常用菌悬液的制备、保存及使用方法及常用溶液保存期限
微生物检验实验室菌种保存程序
微生物检验实验室菌种保存程序1．目的规范菌种保存程序。
2．范围微生物实验室保存的标准菌种和来自临床的标本菌株。
3．职责微生物实验室检验人员正确执行本程序。
4．程序4.1需氧菌保存法4.1.1一般保存法见表6-1表6-1 常见菌种培养基保存期限保存时保存温培养时菌种培养基间度间脱纤维羊血或脱脂牛流感嗜血杆菌 6-20个月18-24奶血琼脂斜面（高层加葡萄球菌、链球菌 18-24 4—8 1—3年液体石蜡）酪蛋白琼脂Soxbean肠杆菌科 18-24 4—8 1年（高层加液体石蜡）+4牛肉汤（6份肉汤肠杆菌科、非发酵 6-20个月胰大豆10%18-24 份甘油或菌、葡萄球菌等甘油）10%-15%肉汤或．苛养菌 18-24 5%小牛血清肉汤 -20 6个月罗氏培养基（加液体3个月18-24分枝杆菌 4—8石蜡）心脑浸液或布氏肉汤幽门螺杆菌 18-24 -70 6年加入甘油注：保存郡主均需培养18~24h。
4.1.2 冷冻干燥法将待保存菌培养18~24小时后，挑取菌落加入一定量的牛肉汤或心脑浸出液加入20%的蔗糖，混匀，分装于安瓿中，置-70℃低温冰箱中迅速冻结，再放入冷冻干燥机内，抽真空16~24小时，然后将安瓿封口，置低温冰箱保存。
大多数菌株可保存10年以上，甚至更长。
4.1.3 超冰冻法保存菌株初代培养18~24小时的菌落、菌苔，加入0.5~1.0ml无菌脱纤维羊血安瓿中，封口，置液氮或-40℃冰箱中保存。
4.2 厌氧菌保存法4.2.1短期保存方法4.2.1.1疱肉培养基保存法用牛肉渣和牛肉浸出液制成疱肉培养管，接种待保存菌株，然后覆盖1~2cm的石蜡，再将培养管垂直放置片刻，待石蜡凝固置35℃培养（无芽胞厌氧菌培养72小时，普通梭菌培养24小时，产气荚膜梭菌和多枝梭菌培养2周左右），最后置室温或-20℃保存。
发酵个3~6次，不发酵糖类的厌氧菌1糖类的厌氧菌每个月转钟月转钟1次。
4.2.1.2 半固体培养基保存法在上述液体培养基中加入.0.2%~0.5%琼脂，制成半固体培养基，接种时用毛细管将待保存的厌氧菌的菌液加入半固体培养管底，表面加入1~2cm厚度的液体石蜡，密封管口，培养48小时，置室温或-20℃保存。
几种菌种的保存及复苏方法
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
常用溶液保存期限[参照材料]
![常用溶液保存期限[参照材料]](https://img.taocdn.com/s3/m/a8fb6376a6c30c2258019e5b.png)
磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月醋酸盐缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月醋酸--醋酸铵缓冲液3个月磷酸盐缓冲液3个月草酸氰钾缓冲液3个月氢氧化钠试液6个月碘试液6个月硝酸银试液6个月硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月三氯化铁试液6个月碘化铋试液6个月氰化钾试液6个月溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制亚硫酸氢钠试液本液应临用新制亚硫酸钠试液本液应临用新制亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制过氧化氢试液6个月次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月草酸铵试液6个月重铬酸钾试液6个月盐酸羟胺试液6个月钼酸铵试液6个月铁氰化钾试液6个月稀铁氰化钾试液6个月浓氨试液3个月高锰酸钾试液6个月硅钨酸试液6个月铬酸钾试液6个月硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。
6个月硫代乙酰胺试液6个月硫代硫酸钠试液6个月硫氰酸铵试液6个月硫酸亚铁试液本液应临用新制。
硫酸钾试液6个月硫酸铜试液6个月硫酸镁试液6个月稀硫酸镁试液6个月氯化亚锡试液6个月氯化钙试液6个月氯化钡试液6个月氯化钴试液6个月氯化铵试液6个月碘化汞钾试液6个月碘化钾试液6个月碘化钾碘试液6个月溴化钾溴试液6个月碱性枸椽酸铜试液6个月碱性酒石酸铜试液6个月碱酸焦性没食子酸试液6个月碳酸氢钠试液6个月碳酸钠试液6个月碳酸钾试液6个月碳酸铵试液6个月醋酸钠试液6个月醋酸铅试液6个月醋酸铵试液6个月醋酸铜试液6个月靛胭脂试液6个月亚硝基铁氰化钠液6个月标准氯化钠液临用前精密量取贮液10ml,用滤纸过滤时滤纸是含有氯化物;可预先用含有硝酸的水溶液洗净后使用。
储备液6个月结晶紫指示液6个月饱和硫化氢水溶液3个月标准铅液临用前精密量贮备液10ml。
(配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅储备液6个月黄色调比色液(1号基础液) 12个月浊度标准贮备液本液置冷处避光保存可在两个月内使用,用前摇匀。
菌种的接种及菌悬液制备操作程序
菌种的接种及菌悬液制备操作程序一、菌种的接种：1、菌种的复苏：1.1 把冻干菌种管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或超净工作台。
1.2 将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。
点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌毛细滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使冷而炸裂。
1.3 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取一支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌块搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24小时。
1.4 取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。
如发现菌形不典型，可进行平板分离单菌落。
2、菌种的接种：2.1 准备需用的培养基，培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。
标签上注明菌名及接种日期。
自冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
2.2 点燃酒精或其他灯，在左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30分钟，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。
右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开棉塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管品移至火焰旁。
堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。
2.3 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。
2.4 将已接种毕的细菌管置35～37℃培养22～24小时，霉菌管一般置24～25℃霉菌培养箱内培养7日。
菌种保藏
菌种保藏几种常用的保藏方法：1、传代培养法保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C˚冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。
可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。
2、载体法使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。
常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。
3、悬液法将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。
溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。
4、冷冻法使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。
包括低温法和液氮法。
此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。
注意控制降温速率及保护剂的使用。
5、真空干燥法这类方法包括冷冻真空干燥法和L－干燥法。
冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。
L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在10－20C˚范围内进行真空干燥。
操作方法1、斜面保藏法将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。
保藏时间依微生物的种类而定。
霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。
此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。
2、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。
将试管直立，置低温或室温下保存。
此法实用且效果较好。
霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通细菌也可保藏1年左右。
3、穿刺保藏法按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置4℃冰箱存放。
4、砂土管保藏法（1）河砂处理取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。
倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。
（2）土壤处理取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。
常用菌悬液的制备、保存及使用方法
常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。
培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。
普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。
最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。
抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。
（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]形态与染色：革兰氏阴性杆菌。
菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。
在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。
在血平板上会有透明溶血环。
（3）白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3～6μm，比葡萄球菌大5～6倍，革兰阳性，但着色不均匀。
培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37℃或室温孵育2～3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。
（4）金黄葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。
菌悬液制备计数记录其他
培养箱型号：编号：（设定温度34℃）
放入时间：年月日时分操作人：取出时间：年月来自时分操作人：试验菌名称
菌液稀释级
选用稀释级别
皿1
皿2
平均
皿1
皿2
平均
皿1
皿2
平均
皿1
皿2
平均
3. 菌落计数结果 （标准：选择菌落数小于100cfu的稀释级菌液试验）
检查人：日期：复核人：日期：
菌悬液制备及菌落数检查记录
菌种名称
培养基名称
检验依据
有效期
1. 菌悬液制备：
(菌悬液批号：制备日期：）
从斜面挑出菌落接种于胰酪大豆胨液体培养基上，30-35℃培养18〜24小时。
取新鲜培养物1ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，采用振摇法的1:10菌悬液，再用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液逐步10倍稀释制成适宜浓度的菌悬液。
菌种斜面批号：胰酪大豆胨液体培养基批号：
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液批号：
培养箱型号：编号：（设定温度34℃）
放入时间：年月日时分操作人：
取出时间：年月日时分操作人：
2.取上述制备的菌液各个稀释级各1ml注入无菌平皿中，加入(15-20ml)不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置于30~35℃培养箱培养不超过3天，计数。每稀释级平行制备两平皿。
常用菌悬液的制备保存及使用方法
摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法
一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...
