生物大分子分离纯化的方法01
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生物样品中生物大分子的分离纯化
19
（六） 生物大分子的抽提
✓ “抽提”是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一 定条件下和溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态 充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。
14
组织与细胞破碎
1、机械破碎法
✓ 研磨：这种方法比较柔和，适宜实验室使用； ✓ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法。利用高速
旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大 时，经常使用。 ✓ 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细 胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、 多聚糖等。
3
生物大分子分离纯化的特殊性
1. 生物材料的组成复杂，种类极多；分离纯化方法千 差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大 分子的分离制备。
2. 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤多，流程长。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
第七章 生物大分子的色谱分离和纯化
吸附色谱分离
是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 有氧化铝 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 新的吸附色谱技术有： 新的吸附色谱技术有：
色谱分离的分类
1. 按分离机理不同分类
吸附色谱分离（ Chromatography，AC） 吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC） 分配色谱（ Chromatography，DC） 分配色谱（Distribution Chromatography，DC） 离子交换色谱（ Chromatography，IEC） 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC） 凝胶色谱（ Chromatography，GC） 凝胶色谱（Gel Chromatography，GC） 亲合色谱（ Chromatography，AFC） 亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）
纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在 基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和 纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统 的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、 DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化 产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体 等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。
凝胶色谱
以凝胶为固定相， 以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术， 大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子 筛色谱（ Chromatography， 筛色谱（Molecular Sieve Chromatography， MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（ ）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 Chromatography，SEC）
生物大分子分离纯化技术(159页)
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子的分离纯化技术(共34张PPT)
离心(3)
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超 速离心法
移动区带(Moving Zone)超速离心法
等密度方法(Isodensity)：
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
亲和色谱
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液:
离心(2)
(Relative centrifugal force)：
F=mω2r;
Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度 ）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的
紫外-可见吸收法 荧光检测法
电化学检测法
质谱法
高效毛细管电泳
电泳淌度 电渗流
淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
生物分子分离纯化的原理与技术路线
生物分子分离纯化的原理与技术路线生物分子分离纯化是现代生物科学研究的重要内容之一，它在生命科学、医学、化学、农业等许多领域中发挥着重要应用。
