柠檬酸高产菌株选育
柠檬酸
建国以来柠檬酸发酵工业回顾一、行业简介1、行业的历史柠檬酸的研究和生产已有300年的历史。
早在1784年，瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶出固体柠檬酸。
1838年，由Liebig鉴定出它是一种含有一个羟基的三元酸。
随后，在1860年意大利开始从果汁中用添加石灰乳的办法得到柠檬酸，从而进行了工业化生产。
到1913年,Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸。
1916年，美国农业部华盛顿化学局微生物研究室主任Thom和同事Currie对黑曲属的许多菌株进行过普查，发现很多菌种能产柠檬酸。
1919年，比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法生产柠檬酸。
1923年，美国Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸。
1938年，Perquin在荷兰发表论文，他将黑曲霉培养于低pH的含硫酸锌、氯化钾和氯化铵的糖溶液中获得了一些柠檬酸，对深层培养法的pH控制，提出了有力的证据。
1944年，Szucs应用纯蔗糖，在9d内发酵柠檬酸，可得到92%的产率，但因时间太长，未能投产。
1952年，Buelow和Johnson等用150g/L蔗糖培养液通入无菌空气，通气量增加，柠檬酸发酵时间可缩短，这对柠檬酸发酵条件控制，有了进一步地认识。
1952年，美国Miles公司，首先成功地采用深层发酵法工业化规模生产柠檬酸。
解放前我国柠檬酸工业是个空白. 20世纪60 年代, 天津工业微生物研究所、上海工业微生物研究所首次采用木薯为原料发酵生产柠檬酸, 并筛选培育出优秀的耐高糖、耐高柠檬酸并具抗金属离子的黑曲霉高产柠檬酸菌株, 成功实现了产业化。
1968年我国第一家以淀粉为原料深层发酵柠檬酸成功投产的厂是上海酵母厂。
为我国有机酸产业的形成与发展奠定了基础。
而后, 两个研究所又不断推出适合不同原料的高产菌株和新配方, 使浓醪高发酵指数的深层发酵工艺不断完善, 全行业通过积极引进和消化国内外先进技术和装配, 不断进行自主创新, 形成了具有中国特色的浓醪高发酵指数的深层发酵新工艺, 使得中国很快在20世纪末变成柠檬酸生产大国。
He_Ne激光复合诱变选育柠檬酸高产菌
收稿日期:2007 02 27作者简介:张建军(1970 ),男,新疆大学理论物理专业硕士生,讲师,从事离子束生物工程研究。
e mail:zjj -tea@ 。
第25卷 第2期2007年4月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.25 No.2Apr.2007文章编号:1007 7383(2007)02 0225 04He Ne 激光复合诱变选育柠檬酸高产菌张建军,甘秀英,侯 娟,黄旭初(石河子大学师范学院物理系,新疆石河子832003)摘要:柠檬酸产生菌黑曲霉经多次物理、化学诱变处理后会对其产生一定的抗性,在菌种改良过程中不易得到优良高产菌株。
为此,以黑曲霉(Aspergillus niger )28#为出发菌株,采用金属盐类化合物 LiCl 处理黑曲霉的孢子,然后用He Ne 激光辐照对柠檬酸发酵菌黑曲霉进行复合诱变。
结果表明,各实验组发生了明显的不同变化,说明该方法能诱发黑曲霉细胞的遗传变异,适合于菌种的改良选育。
研究采用玉米粉为原料,摇瓶发酵时间72h,发酵温度35 1 ,通过溴甲酚绿指示性平板辅助筛选和摇瓶发酵,筛选出了3株柠檬酸发酵高产突变菌株,柠檬酸产酸率提高了19.29%,转化率从87.07%提高到103.86%,其中菌株L42遗传相对稳定,可作为进一步诱变筛选的出发菌株。
关键词:黑曲霉;He Ne 激光;复合诱变;选育中图分类号:Q933 文献标识码:A目前,用于工业化生产柠檬酸的黑曲霉菌种大都经过物理和化学诱变剂的处理,不同程度地增加了黑曲霉对一些诱变剂的抗性,若再使用同样的方法则很难对现有菌种进行改良。
激光作为一种新的诱变剂,对生物体会产生热、压力、光、电磁场等多种效应,已广泛应用于微生物诱变育种,是一种在微生物遗传育种领域中极有应用前景的新型诱变因子。
