4生物分子的分离纯化-医学分子生物学讲义
生物大分子的分离与制备(共89张PPT)
2022/9/24 7
生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆8. 基因组构建9. cDNA构建
10. 筛选11. 报告基因检测12. 基因芯片
13. 基因敲除
➢ 核酸是遗传信息的携带者，在生物体中指导各种蛋 白质的合成。
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生物化学分离方法与一般的化学分离方法相比，有下列
几个特点： • 生物材料组成非常复杂。其中包括数百种甚至数千种化
合物，并且在分离过程中，这些化合物仍在发生代谢 变化，如蛋白质和核酸的水解。
有些化合物的含量极微，如激素等。 许多具有生物活性的物质一旦离开活体，很易变 变性破坏，因此常选用比较温和的条件进行制备。
• 功能或分子生物化学阶段（1950 年至今）。研究生命的本质和奥秘： 运动、神经、内分泌、生长、发育、繁殖等的分子机理 。
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生物化学研究技术方法
❖ 生物化学研究的方法：
– 观察：生命现象
– 分离：未知蛋白组分，新基因片段，新的次生代谢物。 （抽提、过 滤、离心、色谱）
立了一系列研究核酸及蛋白质相互作用的技 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子之 间相互聚集并从溶液中析出。 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热 （50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后 凝聚成油块而被除去。
医学分子生物学(MedicalMolecularBiology)
三、典型病毒基因组介绍 （一）SV40病毒（猴空泡病毒40） 基因组
晚期转录区
Ori
早期转录区
早期基因 T抗原基因 转录区 t抗原基因 VP1 SV40病毒 晚期基因 VP2 基因组 转录区 VP3 复制起始点 调控区 启动子 增强子
（二）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus , HBV）基因组
病毒衣壳二十面对称结构
包膜蛋白 包膜
核酸 核衣壳 衣壳
Schematic diagram of human immunodefiency virus（HIV）
杆状病毒衣壳为螺旋对称结构
RNA Protein subunit
烟草 mosaic 病毒
一、病毒基因组核酸的主要类型
双链DNA 单股正链DNA 双链RNA 单股负链RNA 单股正链RNA
（二）转位因子的类型及其特征
插入序列 转位因子 转座子 可转座的噬菌体
1、插入序列 （insertion sequence , IS） 特征： （1）是一类较小的没有表型效应 的转座因子，长度约700~2000bp； （2）由一个转位酶基因和两侧的 反向重复序列（inverted repeat sequence,IR）组成； （3）可双向插入靶位点，在插入 后的两侧可形成顺向重复序列 （direct repeat sequence ,DR）
4、位点特异重组系统：控制质 粒在细菌细胞内的多聚体与单体 相互转变过程。 att位点 Int酶 位点特异 Xis酶 重组系统 FIS因子 IHF因子
质粒自 身提供 宿主提供
5、质粒的不相容性：具有相同 复制起始点和分配区的两种质粒 不能共同存在于同一个细菌细胞 中，这种现象称为质粒的不相容 性。
分子生物学课程教学讲义 朱玉贤
分子生物学课程教学讲义朱玉贤第一讲序论二、现代分子生物学中的主要里程碑分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
当人们意识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物体自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然的一部分，而以生物大分子为研究对像的分子生物学就迅速成为现代社会中最具活力的科学。
从1847年Schleiden和Schwann提出\细胞学说\，证明动、植物都是由细胞组成的到今天，虽然不过短短一百多年时间，我们对生物大分子--细胞的化学组成却有了深刻的认识。
孟德尔的遗传学规律最先使人们对性状遗传产生了理性认识，而Morgan的基因学说则进一步将\性状\与\基因\相耦联，成为分子遗传学的奠基石。
Watson和Crick所提出的脱氧核糖酸双螺旋模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。
在蛋白质化学方面，继Sumner在1936年证实酶是蛋白质之后，Sanger利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。
而Kendrew和Perutz利用X 射线衍射技术解析了肌红蛋白（myoglobin）及血红蛋白（hemoglobin）的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱。
1910年，德国科学家Kossel第一个分离了腺嘌呤，胸腺嘧啶和组氨酸。
1959年，美国科学家Uchoa第一次合成了核糖核酸，实现了将基因内的遗传信息通过RNA翻译成蛋白质的过程。
同年，Kornberg实现了试管内细菌细胞中DNA的复制。
1962年，Watson（美）和Crick（英）因为在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型而与Wilkins共获Noble生理医学奖，后者通过X射线衍射证实了Watson-Crick模型。
生物工程知识：生物化学分离技术——将化学反应与生物反应分离
生物工程知识：生物化学分离技术——将化学反应与生物反应分离生物化学分离技术是生物工程领域中的一项重要技术，它主要是利用化学反应和生物反应的差异性，将它们分离开来，在工业生产、医疗诊断和实验室研究等方面都具有广泛应用。
本文将从定义、原理及应用等方面进行阐述。
一、定义生物化学分离技术是指利用化学反应和生物反应的差异性，通过对生物大分子的亲和性或特异结合性使其与矩阵固定，然后进行反应而分离出目标生物大分子的一种技术。
生物化学分离技术主要应用于蛋白质、DNA、RNA等大分子的分离纯化和鉴定。
例如利用亲和层析技术可将目标蛋白质或抗原分离出来，分子筛技术可用于分离不同分子大小的物质。
二、原理生物化学分离技术的基本原理是将目标生物大分子结合到某种固相材料上，然后洗去无关物质，最终用适当的方法使目标分子从固相材料上脱离出来。
这种固相材料可由各种的树脂、珠子、硅胶等制成。
在实践中，大约有三种不同的分离技术，分别是透析、层析和电泳。
1.透析透析是一种分离技术，它利用半透膜的选择性通透性，以分离生物大分子。
透析袋是由即使生物大分子不能通过的薄膜制成的通路，只有小分子物质能通过。
将固体物或混合物置于透析袋内后，再在外部的溶液中进行透析，小分子物质可以自由地通过袋子，而固体或混合物则停留袋中。
透析袋中的固体无法通过，而透析袋外的物质可以渗透到内部，进而使固体的浓度逐渐降低。
2.层析层析法是在特定条件下将混合物分解成各种组分的一种分离技术。
