透明质酸高产菌株选育研究
透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究
河北农业大学硕士学位论文透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究姓名：刘金龙申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：张伟20070609河北农业大学硕士学位（毕业）论文由图８可以看出，从０时刻起发酵液中溶氧开始下降，从第８小时ＤＯＴ开始急速下降，直至降为０，此时由于菌体生长进入对数期，耗氧量增加，使得发酵液中溶氧急剧下降，从第１０小时一直到第１６小时，ＤＯＴ值一直维持在０水平上，推测此时的通氧和搅拌水平已无法满足菌体急剧生长所需的供氧量，而ＤＯＴ值在第１６小时后逐渐回升，推测可能是由于发酵液黏度过高导致发酵液不能有效混匀，部分气泡滞留其中（见图９），这时的溶氧电极读数已不能代表发酵液中的真实的溶氧情况了．田９拍摄于发酵１６ｈＦｉｇ．９Ｓａｔｅｎａｔｔｈｅｌ６ｔｈｈｏａｒｄｕｒｉｎｇｔｈｅ∞ｕｍｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ本试验采取以下４种不同策略对搅拌和通氧的调控进行了尝试，其他条件均一致，４种策略如下，Ｉ整个发酵过程采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率。
ＩＩ整个发酵过程采取６００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率。
Ⅲ整个发酵过程保持５Ｌ／ｍｉｎ的通气速率；采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，当ＤＯＴ值降至０时采取６００ｒ／ｒａｉｎ的搅拌速度一直到发酵结束．Ⅳ整个发酵过程保持１０Ｌ／ｒａｉｎ的通气速率：发酵起始阶段采取３００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度，当ＤＯＴ值降至０时采取６００ｒ／ｍｉｎ的搅拌速度一直到发酵结束。
整个发酵过程中，定期取样检测ＨＡ的含量，结果如下图１０和表１１所示：河北农业大学硕士学位（毕业）论文具体操作为将上一步中得到的沉淀离心后，抽走上清，向沉淀物中加入高浓度的氯化钠溶液，开动搅拌，使沉淀溶解。
这一步骤的关键点是氯化钠浓度的确定，本试验选择不同浓度的氯化钠进行了尝试，结果如下表所示（ａ、ｂ、Ｃ、ｄ、ｅ代表一组呈逐级递增的等差数列的一组数据）。
当氯化钠的浓度达到Ｃｍｏｌ／Ｌ时，ＨＡ的收率为８８．１％，在此基础上再增加氯化钠的浓度，收率提高并不明显，因此选择ｃｍｏｉ／Ｌ为适宜氯化钠浓度。
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况
透明质酸的微生物发酵法生产与应用概况作者：李萌季永甜等来源：《湖北农业科学》2013年第13期摘要：透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的高分子黏多糖，广泛地存在于动物组织中，具有独特的生理特性，在许多领域得到广泛的应用。
目前，透明质酸的生产方法主要有提取法、微生物发酵法和人工合成法。
对微生物发酵法进行了概述，对透明质酸在化妆品、保健品和医学医疗领域的应用进行了简要介绍，并对透明质酸的生产和应用前景进行了展望。
关键词：透明质酸；微生物发酵法；育种中图分类号：Q538；TQ920 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-2980-04透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等从牛眼玻璃体中提取分离得到的一种大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。
透明质酸是由2 000～25 000个通过β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键交替地结合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖组成的均匀重复的线性葡糖胺聚糖[2]。
透明质酸是胞外基质（Extracellular matrix， ECM）的重要组成部分[1]。
近来的研究表明，透明质酸不仅广泛存在于细胞间的胞外基质中，还存在于细胞内，主要集中分布在新生细胞的胞浆和细胞核中[2]。