朱宏莉等[1]利用He Ne 激光(波长632.8nm,功率15mW)诱变果胶酶产生菌的原生质体,获得了突变株ZH gA,其酶活为出发菌株的1.6倍。
发酵工厂菌种选育的具体方法与实验设计
食品发酵与酿造工艺学题目：发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计年级：xxxx级专业：食品科学与工程姓名：xxx学号：xxxxxxx柠檬酸的菌种选育的具体方法与实验设计微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。
而自然界现有的菌种由于其产量较低，不能直接用于生产，目前，发酵工业生产中所使用的菌种，都是经过人工选育的优良菌种。
本篇以柠檬酸的菌种选育为例，阐述发酵工厂菌种选育的具体方法与实验室设计。
柠檬酸是有机酸中第一大酸，由于物理性能、化学性能、衍生物的性能，是广泛应用于食品、医药、日化等行业最重要的有机酸。
我国的柠檬酸产业，较早地进入了国际市场，经过多年的努力和奋斗已成为世界第一的生产和出口大国。
特别是经历了近几年的竞争与整合，全行业的面貌大为改观。
所以柠檬酸的菌种选育对于整个行业和国家来说都尤为重要。
一．柠檬酸的菌种的具体选育方法1.取样：从腐烂水果上分离出一株柠檬酸产生菌——黑曲霉。
2.培养基的制备：2.1 分离培养基(%)：甘薯粉15%，柠檬酸l0%分装在试管内，1公斤/厘米²压力灭菌20分钟。
2.2 生长培养基：4°Be’麦芽汁，2%琼脂。
l公斤/厘米²压力灭菌15分钟。
2.3 种子培养基(%)：甘薯粉8%，献皮l%。
每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米²压力灭菌30分钟。
2.4 发酵培养基：12%甘薯粉，每500毫升三角瓶装100毫升，l公斤/厘米²压力灭菌30分钟。
3.菌种培养方法：采用迥转摇床，193转/分，偏心距25毫米，31℃振荡培养，菌丝接种，接种量5%(v/v)，培养5天。
4.菌种的分离与筛选：采用酸性滤纸法，把少许试样混入分离培养基中，摇匀，倾入无菌培养皿内(内有2—3层滤纸做支持物)，31℃培养4—5天，把长出的单菌落挑入生长培养基斜面上，31℃培养4—5天，即可见到抱子。
黑曲霉产柠檬酸菌种最优发酵条件探究_胡恺夫
实验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ｋ1 Ｋ
2
Ｋ3 ｋ1 ｋ2 ｋ3 Ｒ
表 3 第 1次正交实验结果分析
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ 2112产酸量 /( )
1
1
1
1
1.5 6
1
2
2
2
0.8 7
1
3
3
3
3.8 0
2
1
2
3
2
2
3
1
0.7 6 0.7 6
2
3
1
2
0.9 9
3
1
3
2
1.2 9
3
2
1
3
1.0 1
3
3
表 4 第 2次正交实验 2112培养基 Ｌ9(34)的因素水平表
Ａ淀粉 水平
Ｂ(ＮＨ4 )2ＳＯ4
ｐＨ
/( )
/( )
麸皮 /( )
1
22
0.3
3.5
0.6
2
19
0.2
4.0
0.4
3
16
0.1
4.5
0.2
第 7卷 第 6期
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
· 149·
表 5 第 2次正交实验 2112结果及极差分析
择各因素的相应水平 , 设计正交实验表 , 进行多次 出 , 实验室保藏的 11株产柠檬酸菌种在玉米淀粉
正交实验以探索菌种产酸的最优条件 。
水解糖培养基中的产酸量均高于葡萄糖和蔗糖的 ,
3.3.3 发酵稳定性实验
选取产酸率较高的 2112菌株为正交实验用菌种 。
对获得的菌种及其最优发酵条件进行多次发酵 3.2 正交实验
苹果渣基质柠檬酸高产菌株选育
微 生物 学 杂 志 ２０ 年 １ 月第 ２ 卷第 ６ ０８ １ ８ 期
ＪＵ Ｎ ＬＯ ＩＲ ＢＯ Ｏ ＹＮ ｖ ２０ ｏ ２ ｏ６ Ｏ Ｒ Ａ ＦＭ Ｃ Ｏ ＩＬ Ｇ ｏ． ０８ １ ８Ｎ ． Ｖ ．
