生物大分子的分离纯化和鉴定
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（六） 生物大分子的抽提
✓ “抽提”是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一 定条件下和溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态 充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。
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组织与细胞破碎
1、机械破碎法
✓ 研磨：这种方法比较柔和，适宜实验室使用； ✓ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法。利用高速
旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大 时，经常使用。 ✓ 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细 胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、 多聚糖等。
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生物大分子分离纯化的特殊性
1. 生物材料的组成复杂，种类极多；分离纯化方法千 差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大 分子的分离制备。
2. 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤多，流程长。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
生物大分子的纯化与结晶
生物大分子的纯化与结晶生物大分子是一些大分子组合，包括蛋白质、核酸、多糖等，它们在生物体中起着复杂的功能。
在分子生物学领域中，我们经常需要从原始的混合物中分离出目标生物大分子，进行纯化和结晶，以便进行后续的研究。
一、生物大分子的纯化生物大分子的纯化是将混合物中的目标物质（通常是蛋白质）从其他混合物中分离出来的过程。
这一过程可以分为以下几个步骤。
1. 研究目标大分子在进行纯化之前，需要对目标大分子进行研究，了解其特性和性质。
例如，了解其分子量、同工酶、pI 值、疏水性质等，有助于选择合适的纯化方法。
2. 选择适当的纯化方法生物大分子可以通过多种不同的方法进行纯化，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、氢氧化铝吸附层析、逆流层析等。
选择合适的纯化方法需要考虑目标大分子的性质、产量和纯化程度等因素。
3. 提取和分离目标大分子在纯化过程中，我们需要使用溶液提取目标大分子，通常使用“冰冻‐离心‐洗涤”技术。
在这个过程中，我们通常使用不同的缓冲液、离子浓度和 pH 值等参数来优化纯化效果。
4. 检测和确定纯度在纯化过程中，需要检测分离出的目标大分子的纯度，并选择适当的检测方法。
常用的方法包括凝胶电泳、酶活性测定、光谱法和染料结合法等。
二、生物大分子的结晶结晶是将生物大分子从纯化溶液中分离出来的过程。
这一过程可以分为以下几个步骤。
1. 产生合适的结晶条件通过调整生物大分子的溶液条件（如 pH、盐浓度、温度、配体、添加剂等），可以使生物大分子形成晶体。
在这个过程中，我们需要不断地调整条件，探索最合适的结晶条件。
2. 建立结晶种子种子是晶体生长的先导因素，是生物大分子结晶的一个关键因素。
种子的形成可以通过添加一些外源因素，如微晶、配位邻基和长链脂肪酸等。
3. 监控结晶的质量和速率在晶体生长期间，需要不断监测晶体的质量和生长速率。
为了使晶体不断生长，在晶体生长的过程中，我们需要不断添加新的母液，并适时调整母液的条件。
生物活性物质的分离纯化与分子结构鉴定
生物活性物质的分离纯化与分子结构鉴定1. 生物活性物质的分离纯化方法生物活性物质是指能够对生命体产生影响或作用的物质，在药学、食品科学等领域广泛应用。
为了进一步研究生物活性物质的作用机制和用途，需要先进行生物活性物质的分离纯化。
1.1 色谱法色谱法被广泛采用于生物活性物质的分离纯化中。
色谱分离可根据测试物质在分离介质中的亲和性、亲水性、原子大小、电荷、分子大小和亲合作用等进行分离。
常用的色谱法有气相色谱法、高效液相色谱法、离子交换色谱法、分子层析色谱法、分子筛柱色谱法、活性炭柱液相色谱法等。
1.2 电泳法电泳法是另一种分离生物活性物质的方法。
其原理是根据分子运动速度、电荷量、分子质量来分离所需物质。
最常见的电泳法是凝胶电泳法。
凝胶电泳法在分离和纯化生物大分子如核酸、蛋白质、多肽等方面具有广泛的应用。
1.3 萃取法萃取法是一种将待分离混合物中的成分从一个相转移到另一个相而实现物质分离的技术。
萃取法可通过不同的物理和化学特性，例如分子极性、酸碱度、溶解性等来实现分离纯化。
最常用的萃取法是液液萃取法、固相萃取法、微波辅助萃取法等。
2. 生物活性物质的分子结构鉴定方法分子结构鉴定是了解生物活性物质化学成分的基础，对于制定合理的药物设计方案、了解作用机制具有重要意义。