目标分子通过与矩阵固定特定性质反应，分离其他不需要的物质。
层析可以分为大小分离、离子交换、亲和层析、逆相层析、亲水层析等等。
层析技术的原理是：通过将样品负载在固定相上，使其在流体中具有特异性结合活性，在一定条件下，目标分子可与固结相结合后，被从混合物中分离出来，从而实现了混合物的组分分离。
3.电泳电泳是根据目标物质在电场中移动的原理，对物质分离的一种方法。
电泳的原理是，当置入电场中时，有电荷的生物分子即可迁移，迁移的速率会取决于类别、尺寸和形状等物理性质。
分子生物学技术
三、DNA重组与DNA克隆
在应用限制酶切割基因DNA，获得带有平（或 粘性）末端的目的DNA片段之后，与应用同一种限 制酶（或不同限制酶但可产生相同末端的）切割后， 带有相同末端的载体的DNA分子，按一定比例混合， 经过DNA退火处理，在DNA连接酶的作用下，目的 DNA片段与载体DNA连接，形成新的含有目的DNA 片段的重组体的过程，即DNA重组。
★琼脂糖电泳
用于DNA分子量的测定用 于大片段DNA的分离，精 度低，但分离范围广
★ PAGE电泳 用于小片段DNA的分析 精度非常高
第二节
DNA分析技术
一、重组DNA技术
第一节 重组DNA技术
重组DNA技术（recombinant DNA technique）：
也称基因操作，是指将一种生物的DNA片段或人工 合成的基因，通过运载体在体外重组，转移并插入到另 一生物的基因组中，使其表达新的性状或用于进一步的 深入研究。
中央而交错切割，产生互补的单链末端，这种互补的 末端很容易连接，又称为粘性末端。
如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，
产生相同的粘性末端，混合后“退火”，这两种不
同的DNA分子彼此可以交错连接，形成重组DNA
分子。
三、 限制酶的命名：
限制酶是根据被发现的原核生物而命名的。 命名原则： ①第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写； ②第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；
④有便于选择的标记基因（如抗药基因），以 便有利于选出转化细胞（带有外源基因的受体细 胞）。
常用的载体
根据克隆DNA片段大小的需要，常用的载 体有： 质粒
λ噬菌体
科斯质粒
酵母人工染色体
细菌人工染色体
（一）质粒(plasmid)
分子生物学 PPT课件
• 使细胞生物学、遗传学、发育生物学、神经 生物学和生态学由原来的经典学科变成了生命科 学的真正前沿科学，形成了一系列交叉学科，如 分子遗传学、分子生态学、分子免疫学、分子病 毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分子药理学等。 分子生物学是生命科学的核心前沿。
• 不同种属生物的表现形式多种多样和千姿百 态，但是，生命活动的本质却是高度一致的。例 如绝大多数生物遗传取决于DNA；除少数例外， 遗传密码在整个生命世界中都是一致的。又如核 酸一级结构和蛋白质一级结构的对应关系以及蛋 白质的有序合成，也表现出高度一致性。
• （五）小分子RNA研究进展
• 1993年，Lee RC等发现线虫(C.elegans) lin-4基 因编码的小分子RNA，其长度为22～61个核苷 酸——反义RNA。
• 反义RNA能与lin-14 mRNA的3ˊ非翻译区 （untranslated region，UTR）反义互补结合，阻 断lin-14的翻译，降低线虫早期发育阶段lin-14 蛋白的水平。
• 因此，分子生物学技术已成为推动生物 科学的各个领域向分子水平发展的重要 工具或手段，也是服务于人类和社会， 推动医药和工、农业发展的强大动力。
二、分子生物学的研究内容
• 分子生物学的研究内容主要包括以下三个方面。 • 1、核酸分子生物学： • 主要研究核酸的结构及其功能。 • 2、蛋白质分子生物学：
• 例如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子杂 交、DNA克隆或重组DNA、基因体外扩增、 DNA 测序等等，以及研究蛋白质一级结构、 二级结构和三维结构与功能的分析技术。
• 其中重组DNA(recombinant DNA)技术是现代分 子生物学技术的核心。
• 重组DNA技术又称为基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、基 因克隆(gene cloning) 或基因工程（gene engineering）等。
【2024版】《生物化学与分子生物学》教学大纲
可编辑修改精选全文完整版《生物化学与分子生物学》教学大纲一、课程的性质和任务生物化学与分子生物学是研究生命化学的科学，它在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢及其在生命活动中的作用。
生物化学与分子生物学是高等医学院校全科医学专业的必修课之一。
本课程主要向学生传授生物大分子的化学组成、结构及功能；物质代谢；遗传信息的贮存、传递与表达；血液、肝的生物化学；分子生物学基本概念、原理和技术等生命科学内容，为医学生深入学习其他医学基础课、临床医学课程乃至毕业后的继续教育、医学各学科的研究工作中在分子水平上探讨疾病的病因、发病机理及疾病诊断、预防、治疗奠定理论与实验基础。
二、课程教学的基本要求通过本课程的学习，使学生知道及理解生物分子的结构与生理功能，以及两者之间的关系。
理解生物体重要物质代谢的基本途径，主要生理意义、以及代谢异常与疾病的关系。
理解基因信息传递的基本过程，理解各组织器官的代谢特点及它们在医学上的意义，了解分子生物学基本概念、原理和技术。
本课程教材适用于医学高等专科教育三年制全科医学专业，在第一学期开设，理论课55学时、实验课12学时，总学时为67学时。
四、教学内容与要求绪论【教学内容】第一节生物化学发展简史第二节当代生物化学研究的主要内容第三节生物化学与医学【教学要求】掌握：生物化学和分子生物学的概念.熟悉：生物化学和分子生物学研究的主要内容及其与医学的关系。
了解：生物化学的发展史。
第一章蛋白质的结构与功能【教学内容】第一节蛋白质的分子组成一、组成蛋白质的主要元素，氮的含量及应用。
组成蛋白质的氨基酸种类、结构通式；氨基酸的分类及结构特点；氨基酸的两性电离、紫外吸收性质及茚三酮反应。
二、肽和肽键，多肽链及N、C末端，主链骨架的概念。
第二节蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构：肽键二、蛋白质的二级结构：维持蛋白质构象的化学键、肽单元、α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲。
医学生物分子的分离纯化PPT课件
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在 于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
生物分子是生物所特有的有机化合物， 具有如下主要特征：
1）结构复杂有序、具有特殊的层次； 2）行使专一的功能； 3）代谢是其存在的条件； 4）生物分子体系具有自我复制的能力； 5）能人工合成与改造。
DNA
质 粒 的 提 取 与 纯 化