苹 果 渣 基 质柠 檬 酸 菌 株选 育 局严
杨保 伟 ，盛 敏 ，来航 线ｎ ，岳 田利
Ｆ ２ 、Ｇ６ Ｆ ３ Ｇ ３ Ｆ ２ 、 Ｇ ０等 ４株 菌 苹 果 渣 基 质 柠檬 酸 产 生 能 力较 高 ， 在 ４种 不 同发 酵 基 质 中产 酸 性 能 稳 定。４ 株 且 菌 分别 经 紫 外 线 和“ｃ — 线 诱 变后 得 到 的 正 向 突 变株 柠 檬 酸产 率 均 显 著提 高 ， 变株 中 Ｆ ２ 一５ ｕ 发 ０ 射 突 Ｇ ６ ｌ ４（ Ｖ） 酵 苹 果 渣 后 柠 檬 酸 产 率 最 高 ， ｌ ． ２ ， Ｇ ３ １ － （ 发 酵 苹 果 渣 酶 解 液 后 柠 檬 酸 产 率 最 高 ， ２ ７ ｇ 达 】３ ％ Ｆ ２ —３３ ） 达 ．３ｍ ／ ｍ 均 高 于 现 有研 究报 道 ， Ｉ ， 可作 为 不 同 类型 苹 果 渣 基 质 柠 檬 酸 发 酵 用 菌种 。 关 键 词 苹 果 渣 ； 曲霉 ； 檬 酸 ； 黑 柠 菌种 选 育 中 图分 类 号 Ｔ ２ １３ Ｓ ０ ． 文 献标 识 码 Ａ 文 章 编 号 １ ０ ７ ２ （ ０ ８ ０ ０ ２ ０ ０ ５— ０ １ ２ ０ ） ６— ０ ４— ６
ｓ ｌ ｉｎ ａ ｅｍ ｅ ａ ｉｎ ｓ ｂｓｒ ｔ ｏｕｔ ｓｆｒ ｎｔｔｏ ｕ ｔａ ｅ．ａ ｂｔｉ ｄ ｃｔｉ ｃｄ ｈ ｇ —ｙｅ ｄｎｇｓｒ ｉ ｒ ｃ ｅ ｎ ｄ ｂｒｅ ｉ ｇ ａｔｒｍｕａ ｏ ｎｄ４ ｏ ａｎｅ ｉ ｃａ ｉ ｉ ｈ ｒ ｉｌ ｉ ｔａｎｓｗｅ ｅｓ ｒ ｅ ｅ ｅ ｄ ｎ ｆｅ ｔ－ ｔ ｎ． Ｔｈ ｅ ｕｌ ｈ ｗｅ ｈａ ｌ １ Ａｓ ｔａｎ ｒ ｗ ｗｅ ｌｉ ｅ ｍｅ ｔｔｏ ｓ ｂｓｒｔ ｓ ｈ ｗｅ ｅ ． ｄｆｅ ｅ ｔｓｒ ｉ ａ ｉ ｏ ｅ ｒ ｓ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ｔａｌ ７ ｎ ｓｒ ｉｓ ｇ ｅ ｌ ｎ ４ ｆ ｒ ｎ ａｉｎ ｕ ｔａ ｅ ， ｏ ｖ ｒ ｓ ｉ ｒ ｎ ｔａｎ ｈ ｄ ｄｆｅ ｅ ｔａ ｉ ｐｒｄｕ ｉ ｐａ ｌｔ ｉ ｔｅ ａ ｆｒ ｉ ｒ ｎ ｃ ｄ ｏ ｃｎｇ ｃａ ｂｉｉ ｙ ｎ ｈ ｓ ｍｅ ｅｍｅｎａ ｉｎ ｕ ｓｒ ｔ ｔｔｏ ｓ ｂ ｔａｅ． Ｃｉｒｃ ｃ ｄ ｔｉ ａ ｉ ｐｒ ｄ ｃｉ ｇ ａ ｂｉ ｔ ｏ ｏ ｕ ｔｎ ｃ ｐａ ｌ ｙ ｆ ＦＧ１ ｉ ７，
L乳酸高产菌株的诱变选育
!选 出 十 株
!选
#$%$1
表型的出现， 表型的改变落后于基因型改变的现象， 称为表型延迟， 为了克服表型延迟， 必须将诱变处理 的菌液进行中间培养，即将一定量的菌液接入完全 液体培养基中培养过夜。 玻璃管初筛平板的制作 将 直 径 为 #%** 的
! !选
!选 出 十 株
每株三瓶 !复筛，
#$%$2
复筛。前者以量 （选 留 菌 株 的 数 量 ） 为主， 后者以质 （测定数据的精度） 为主。初筛的要求是根据在平板 上的直观反应挑选高产菌株。所谓平板上直观反应， 是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示剂
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$** $** (* 4/ /* 4* )E* )* -* #* !* $* * * ! 图$ 存活率 （5） 存活率
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孢子配制成 #’( 个孢 子 ) *+ 的 悬 浮 液 ， 取 #’*+ 置 于 培养皿中， 用磁力搅拌器搅拌的过程中， 用紫外灯照 射 ,*-. ， 照射距离 &’/*。 将诱变菌液在琥珀酸平板、 高锰酸钾 0 溴化钾平板、 高葡萄糖平板、 高乳酸平板、 纯乳酸平板上涂布分离，挑选在琥珀酸平板上生长 慢、 菌落小的， 耐高葡萄糖、 高乳酸且不分解利用乳 酸的产乳酸的菌珠进行斜面保藏。 中间培养 突变基因的出现并不意 味 着 突 变
纯乳酸平板 ・ $&$* ， =6":, >8#: 乳酸