除了在玻璃体中外，透明质酸在关节滑液和表皮细胞间隙中的含量也十分丰富，从数量上看，50%以上的透明质酸存在于皮肤的真皮和表皮中，约35%存在于肌肉和骨骼中。
目前认为透明质酸主要是存在于软结缔组织中的惰性空间填料中，在组建蛋白多糖复合物的过程中起着重要的作用[2]。
1 透明质酸的性质在电子显微镜下，观察到透明质酸分子呈线性单链结构，并在水溶液中扩展成随机的线圈状结构，线圈的直径约为500 nm。
透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离，形成阴离子，等空间距离阴离子之间的相互排斥使其分子在水溶液中处于松散的扩展状态，占据了大量空间，故可结合多于本身1 000倍的水[3]。
透明质酸生产菌的分离鉴定
一
氨基 丁酸 （ａ ａ—ａ ｉ ｂ ｔ ｉ ａｉ， ｇｍ ｍｎ ｕｙ ｃ ｃ 简称 Ｇ Ｂ 是 ｏ ｒ ｄ Ａ Ａ）
记忆及 提高肝 、 肾机能等生理 活性 Ｊ 。自 ２ ０世 纪 ８ Ｏ年代 中 期开始 ， 富含 ．一氨基 丁酸的食品开发受到重视 ，９７年 日本 ｙ １８ 学者小宾靖 弘首次发现红曲中也存在 Ｇ Ｂ Ａ Ａ。随后的研究发 现， 很多红曲霉均能产生 Ｇ Ｂ 因此 开发 富含 Ｇ Ｂ Ａ Ａ， Ａ Ａ的红 曲 保健品具有 良好 的前景 。 。２ ０世 纪 ９ Ｏ年代 ， ｔ Ｅ本研 制 的 “ 群势” 曲因富含 Ｇ Ｂ 红 Ａ Ａ而具有很 强的降压功能 ， 并获得 了
液 ， Ｂｔ ｒ 用 ｉｅ —Ｍｕ 法 测 定 Ｈ ｔ ｉ ｒ Ａ的 含 量 。
１ １１ 材料 ．． １１２ 试剂 ．．
采集于成都市奶牛场牛鼻黏膜 。 革兰氏阳性菌 Ｄ Ａ提取试剂盒（ Ｎ 杭州新捷生物
技术有限公司）Ｐ Ｒ反应试剂盒（ ａ ａ ａ ，Ｃ ＴＫ Ｒ 宝生物工程大连有限 公司）Ｐ Ｒ纯化试剂盒 （ ． ． 。 ．ｙｌ ｕｅｋｔ ， ，Ｃ Ｅ Ｚ Ｎ Ａ ｃｃ ｅ—ｐｒ ｉ 细菌 １Ｓ到 ８株 产 ｙ一氨基 丁酸较 多 的菌株 ， 量最 高 的 ２ 产 ５号 菌株 一氨基丁 酸产 量达 到
５２５ｍ／ ， 诱 变前 的菌株提 高 ７．９ ， ．５ ｇｇ 比 ２６％ 增产明显。经过 ５ 的传代培 养 ， 一 代 以 氨基 丁酸含量 为指标进行 检测 ， 表明该菌株遗 传稳定性较好 ， 以作为后 期规模化 生产 的优 良菌种 。 可 关键词 ： 曲霉 ； 红 诱变 ； 一氨基 丁酸
发酵法生产透明质酸
发酵法生产透明质酸透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种大分子的粘多糖,是一种由-D-N -乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元,β-1，4-糖苷键连接成的一种链状高分子粘多糖。
其分子量在几十万到几百万之间，又称糖醛酸，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，为目前所公认的最佳保湿成分，在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域有广泛的应用。
透明质酸的提炼的方法有三种：组织提取，微生物发酵和化学合成。
组织提取法和化学合成法的成本高，产量低，受原料资源限制，不能满足市场需求。
而微生物发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发先进的微生物发酵法生产HA的技术十分必要。
目前HA产业前景广阔，发酵法己成为HA生产的主流工艺，而发酵法生产HA的工艺仍需进一步完善。
微生物产HA的研究可以追溯到上个世纪30年代，1937年，Kendall发现链球菌可以产生HA，后来发现主要是一些A群和C群链球菌，它们具有合成与代谢以HA为主要成分的荚膜的能力。
随后很多人进行了大量的研究。
研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生HA。
随后经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵技术与设备，HA的微生物发酵法被建立和应用起来。
目前多选用链球菌、乳酸球菌类等（因此以下均以链球菌举例说明）。
日本用发酵法生产了HA制剂．并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动力学等非临床实验和临床实验。
结果表明，发酵法生产的HA无局部及全身毒副作用、安全性高、疗效确切。
发酵法生产透明质酸主要包括两部分：发酵部分和下游提取工艺部分。
发酵法生产HA的质量主要取决于菌种、培养基和分离提纯工艺的选择。