2.1 红外光谱法红外光谱是一种常见的光谱鉴定分析技术。
分析物在各种不同化学键上所吸收的特定波长，可以给出化学键的振动情况，推测分析物的化学结构特征。
目前，红外光谱已成为快速鉴定有机与无机物质结构的有力工具。
2.2 质谱法质谱法是通过分析化合物中分子的质量和相对丰度（相对丰度指的是一个分子与其他分子之间的相对量，可以是质量比或信号强度比），以帮助确定化合物的结构和组成。
常见的质谱方法有质量浓度比谱、飞行时间法、电感耦合等离子体质谱法等。
2.3 核磁共振技术核磁共振技术是一种广泛应用于物质结构分析中的高分辨率光谱学方法。
通过对成分中分子的核磁共振信号进行采集和分析，可以精确确定其结构和化学性质。
生物大分子分离纯化及肝酶提取
（一）．粗制品的分离方法
蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀法，有 机溶剂分级分离法等。
RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、苯酚 法等。
特点：简便，处理量大，既能除去杂质又能 浓缩样品。
缺点：分 离心、柱层析法、电泳法等。 特点：规模小，分辨率高。
剪切力将组织细胞破碎。 处理材料量较大时，使用之。 ②匀浆器 匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于 分散的组织细胞。科研上若材料处理量少，可 使用匀浆器。 ③研磨器
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（四）细胞破碎
2．物理破碎方法 ①反复冻融法 ②超声波破碎法 ---- 超声波多用于微生物细胞
的破碎。 3．化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞
34 行分离的。
离子交换柱层析法实验原理
混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地 进行 交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各 组分 间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上 述相 同重复过程时，各自的情况就有会所不同，从而 使各 物质得以分离。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧 甲基纤维素； CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨 基乙基纤维素； DEAE—纤维素），当被分离的蛋白 质溶液流经离子 交换层析柱时，带有与离子交换剂相 反电荷的蛋白质 被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度 办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
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此外，还可根据以下性质选 择合适的分离纯化方法：
电荷性质的差异
离子交换层析法 电泳法
凝胶过滤法
分子大小形状差异
超滤法 透析法
离心法 溶解度差异
沉 盐析 淀 有机溶剂沉淀 法 选择性沉淀
分配层析
萃取
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结晶
（一）．浓缩---从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的 溶液的过程。
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子的分离纯化和鉴定
1、酶学破碎法：外加酶制剂、自溶法。 2、机械破碎法：高速捣碎法、高速均浆法、高速磨珠法 3、物理破碎法：温差法、压差法、超声波
4、化学破碎法：有机溶剂法、表面活性剂（SDS 等）
金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。
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蛋白质的分离纯化
依据蛋白质在溶液中的性质不同（溶解度、电荷、相 对分子质量的大小，特异亲和力等）确立的蛋白质和酶的分
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2、盐析 高浓度的盐（常用硫酸铵）可以降低蛋白质的溶解度。因
为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相 对浓度，还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷 和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和
度由低到高逐次增加，如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4可使 球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到 分级分离的目的.