・ $&$#+ ， ?@":, >8#: 葡萄糖
$&$,, ，
乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸 ， 广 泛 存在于人体、 动物体、 植物和微生物中， 乳酸按其旋 （( ） —乳 酸 ， （/ ） —乳 酸 和 -.—乳 酸 光性可分为 . 三种。 人体只能代谢利用其中的 .—乳酸， 因此， 世界 卫 生 组 织 提 倡 使 用 .—乳 酸 作 为 食 品 添 加 剂 和 内 服 药， 取代目前普遍使用的 -.—乳酸。此外， .—乳酸， 农业和化 .—乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、 学工业。尤其近几年， 人们利用 .—乳酸聚合生成的 聚 .—乳酸制造生物降解塑料、 绿色包装材料及农用 薄膜， 用以解决日益严重的环境污染问题， 引起了世 界的广泛关注， 应用前景非常广阔。 以 本 课 题 采 用 011.()2+ 米 根 霉 为 出 发 菌 株 ， 紫外线为诱变剂，经筛选得到一株高产乳酸且耐高 渗并且不分解利用乳酸的正向突变菌株。
柠檬酸发酵微生物
• 3.真空冷冻干燥保藏法（广泛采用的方法）
• 简称冻干法； • 通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子 悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结， 并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完 全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造 成无氧真空环境，最后 • 置于低温下，使微生物 • 处于休眠状态，而得以 • 长期保藏。 • 使孢子始终处于低温、 • 干燥、缺氧的条件下。 • （1~10年）
• 4.液氮超低温（-196 ℃ ）保藏法
• 以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温 （-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞 从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内 的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水 凝结成冰晶而使细胞损伤。 • 适用于菌种的长期保存，-196 ℃远远低于微生物新 陈代谢作用停止温度（-130 ℃ ），此时菌体代谢 活动已停止。
2.黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征
• ①能耐高浓度柠檬酸（15%以上），而不利用和分 解柠檬酸。 • ②耐高浓度葡萄糖（18-20%）；能产生和分泌大量 的酸性α -淀粉酶和酸性糖化酶，糖化酶最适作用 pH在4.0~4.6，最适温度为60~65 ℃。
• ③能利用淀粉质、糖蜜、葡萄糖母液等原料 发酵生产柠檬酸。
（二）柠檬酸生产菌的诱变育种
诱变育种： 在人为地条件下,利用物理,化学等因素, 诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和 微生物地新品种，进而设法从大量的变异群 体中筛选出优良的突变株的过程。
• 诱变剂-能提高菌种突变率的物质。 • 物理诱变剂：UV、氮离子注入、x射线等（染色体 水平上导致突变） • 化学诱变剂：（导致更细微的基因水平的突变） • 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、 DES硫酸二乙酯 • 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚 硝基-N-乙基脲烷（NEU） • 亚硝酸（改变核酸结构和性质） • 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、 吖啶橙等。
柠檬酸1