一.发酵部分：经过阅读与分析文献，我个人将发酵部分划分为以下几个模块：1.菌种的筛选2.菌种的诱变3.培养基配方的优化4.菌株的最佳培养条件首先以链球菌制备HA的过程为例简单介绍一下发酵法生产透明质酸的基本流程：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑出不溶血、不含HA酶的高产率菌株。
发酵法生产透明质酸工艺研究
１ ． 菌株 兽疫链球菌 ： ．１ １ 江南大学提供菌种 ， 经诱变得到高产菌株 ， ：Ｈ ３ １ ． 编号 Ｌ ０ ０８ １１ 培养基 葡萄糖、 ．． ２ 酵母粉 、 硫酸镁 、 磷酸二氢钠、 维生素 Ｂ ， ｌ优化方案配成培养基。
微生物发酵提取透明质酸的提取工艺流程
微生物发酵提取透明质酸的提取工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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兽疫链球菌发酵法生产透明质酸
吉林大学
硕士学位论文
兽疫链球菌发酵法生产透明质酸
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：微生物与生化药学
指导教师：滕利荣;刘兰英
20031201
吉林大学硕士学位论文兽疫链球菌发酵法生产透明质酸于酶解过程中，仍有部分细胞壁残留，而裸露的质膜部分则相互粘连。
Ｆｉｇ．４ｍｗｉｌｄｂａｔｅｒｉａｓｂｅｆｏｒｅ
ＦｉｇｓＴｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｆｔｅｒｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ
３．２激光诱变
激光可产生光、热、压力、电磁场等效应，作用于微生物细胞时，生物分子吸收光子或在激光的电磁场作用下分子内发生能级跃迁，达到一定的振动能并产生自由基，引起生物分子的分解、断裂，导致分子激活或损伤，在修复过程中有可能发生变异。
原生质体对激光敏感性较强，可在较小剂量下产生突变，得到较高正突变率。
由图６可见，随激光照射时间的延长，每一种功率密度下致死率均上升。
当照射时问为３００ｓ，功率密度为４０ｍＷ／ｃｍ２时，致死率为９９．８８％。
将存活的菌株经发酵培养，筛选透明质酸高产菌株。
兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸论文地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容学号：08109117常州大学硕士学位论文兽疫链球菌的改良及其发酵生产透明质酸2010年 3 月Improved Streptococcus Zooepidemicus For ProducingHyaluronic Acid By FermentationA Dissertation Submitted toChangzhou UniversityBySun Xiao-HuiOrganic ChemistryDissertation Supervisor: Prof. Wang Li-QunMarch，2011常州大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。
本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权的说明本学位论文作者完全了解常州大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属常州大学。
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（ ） 子培 养基 ３种
葡 萄 糖 １ ． ， 母 膏 １ ． ， 肉 膏 １ ． ， ０ ０ｇ 酵 ００ｇ 牛 ０ ０ｇ Ｍｇ Ｏ４・７ ． ， Ｏ４ ． ， 蒸 馏 水 至 Ｓ Ｈ２ ２ ０ ｇ Ｋ２ Ｏ ＨＰ ０ ｇ 加 ２ １０ ０ ０ｍＬ， ｐ 值 至 ７ ０ １ １ 下 灭 菌 ２ ｎ 冷 却 调 Ｈ ． ，２ ℃ ０ｍｉ， 至 常温 ， 在无 菌条 件 下加 入 １ 小 牛血 清 。 ０
亿 与 生 物 Ｚ 狸 ２１， Ｉ ７ ｏ３ ００Ｖ ． ． ｏ２ Ｎ
Ｃｈ ｍｉ ｒ ＆ Ｂｉｅ ｇ ｎ ｅｒ ｇ ｅ ｓ ｙ ｔ ｏ ｎ ｉｅ ｉ ｎ
田
透 明质 酸 高产 菌株 选 育研 究
叶倩 文 。 陆洋 ， 新松 卢 李
（ 东南大 学化 学化 工 学院 生物 材料 和 药物释 放 实验 室 ， 苏 南京 ２ １ ８ ） 江 １ １ ９
（ ） 酵培养 基 ４发