生物分子分离纯化是指将某种复杂生物体系中的生物分子依据其特定的物理化学性质从该体系中分离出来，进而纯化的过程。
这一过程需要基于分子的特性，结合各种理化技术手段，构建出相应的技术路线，进而实现对生物分子的高效分离纯化。
本文将详细介绍生物分子分离纯化的原理与技术路线。
一、生物分子的特性生物分子是一类由生物体内合成而成的，拥有特定结构的分子，包括蛋白质、核酸、多糖、脂质等，在代谢过程中发挥着极其复杂的生物功能。
不同的生物分子具有不同的物理化学性质，因此对于不同类型的生物分子，选择不同的分离策略与纯化方法是很有必要的。
二、生物分子分离的原理常用的生物分子分离方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、逆流层析、氢氧化铝纤维素膜过滤、高效液相色谱等。
下面将对其中几种方法进行详细介绍。
1、离子交换法离子交换法是利用载有不同离子电荷的基质，将带有相反电荷的生物大分子吸附并固定。
离子交换基质的离子交换能力取决于其离子化程度、离子交换基团的种类、柱子pH值等。
因此，在进行离子交换分离时，应综合考虑这些因素，进而选择最合适的离子交换柱。
常用的离子交换柱包括阴离子交换柱、阳离子交换柱和混合离子交换柱。
离子交换法分离出来的生物分子具有较高的纯度，但往往需要进行多次重复柱层析才能达到理想纯度。
2、凝胶过滤法凝胶过滤是最常见也是最简单的生物分子分离方法，它是利用凝胶颗粒的孔隙在生物分子样品中分子量大分子分离的方法。
大分子将通过直接流过凝胶颗粒填充层析柱时逐渐逼近凝胶颗粒的空隙，并逐渐进行“筛分”，从而被分离并纯化。
但凝胶颗粒的孔隙大小、分子量很容易受温度、pH值、离子强度等因素的影响，因此凝胶过滤应被认为是一种初步纯化方法。
3、亲和层析法亲和层析法是将含有亲和剂的固定相与生物样品进行反应，从而将特定的生物分子与固定相柱壁产生结合。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(4) 亲和色谱
1、原理
亲和色谱(Affinity Chromatography AC)又 叫功能色谱(Function Chromatography)， 它的原理是填料上的配基与生物大分子特 异结合，用特殊的洗脱条件把被吸附的生 物分子洗脱下来。一种亲和色谱填料只能 用于一种或有限的一类生物分子。
中性pH可以保持蛋白质的活性，当pH偏碱性时， 有利于洗脱。
3、疏水色谱的特点
1. 分离效果好，成本低。 2. 洗脱条件温和，处理样品量大，分辨 率高。 3. 配合其他色谱使用更能发挥它的分离 效果。
4、疏水色谱应用
苯基琼脂糖凝胶纯化培养液中的抗体。
5.疏水色谱纯化细胞培养样品中的抗体
1800 1500
3. 环氧氯丙烷活化法
这种活化的方法时间短，而且价格便宜，也很常用。
4.高碘酸盐活化法
可以很温和在中性条件下偶联配基，但是需要用还原剂 还原才能得到稳定的填料
5.NHS活化法
可以在短时间内温和条件下偶连任何带氨基的物质，特 别适合偶连生物大分子，以保证它们的生物活性，它有 6-9个碳原子的手臂，是合成亲和填料不错的选择。
A280(mAu)
1200 900 600 300 0 0 50 100 150 200 250 300
volume(ml)
苯基琼脂糖凝胶分离抗体
填料：苯基琼脂糖凝胶 FF 5ml Buffer A:50mM PBS，0.6M 硫酸铵，pH7.0 Buffer B: 50mM PBS，pH7.0 结果：洗脱蛋白量4.5mg/ml×20ml=90mg
3、凝胶过滤色谱的缺点
处理量小，时间长，效率低。
凝胶过滤色谱填料
传统的凝胶过滤的填料用的是葡聚糖交联凝胶如 sphadex系列以及改性的sephacryl系列，凝胶刚性不理 想流速不快，特别是前者压力和盐都会导致凝胶收缩， 所以难提高流速，也不容易制备成小颗粒的高分辨率 的填料。 新的凝胶过滤色谱填料将葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混 合造粒，再经过高度交联制备出流速快、重复性好、 分离效果更好的新型凝胶过滤填料，如superdex系列及 琼葡糖凝胶系列都是用这样的。它比普通的葡聚糖凝 胶填料相比流速快，刚性好，颗粒均匀，没有非特异 吸附，装填后体积不收缩，因此可以在高流速下保持 很好的分离效果可以制备成平均粒径为34μm或13 μm高效填料。
3000-80000 琼葡糖凝胶 G100 HP及FF 4000-120000 琼葡糖凝胶 G150 HP及FF 5000-300000
琼葡糖凝胶 G200 HP及FF 5000-600000
(2) 离子交换色谱
1、原理
离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography IEC）原理是带电的生物大分子和离子交换色 谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。
苯基琼脂糖纯化SDS-PAGE图
1.marker 2. 培养液上清 3.苯基柱 穿透 4.和5 .苯基柱洗脱
6、疏水色谱填料
介质名称 苯基琼脂糖凝胶 FF Phenyl sepharose FF 丁基琼脂糖凝胶 FF Butyl sepharose FF 辛基琼脂糖凝胶 FF Octyl sepharose FF 功能基团 苯基 -OCH2CH(OH) CH2OC6H5 丁基 -OCH2CH (OH) CH2OC4H9 辛基 –OCH2CH (OH) CH2OC8H17
凝胶过滤色谱填料
型号
琼葡糖凝胶 G10 HP及FF 琼葡糖凝胶 G15 HP及FF 琼葡糖凝胶 G25 HP及FF 琼葡糖凝胶 G50 HP及FF 琼葡糖凝胶 G75 HP及FF
分离范围 ＜700 100-1500 1000-5000 1000-30000
平均粒径(μm) 34和 90 34和 90 34和90 34和90 34和90 34和90 34和90 34和90
1.螯合金属离子的影响
常用的有Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Ca2+。其中Cu2+、 Ni2+对蛋白吸附力强， Co2+ ，Zn2+比较弱。