电泳技术
电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反
的电极移动的现象。 原理：
在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电
点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，可使它们分离。
颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷
的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的 影响。
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的层析柱时，比凝胶“网眼”大的蛋白质分子不能进入“网 眼”
而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝胶
颗粒的内部。这样，由于不同大小的分子所经历的路程不
同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。
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（三）根据电荷不同的分离方法： 1、 电泳 2、 离子交换层析
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金属螯合剂（Mg2+、Ca2+、EDTA）、化学变性剂。
蛋白质的分离纯化
依据蛋白质在溶液中的性质不同（溶解度、电荷、相 对分子质量的大小，特异亲和力等）确立的蛋白质和酶的分 离方法.其性质包括: 。
电泳技术
电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反 的电极移动的现象。 原理：
在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电 点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，可使它们分离。
颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷 的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的 影响。
有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操 作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白：
1、透析和超过滤：即利用蛋白质分子不能通 过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质 （如无机盐、单糖、水）等分开。
2、密度梯度（区带）离心：
蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时，每种蛋白质
（1）利用溶解度差别的分离方法
1、等电点沉淀： 蛋白质在等电点时溶解度最小。当蛋白质混合液的PH值被 调到其中某一种成分的PI时，该种成分蛋白质将会沉淀下 来，这种沉淀出来的蛋白质保持着天然构象（活性）能再 溶解。高于或低于该PI的蛋白质留在溶液。
如：Glu的生产也是利用此性质进行的， Glu PI 3.22。
颗粒降到与自身密度相近的密度梯度时停止不前，各种蛋
白质被分离成各自独立的区带。
3、凝胶过滤（分子筛层析）
根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的方法之
一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰
性多聚体（葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶 Sepharose）
的层析柱时，比凝胶“网眼”大的蛋白质分子不能进入 “网眼”
有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质 的介电常数，水是高介电常数（20℃时，80），有机溶 剂是低介电常数物质（20℃时，甲醇33，乙醇24，丙 酮21.4），因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降 低。这样，蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度 减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和 沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与 盐析相似，与蛋白质争夺水化（膜）水，致使蛋白质聚 集体的形成并沉淀。
换 剂）。弱碱型的有阴离子交换剂DEAE—纤维素、改进型的CM— Sephadex和DEAE—Sephadex。 （4）凝胶层析：
利用固定相的孔径对试剂样各分子（分子量大小或体积大 小）的排阻特性差异进行分离。 （5）亲和层析：
利用固定相特定配体与试样各分子特异性结合力（亲和力） 大小不同进行分离。
而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝 胶
颗粒的内部。这样，由于不同大小的分子所经历的路程不
（三）根据电荷不同的分离方法： 1、 电泳 2、 离子交换层析
（四）根据特异亲和力不同的分离方法——亲和层析
层析技术
层析又称色谱法：利用混合物中各组分的物理 化学性质（分子的形状和大小，分子的极性，吸附 力，分子的亲和力，分子的分配系数等）的不同， 使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相是固 定的，称固定相；另一相是流动的，称流动相。当 流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动， 而达到分离。
（1）吸附层析： 利用吸附剂（固定相）表面对不同组分物理吸附性能的差异
而达到分离的目的。 如 硅胶G薄层层析。 （2）分配层析：
利用各组分在给定的两相中不同的分配系数而得到分离。如 纸层析。 （3）离子交换层析：
利用离子交换剂与试样中不同离子结合吸引力的差异大小不 同而得到分离。常用的交换剂有CM—纤维素（弱酸型阳离子交
到 分级分离的目的.
盐析后必须脱盐。 脱盐最常见的方法是透析法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝 胶SephadexG25脱盐）、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点 沉 淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去 (NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检
3、有机溶剂分级法
-70℃低温冰箱（数月） 干燥：可长期保存
2、植物组织：10小时内置-4 -30℃冰箱储藏备用 3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。
胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4℃保存（数 月不变质）
除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大 分子都存在于细胞之内.
细胞破碎
目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为 三类：显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带 电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜 直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用 于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。
自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲 溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可 观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面 （峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成 分的电泳。
2、盐析
高浓度的盐（常用硫酸铵）可以降低蛋白质的溶解度。因 为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相 对浓度，还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷 和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和 度由低到高逐次增加，如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4
可使 球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达
生物大分子 分离纯化和鉴定
生物大分子通常是指在生物体内存在的或生物体 代谢产生的具有特殊生物学功能的高分子化和物，主 要包括蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。
生物材料的选择与处理
一、选择生物材料原则： 有效成分含量高，稳定，来源丰富，保持新鲜，提
取工艺简单，成本低。如：用酵母提RNA，用牛奶提 酪蛋白，用大蒜提SOD(超氧化物歧化酶) 二、生物材料处理： 1、动物脏器：冰冻：-10℃冰库（短期保存）