要充足氧的供应，保证更多的NADH2通过侧性呼吸链将H2交
给O2生成CO2和H2O，使呼吸产生的ATP减少，解除ATP对PFK酶 的反馈抑制，使EMP途径代谢流增大，丙酮酸和草酰乙酸生
成水平提高，柠檬酸产率提高。
G
G-6-P
(磷酸果糖激酶)
柠檬酸
I ,NH4 A
+
1.6－二磷酸果糖
丙酮酸
(丙酮酸羧化酶)
白、核酸和脂肪含量明显减少，而氨基酸和铵离子水
平升高（解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制），丙酮酸 和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。
4、氧对柠檬酸积累的调节
黑曲霉中除具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链
。标准呼吸链氧化时产生ATP，反馈抑制PFK酶，侧系呼吸链 不产生ATP。缺氧时，侧系呼吸链失活，导致柠檬酸产量急 剧下降。因此，在柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定
4
2014-6-5
二、国人的节奏—后来居上
1968年：上海酵母厂以淀粉为原料深层发酵工业化产生柠檬酸；同时，适用于 多种不同培养基质（淀粉、木薯、糖蜜等）的菌株不断的被选育出来； 1995年：开发了利用玉米渣发酵柠檬酸的新工艺； 我国柠檬酸发酵技术处于世界领先水平。如安徽丰原生化公司，柠檬酸生产能 力达18万吨，居世界第一位，占世界柠檬酸生产额的17%。另外，山东柠檬酸生 化有限公司的生产规模也是相当的大。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年 产能力约100万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，近两年，出口量更是 超过国内总产量的90%，出口依赖严重。出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重 超过60%。2006年柠檬产量达到66万吨，出口60万吨；2007年，国内柠檬酸及 柠檬酸产量76万吨，共出口70.83万吨，2006年和2007年两年国内柠檬酸出口超 过总产量的90%，出口依赖严重。全球柠檬酸的年需求量约为130万吨左右，且 以年5%-7%的速度递增。2007年，全球柠檬酸需求继续以3%的幅度增长。随着 中国人民生活水平的提高，也带动了柠檬酸国内需求的大幅度增加。
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柠檬酸高产菌株的选育
222011********* 刘亚超 2011级生物技术
关键词：黑曲霉、T21紫外诱变、发酵
摘要：黑曲霉作为柠檬酸的产生菌，来进行相关的实验内容。
为了进一步提高柠檬酸生严菌种对糖的转化效率和产酸速率，有很多方法，比如改善黑曲霉生长的温度、pH、溶氧量、限制金属离子等培养条件，同时也可以对黑曲霉进行诱变处理。
目前国内柠檬酸菌种选育，物理诱变常选用紫外、60Co-γ射线等，化学诱变多选用DES及亚硝基胍等[3]。
本次实验设计除了优化黑曲霉产柠檬酸的培养条件之外，还要将黑曲霉菌种进行紫外诱变处理。
引言：柠檬酸的用途很多，比如用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，也是化学中间体。
柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血压和心肌梗死。
所以可以起抗凝血作用。
柠檬酸也有保健的作用，比如柠檬酸能够帮助机体彻底排出血液中毒素。
所以筛选出优质的高产柠檬酸菌株，有很重要的意义。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌种
以实验室平板上已有的黑曲霉(Aspergiltus niger)为出发菌株（经多次平板划线分离纯化所得），制备种子液，将发酵好的种子液按液体发酵培养基体积的10％接入已灭菌的发酵培养基中，于30℃左右在200~250rpm培养4~5d。