质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等
这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒 DNA的分离纯化三个步骤组成
1、碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂 SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质 与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。
分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污 染，保证核酸制品的纯度。
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构 还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有 机溶剂；
1. 回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA 样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。
2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化 的柱层析法（column chromatography）。
柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素 （cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。
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生物分子的分离纯化
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类 分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组 成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等）
生物大分子（蛋白质、核酸、糖 复合物等）
一、生物大分子的制备
生物大分子指的是作为生物体内主要 活性成分的各种分子量达到上万或更 多的有机分子。常见的生物大分子包 括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
DNA
质 粒 的 提 取 与 纯 化
质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等
这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的 释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成
1、碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强 阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与 NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生 变性，释放出质粒DNA。
3、玻棒缠绕法
用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代， 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改 进而来。 本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带 钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转 移至pH8.0的TE缓冲液中。
1.回收率 为提高DNA片段的回收率，可 通过提高DNA样品的上样量和选择适宜 的方法与材料而实现。
2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂 抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。
柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE） -纤维素（cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。
真核基因组DNA的分离纯化
尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。
真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线
1、酚抽提法
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出， 通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定 纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。
• 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， • 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光
光度法与荧光光度法进行。 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱
基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线， 其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。
从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎 与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切 出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲 液浸泡，使DNA洗脱出来。 该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依 分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。 回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染 细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作 简单，是小片段DNA回收的较好方法。
制备的关键
掌握目的产物 的理化性质
最困难 的过程
要求达到一维电泳一 条带，二维电泳一个 点，或HPLC和毛细 管电泳都是一个峰
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，
主要是利用它们之间理化性质的差异。
