现那些侵染的内皮细胞能够生长的条件培养基，野生型的白色念珠菌刺激未侵染的内皮细胞分泌IL-8。
这种条件培养基对刺激未侵染的内皮细胞表达ICAM-1，VCAM-1或E-选择蛋白没有重要作用。
这种条件培养基只能刺激IL-8分泌当它暴露于活着的，萌发的白色念珠菌的内皮细胞中获得时。
内皮细胞暴露于活着的或是杀死的白则念珠菌的条件培养基，突变体V6都不是刺激因子。
这些发现组成了我们之前的观察：直接接触杀死的有机体和突变体不能刺激内皮细胞积累IL-8的mRNA 。
当白色念珠菌细胞生长在内皮细胞存在的单独塑料板上时，它们的生长和萌发与那些生长在内皮细胞的有机体相同，不过，当它被添加到未受感染的内皮细胞这些生物体制约诱导IL-8分泌的条件培养基。
这些发现表明内皮细胞在条件培养基中是大多数刺激因子可能的根源。