1.1.2培养基
分离菌种培养基为PDA培养基，初筛培养基为2％淀粉查氏培养基，发酵培养基为废弃苹果榨汁培养基。
1.1.3 试剂及仪器
3-5二硝基水杨酸、结晶酚、酒石酸钾钠、722型紫外分光光度计，组织捣粹机等。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离纯化
用黑曲霉出发菌株，通过平板划线分离的方法进行分离纯化，培养三批，得到纯化的黑曲霉单菌落。
1.2.2 初筛
用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子于装有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡，4层纱布过滤并稀释计数成不同的梯度，制成孢子悬液。
取各个不
同梯度的孢子悬液1 mL注人2％淀粉查氏培养基平板中涂布，28℃，培养3 d
-KI试剂，测量菌落产生的透明圈大小并记录下数据。
后，向培养基中滴人I
2
1.2.3 复筛
将初筛所得透明圈较大的菌株接入废弃苹果榨汁培养基中进行培养，待发酵一段时间后，通过检测发酵液中的总糖、还原糖和柠檬酸的产量的量进一步筛选高产柠檬酸的黑曲霉菌株。
柠檬酸含量检测采用GB／T8269～1998中柠檬酸的检测方法[4]。
总糖和还原糖的检测用3-5二硝基水杨酸法[5]。
1.2.4 黑曲霉的诱变
对初筛复筛后所得的高产菌株进行了T21紫外诱变。
操作过程为：取筛选的菌种的斜面，加入无菌水约2—3 mL洗下孢子并加入100 mL无菌水带玻璃珠的三角瓶中打散孢子，4层纱布过滤，获得孢子悬液，调整孢子浓度至约3～5个／mL，取l mL涂布查氏培养基平板，置紫外箱中，照射45 s，然后置30℃培养箱中培养6—7 d。
从平板上挑取菌落最大的菌株采取复筛时的的方法做发酵柠檬酸的检测[6]。
1.2.5 高产菌株的培养
经上面的方法得到高产菌株后，将之接种到平板培养基上多培养几代，再测定柠檬酸产量，可以测出菌株有没有衰退或出现回复突变。
并且通过测定比较可以看出哪个诱变后的菌株综合各方面来讲生产能力较好。
这样就能得到高产的黑曲霉菌株了。
2.黑曲霉的最适发酵条件
用原来分离纯化得到的菌株参照理论上的最适合的发酵条件进行调整，在不同的发酵条件下进行培养，用以找到适合的发酵条件。
影响黑曲霉发酵的因素有：温度、pH、培养时间等等因素，都要考虑进去。
3.实验方案中可能会有的问题及解决方法
可能没有现成的废弃苹果榨汁培养基，我们可以查找相关文献，看有没有方法可以自己配制。
在进行紫外诱变时可能致死率过高或过低，致死率过高菌株存活量太小，致死率低的话突变的菌株数目也会变小。
所以可以先进行第一次突变培养，若致死率不合适可以调整紫外诱变的时间来重新诱变培养。
黑曲霉最适发酵条件的确定中相关因素过多，要完整地测一遍费时费力，比较难以完成。
所以可以通过设定正交实验来完成，这样要测的数据量就大大减少了。
参考文献:
[1] Meyrath J. Process Biochem, 1967, 2(October): 25.
[2] 陈陶声等. 有机酸发酵生产技术. 北京：化学工业出版社，1991：31.
[3] 洪厚胜,刘辰,薛业敏等.激光复合诱变选育木薯原料柠檬酸高产菌[J].食品与发酵工业. 2003, 29 (1).
[4] 中华人民共和国国家标准. 柠檬酸的检测方法[P]. 中国专利: GB／T8269, 1998．
[5] 张龙祥, 张庭芳. 生化实验方法和技术[M]. 北京: 人民教育出版社, 1982. 3-5.
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[7] 赵琴, 李红, 魏婷婷等. 柠檬酸高产黑曲霉菌株选育与发酵新底物研究[J].重庆师范大学学报(自然科学版), 2008, 25(1): 79-82.
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[9]宇佐美昭次，日《化学与工业》杂志，17；727；1964
[10]高山健一郎；日本公开特许，77—105285,1977
[11]高山健一郎，日本公开特许，74—118890,1974。