2.缓冲液的影响
缓冲液中最好没有EDTA，EGTA和氨盐，在缓冲液中加入适量 的表面活性剂或者减少盐浓度可以降低非特异的疏水吸附。
3.样品的影响
1.样品通常溶解在pH5.5-8.5的缓冲液中，pH高，载量也高。 2.缓冲液的pH不能小于5.5，否则金属离子会脱落。 3.样品不能含EDTA，EGTA和氨盐等
镍琼脂糖凝胶 FF分离带His标签的重组蛋白
800
A280(mAu)
600 400 200 0 0
穿透峰
1 2 3
4
40
பைடு நூலகம்
80 120 time(min)
160
图1镍柱色谱图
柱子： 镍琼脂糖凝胶 FF 1.6x20 10 ml 样品：13.5ml细胞破碎液 平衡缓冲液：20mM PBS pH 7.4 0.5M NaCl 洗脱缓冲液:平衡缓冲液中加不同浓度的咪唑
6.巯基活化法
把巯基和二巯物质进行反应而得到的填料可以用于在短 时间内温和偶联带巯基的物质，它是可以反复使用的， 同时也是纯化带巯基物质的有利工具。
7.卤素活化法
使填料碘化或者溴化，可以在短时间内温和偶联带巯基 的物质，溴化填料还可以偶联带氨基或者羟基的物质。
3、亲和色谱的应用 1 金属螯合色谱纯化带His标签蛋白
2、离子交换色谱优点
1. 处理量大，操作简单。 2. 应用广泛。
3、离子交换色谱缺点
样品要除盐，分离效果不如亲和和疏水色谱。
4、离子交换色谱填料
介质名称
DEAE琼脂糖凝胶 FF或(DEAE sepharose FF) Q 琼脂糖凝胶 FF) 功能基团 二乙基氨基乙基 -OCH2CH2N(C2H5)2
7 6
60
120 time(min)
180
图3 Cu2+螯合色谱图
柱子： Cu2+琼脂糖凝胶 FF 1.6x20 10 ml 样品：20ml细胞破碎液 平衡缓冲液：20mM PBS pH 7.45 0.5M NaCl 洗脱缓冲液:平衡缓冲液中加不同浓度的咪唑
图4 Cu2+柱SDS-PAGE 1: marker，2: 细胞破碎液，3:穿透峰，4: 10mM咪唑洗脱峰，5: 20mM咪唑洗脱峰 ，6: 50mM咪唑洗脱峰，7: 100mM咪唑 洗 脱 峰 ， 8 : 2 0 0 mM 咪 唑 洗 脱 峰 ， 9 : 300mM咪唑洗脱峰，10: 400mM咪唑洗 脱峰
2、活化方法 1. 溴化氰活化法
溴化氰活化及配基偶联的反应如下图所示。 对新活化的琼脂糖凝胶偶联分析表明，80% 配基是由氰酸酯偶联的，20%由亚氨碳酸盐 偶联的。 缺点： 偶联后形成的酰胺键不稳定，容易降解而使 配基脱落。
溴化氰活化及配基偶联的原理
2.缩水甘油醚活化法
这种活化的填料其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化75%， 但它有合适的亲和手臂，所以有更好的分离效果，而化 学性质更加稳定。配基很少脱落。 此外它对琼脂糖凝胶还有交联作用，所以填料的刚性更 好，流速更快。
FF 或(Q sepharose 二乙基(2-羟丙基)季胺 -OCH2CH2N+ (C2H5)2CH2CH(OH)CH3 CM 琼脂糖凝胶 FF或(CM 羧甲基 –OCH2COOH sepharose FF) SP 琼脂糖凝胶 FF或(SP sepharose 磺酸丙基 -C3H6SO3H FF) 球形羟基磷灰石 FF 钙离子及磷酸根
生物大分子分离纯化方法
韦 新 桂(chromatography)
北京韦氏博慧色谱科技有限公司
色谱填料的定义
色谱填料（层析介质）
一、色谱分离的原理
1、生物分子的大小及形状 2、生物分子的荷电性质 3、生物分子的极性 4、生物分子的特异性
二、色 谱 种 类
1、凝胶过滤色谱（分子筛） 2、离子交换色谱 3、疏水色谱 4、亲和色谱
(1) 凝胶过滤色谱
1、原理
凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻 色谱(Size Exclusion Chromatography SEC）原理见图解。
2、凝胶过滤色谱的优点
1. 分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。 2. 分离的分子量范围广。 3. 易于操作。
金属螯合亲和色谱(Metal Chelate Affinity Chromatography)，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是 利用蛋白表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能与多种过渡金 属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用， 利用这个原理对蛋白进行分离。因此螯合了金属离子的琼脂 糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属 离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸 也能与固定金属离子产生吸附作用，但这种吸附力要远小于 组氨酸残基与金属离子的吸附作用。
图2 镍柱SDS-PAGE 1：Marker 2: 细胞破碎液，3,4：穿透峰 ，5: 10mM咪唑洗脱峰，6,7：20mM咪 唑洗脱峰，8：100mM咪唑洗脱峰，9、 10: 200mM咪唑洗脱峰
用Cu2+分离带His标签的重组蛋白
A280(mAu)
800 600 400 200 0 0
穿透峰 1 2 3 45
选择填料时，最好是选择琼脂糖凝胶系列的产 品，避免选择纤维素类的或者sephadex类的， 因为它们流速慢而且不能在柱子上进行再生清 洗，操作不便。如果采用线性洗脱的方法使用 细长柱子及颗粒细的HP级别的填料可以得到更 好的分离效果。
(3) 疏水色谱
1、原理
疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography HIC）原理是 在高浓度的盐溶液中，蛋白质会被吸附 到疏水色谱填料的疏水基团上，当逐渐 降低盐浓度时，它们会按疏水性的强弱 先后被洗脱。