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。
该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备
质粒DNA的纯化
• 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存 在的条件下，各种不同密度的物质经离心平 衡后得以分开。
• 2、聚乙二醇沉淀法 （一种分级沉淀法）
• 3、柱层析法 （树脂）
真核细胞RNA的分离纯化
• RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还 广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境 中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学 活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能 使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant） 后，RNase的活性又可恢复。
如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等
（二）核酸的保存
(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保 存；在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双 蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒 核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC 质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱 性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质 粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。
该法操作简单、重复性好且成本低，制备的 质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求， 是使用最广泛的方法
2、SDS裂解法
• SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中， 用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细 菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到 等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、 洗涤质粒DNA
生物大分子的制备有以下主要特点：
（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法 可通用于各种生物大分子的分离制备；
（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度；
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对 酶有抑制作用的有机溶剂；
2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度；
3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求
建立相应的可靠的分析测定方法
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验 材料的破碎和预处理
分离纯化方案的选择和探索 产物纯度的鉴定
产物的浓缩，干燥和保存。
科研、开发或 发现新的物质
•由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA （>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎 片缠绕在一起而丢失，故产率不高。
3、煮沸裂解法
煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌 酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁 后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配 对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但 CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后， CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去 除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的 质粒DNA。
裂解液中： EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞 膜稳定性 SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并 使其变性沉淀，同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防 止DNA变性
⑴ 紫外分光光度法：该法主要ห้องสมุดไป่ตู้过A260与 A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA 的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。
⑵ 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸 电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。
2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用 于制备大片段DNA
1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破 坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核 酸 制 备 的 技 术 路 线
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失， 样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。
该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb， 适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA
基因组DNA片段的纯化