高产 菌株 已成 为发 酵 法生 产 ＨＡ 的研究 热 点＿ 。 ４ ］ 作者从 新 鲜 的水 牛鼻粘 膜 分离筛 选 出 １ ５株菌 株 ，
经生 化反应 鉴定 其 中 ５株 为透 明质 酸 产生 菌 。对 ＨＡ 产量 最高 的菌 株 的发 酵 液 精 提 物进 行 红外 吸收 光 谱 、 核磁 共振 、 紫外 吸 收 光 谱 分 析 ， 对 其 进 行 超声 波 ／ 并 紫 外线 复合诱 变 ， 明质 酸产 量大 幅提 高 。 透
血 性 ， 接 种 针挑 起 看 粘 度 。选 取 与 文 献 Ｅ ３ 述 类 用 ３描
似 的 菌株 ， 兰 氏染 色 镜 检 ， 进 行 链 球 菌 Ｃ群 生 化 革 并 反 应鉴 定 。
透 明质 酸 （ ａｕ ｏ ｉ ａｉ ， Ｈｙ ｌｒｎｃ ｃ ＨＡ） 是 以 Ｎ～ ｄ ， 乙酰 氨
牛脑 浸 粉 １ ． ， 心 浸 粉 １ ． ， 蛋 白胨 ００ ｇ 牛 ００ ｇ 胰
基 葡萄 糖胺 和 葡 萄糖 醛 酸 为 单 位 ， １ ３糖 苷 键 和 由 ，一
１ ４糖 苷键 连 接 的 高 分 子 直 链 酸 性 粘 多 糖 ， 泛存 ，一 广 在 于高等 动物 的结 缔组 织及 部 分细 菌 内＿ 。 由于 其 溶 １ ］ 液 具有 高粘性 和独 特 的粘 弹 性 而 广 泛 应用 于 临床 、 诊 断、 化妆 品等 领域 。 ］ ’ 透 明质 酸 的 生 产 方 法 主 要 有 提 取 法 和 发 酵 法 两 种 。 由于组织 提取 成 本较 高 、 艺 复杂 ， 工 因此 应用 更 多 的是 以链 球菌 为发 酵 菌种 的微 生物 发酵 法 ＿ 。 目前 透 ３ ］ 明质 酸 的产 生菌 主要 为 链 球 菌 Ａ 群 和 Ｃ群 。其 中链 球菌 Ａ 群具 有人 致病 性 ， 以一般 采 用链 球 菌 Ｃ群 为 所 发酵 起始 菌 株 。国外 发 酵 法 ＨＡ 生 产 已达 产 业 化 阶 段， 但我 国利 用 发 酵 法 生 产 ＨＡ 的技 术 仍 不 成 熟 ， 关 键是 没有 高 产 ＨＡ 的 菌 种 。所 以 从 自然 界 寻 找 ＨＡ
葡 萄糖 １ ． ， 母 膏 ２ ． ，Ｍｇ Ｏ ０ ０ｇ 酵 ００ｇ Ｓ ・７ ＨＯ ２ ０ｇ Ｋ２ Ｏ ２ ０ｇ 加蒸 馏水 至 １ ０ ． ， ＨＰ ４ ． ， ０ ０ｍＬ， ｐ 值 调 Ｈ
至 ７ ０１ １ ． ，２ ℃下 灭 菌 ２ ｎ ０ｍｉ 。 １ ３ 菌 种 的分 离筛 选 ． １ ３ １ 初筛 ． ．
１ ． ， 萄 糖 ２ ０ｇ Ｎａ １ ． ， 脂 ２ ． ， 蒸 ０ ０ｇ 葡 ． ， Ｃ ０ｇ 琼 ５ ００ｇ 加
馏 水 至 １０ ０ ０ ｍＬ， ｐ 值 至 ７ ０ １ １ 下 灭 菌 ２ 调 Ｈ ． ，２℃ Ｏ
ｍｉ ｎ。
（ ） 琼脂 平板 培养 基 ２血
将 灭菌 后 的脑 心浸 液培 养 基 冷 却 至 ５ ℃ ， 无 菌 ０ 在 条 件 下 加入 １ 新 鲜 无 菌 脱 纤 维 羊 血后 倒 入 平 板 冷 ０
将 新鲜 的 水 牛 鼻 粘 膜 接 人 １ 蛋 白 胨 溶 液 中 ，
１ 实 验
１１ 材料 ．
３ ℃ 、 ５ ・ ｉ 下 摇 床 培养 １ 。将培 养 液梯 度 ６ １０ｒ ｒ ｎ ａ ２ｈ
稀 释 至不 同 浓 度 分 别 涂 布 于 血 琼 脂 平 板 上 ， ６ 下 ３℃
培 养 ２ 。观 察 各 菌 落在 血 琼 脂 平 板 上 鼻粘 膜 ， 自南 京 市 江 宁 区某 养 牛 专 业 采
户新 宰杀水 牛 ， ２ 共 ４份 。 １ ２ 培养 基 ． （ ） 心浸 液培 养基 １脑
收 稿 日期 ：０ ｇ １ — ２ ２Ｏ一 １ ７
＼
摘 要 ： 新 鲜 水 牛 鼻 粘 膜 分 离 筛选 得 到 １ 菌 株 ， 生 化 反 应 鉴 定 其 中 ５ 为 透 明 质 酸 （ 从 ５株 经 株 ＨＡ） 生 茵 。 对 产 量 最 产 高 的 茵株 Ｂ发 酵 液 精 提 物 进 行 红 外 吸 收 光谱 （Ｒ）核 磁 共 振 （ Ｃ Ｉ 、 ” ＮＭＲ） 紫 外 吸 收 光 谱 （ 、 ＵＶ） 析 ， 明 其 发 酵 液 精 提 物 分 证
确 为 ＨＡ。 菌株 Ｂ 经超 声 波／ 紫外 线 复合 诱 变 处 理后 ， ＨＡ 产 量 由 ｏ ７ ３ｇ・Ｌ １ 高到 １ ４ Ｌ 。 ． ９ 啊提 ． ６ｇ・ ＿ 。 关 键 词 ： 明质 酸 高 产 茵株 ； 透 筛选 ； 定 ； 理诱 变 鉴 物
中 图分 类 号 ： Ｑ ２ ． Ｔ ９１７ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６２ ４ ５ ２ １ ） ３ ０ １ ０ １ ７ —５ ２ （ ０ ０ ０ ～０ ５ － ４