常用菌悬液的制备、保存及使用方法
(B) 63 501]
白色念珠菌
灭菌水或%灭菌生理盐水
4~8℃冰箱保存
半个月
三、菌悬液浓度的简单确定法：麦氏比浊法
麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。
麦氏比浊管的配比如下：
使用技巧：
（1）直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。
（2）找张白纸，打上平行直线，然后看（如图示，利用光在不同浓度液体折射不同）。
注意事项：
（1）测定好的细菌，最好做一下梯度稀释涂布计数。
（2）此浓度是对应的大肠杆菌的浓度，如果是其他细菌，会有一定的差别。
（3）此种方法测定的准确性不是很高，如果是对细菌数量要求较精确的，请用紫外分光光度计。
抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。
（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]
形态与染色：革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。在血平板上会有透明溶血环。
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磷酸盐标准缓冲液3个月标准缓冲液3个月
醋酸盐缓冲液3个月
磷酸盐缓冲液3个月
醋酸--醋酸铵缓冲液3个月
草酸氰钾缓冲液3个月
氢氧化钠试液6个月
碘试液6个月
硝酸银试液6个月
硝酸汞试液本液应置棕色瓶内,密闭保存6个月
氨试液本液应置橡皮塞瓶中保存6个月
硫化氰试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存2个月对二氨基苯甲醛试液6个月
三氯化铁试液6个月
碘化铋试液6个月
氰化钾试液6个月
溴化汞试液本液应置玻璃塞瓶内在暗处保存6个月亚铁氰化钾试液本液应临用新制
亚硫酸氢钠试液本液应临用新制
亚硫酸钠试液本液应临用新制
亚硝基铁氰化钠试液本液应临用新制
过氧化氢试液6个月
次氯酸钠试液本液应置棕色瓶内,在暗处保存6个月草酸试液6个月
草酸铵试液6个月
重铬酸钾试液6个月
钼酸铵试液6个月
铁氰化钾试液6个月
稀铁氰化钾试液6个月
浓氨试液3个月
高锰酸钾试液6个月
硅钨酸试液6个月
铬酸钾试液6个月
硝酸汞试液本液应置玻璃瓶内,在暗处保存。
6个月硫代乙酰胺试液6个月
硫代硫酸钠试液6个月
硫氰酸铵试液6个月
硫酸亚铁试液本液应临用新制。
硫酸钾试液6个月
硫酸铜试液6个月
硫酸镁试液6个月
稀硫酸镁试液6个月
氯化亚锡试液6个月
氯化钙试液6个月
氯化钡试液6个月
氯化钴试液6个月
氯化铵试液6个月
碘化钾试液6个月
碘化钾碘试液6个月
溴化钾溴试液6个月
碱性枸椽酸铜试液6个月
碱性酒石酸铜试液6个月
碱酸焦性没食子酸试液6个月
碳酸氢钠试液6个月
碳酸钠试液6个月
碳酸钾试液6个月
碳酸铵试液6个月
醋酸钠试液6个月
醋酸铅试液6个月
醋酸铵试液6个月
醋酸铜试液6个月
靛胭脂试液6个月
亚硝基铁氰化钠液6个月
标准氯化钠液临用前精密量取贮液10ml,用滤纸过滤时滤纸是含有氯化物;可预先用含有硝酸的水溶液洗净后使用。
储备液6个月
结晶紫指示液6个月
饱和硫化氢水溶液3个月
标准铅液临用前精密量贮备液10ml。
(配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅储备液6
个月
黄色调比色液(1号基础液) 12个月
浊度标准贮备液本液置冷处避光保存可在两个月内使用,用前摇匀。
甲基红的乙醇液6个月
亚甲兰液6个月
氢氧化钠液6个月
黄色2号标准液(基础液)12个月
比色用氯化钴液(贮备液)12个月
盐酸液6个月
铁氰化钾液6个月
三氯化铁液6个月
酚酞指示液6个月
氯化钠溶液(贮备液)12个月
标准硫酸钾溶液(贮备液)12个月
氯化钡溶液6个月
比色重铬酸钾液(贮备液)12个月
硫氰酸铁液6个月
1%吐温80 3个月
铁标准液临用前精密量取贮备液10ml (贮备液)12个月
硫代硫酸钠液6个月
淀粉指示液6个月
硫酸镁硫代硫酸钠液6个月
溴甲酚紫液6个月
溴麝香草酚兰液6个月
碘液6个月
碘化钾溶液6个月
硫酸液6个月
亚硫酸钠液6个月
百里香酚酞的乙醇溶液6个月冰醋酸--醋酐混合液6个月
硝酸液6个月
--酚酞苯指示剂6个月
硫氰酸铵液6个月
铂钴标准溶液6个月
二氧化硅浊度溶液(原液)12个月氢氧化铝悬浮液(原液)12个月硫酸铁铵指示剂6个月
氢氧化钾乙醇液6个月
溴酸钾液6个月
乙二胺四醋酸二钠液6个月
硝酸汞液6个月
锌液6个月
乙醇溶液6个月
硫酸铁铵试指示液6个月
稀硫酸铁铵溶液6个月
盐酸溶液6个月
人工胃液临用新配
人工肠液临用新配
稀盐酸液6个月
乙氧基黄叱精指示液6个月亚硝酸钠液6个月
盐酸氯化钾液6个月
没食子酸的乙醇溶液6个月重络酸钾液6个月
茜黄酸钠指示液6个月
乙醚液6个月
溴酚兰指示液6个月
乙二胺四醋酸二铵6个月二甲酚橙指示液6个月
甲基红指示液6个月
氯化铵液6个月
铬黑T指示液6个月
三乙醇胺液6个月
硼酸溶液6个月
淀粉混悬液6个月
氯化锌液6个月
硫酸铜溶液6个月
醋酸钠溶液6个月
碳酸钠溶液6个月
硫酸钠液6个月
含锌碘化钾淀粉指示剂本液应在凉处密闭保存。
2个月
甲基红--亚甲兰混合指示液3个月
甲基红--溴甲酚绿混合指示液3个月
甲基橙--亚甲兰混合指示液3个月
PS：溶液期限仅供参考，具体储存日期与保存环境有很紧密关系。
在未判断是否过期前，希望大家不要使用储存日期过久溶液与试剂。