112细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
凝胶
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名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
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7
❖热原=内毒素 ？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒
素就是控制热原。
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凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
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18
细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
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1
内容 ❖细菌内毒素简介
❖细菌内毒素检测方法
❖常见问题及解决方案
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2
一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
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3
❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则1. 引言在当前社会背景下，食品安全问题备受关注，并且细菌内毒素作为食品中的一种重要污染物质也越来越受到重视。
为了确保食品的安全性，细菌内毒素检查成为一项非常重要的工作。
本文将从深度和广度的角度来评估细菌内毒素检查法的应用指导原则，并根据该主题进行讨论。
2. 细菌内毒素检查法的概述细菌内毒素是由细菌产生的一种有毒物质，它们可以污染食品并对人体健康造成潜在威胁。
细菌内毒素检查法的应用非常重要。
该方法一般包括样品准备、提取和分析等步骤。
通过采用适当的检测技术和方法，可以准确可靠地检测细菌内毒素的存在和含量。
3. 细菌内毒素检查法的准备工作在进行细菌内毒素检查之前，必须进行一些准备工作。
需要确定检测的细菌种类和内毒素类型，以便选择适当的检测方法。
样品的收集和保存也是一项关键工作，应该注意避免污染或降解。
还需要准备相关的实验室设备、试剂和标准品等。
4. 细菌内毒素检查的主要技术方法目前，细菌内毒素检查主要采用生物学方法和化学方法两种主要技术。
生物学方法包括毒素制备、生物学活性试验和鉴定等步骤，通常用于细菌内毒素的初步筛查。
而化学方法则依靠物质的化学性质或光学性质来进行分析和检测，常用的方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等。
5. 细菌内毒素检查的应用指导原则为了保证细菌内毒素检查的质量和准确性，应遵循以下应用指导原则：5.1 样品选择：应根据实际情况选择适当的样品进行检测，要注意样品的来源、存储和处理方式。
5.2 样品制备：样品必须按照规定的方法进行提取和制备，确保细菌内毒素的稳定性和提取效率。
5.3 适当的检测方法：应根据细菌种类和内毒素类型选择适当的检测方法，确保检测结果的准确性和可靠性。
5.4 外部质量控制：在进行细菌内毒素检查时，应严格遵循外部质量控制的要求，包括使用标准品进行校准和内毒素的稀释等。
5.5 结果解释和评估：在得到检测结果后，需要对结果进行解释和评估，确保对检测结果的理解和使用是正确的。
《细菌内毒素检查》课件
其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题一．内毒素单位内毒素单位不能采用pg/ml在80年代以前，所有研究内毒素的报道，均使用重量单位表示内毒素的量。
随着人们对细菌内毒素生物活性的不断研究，认识到不同来源的内毒素，相同重量的内毒素，其生物活性相差很大。
•1980年，美国学者Hochstein完成了将重量单位转化为内毒素单位的工作。
•当时美国内毒素参考品为EC2，该参考品的家兔发热剂量ED50为1.04ng/kg，EC2与美国第四批鲎试剂参考品（美国FDA批准）的反应终点浓度为0.194ng/ml(四个试验室56批数据的几何平均值)， FDA规定该值为EC2的1个内毒素单位， EC2的量值为5EU/ng。
•1987年WHO建立第一批国际内毒素标准品(84/650,14000IU)。
•1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580,10000IU)，规定1IU=1EU。
•981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出，细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
二．标准品的来源2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
2005年版中国药品检验标准操作规范《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
三．样品的稀释细菌内毒素实验中样品每步稀释的倍数不应大于10倍，否则会影响实验的准确性。
四．样品的预处理过程不同厂家生产的血液保存液PH会略有不同，举例：血液保存液ⅠPH范围是4.5～5.5，血液保存液ⅡpH值 4.5～5.5，红细胞保存液pH值范围是5.0～6.0。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
名称
天平
电热干燥箱 恒温水浴箱
水银或酒精温度计
漩涡混合器
计时器
2、器具
器具分类
要求 感量0.1mg以下
～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃
/ 60min±1min
器具名称
反应试管
玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
❖ 在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法 ，已经广泛的被世界各国药典收载。
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml ，第五列加入BET水0.1ml。
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
0.25λ
2λ
λ
0.5λ
《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则
《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则《中国药典》9251细菌内毒素检查法应用指导原则包括以下几个方面：
1.细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2.在应用细菌内毒素检查法时，应考虑到各种药品的特性和使用方法，以确保结果的准确性和可靠性。
3.在进行细菌内毒素检查时，应严格遵守操作规程，确保实验过程的标准化和规范化。
4.对于细菌内毒素的检测结果，应结合其他实验室检查结果和临床表现进行综合分析，以得出正确的诊断结论。
以上信息仅供参考，建议查阅《中国药典》获取更全面准确的信息。
内毒素
旋涡混合器上混合15分钟，以后的每一步稀 释前要至少混合30秒，其他国家药典也有类 似要求； 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均 匀分布 不按要求进行旋涡混合会使所稀释的内毒 素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对 照不凝等不正确的实验结果
世界上现存鲎的种类
鲎是一种海洋无脊椎动物，蓝色的血液。
2 、本试验操作过程应 试验操作过程应防止微 防止微生物和内毒素的 生物的污染 污染
2010版
3 、1EU与1个内毒素国际单 位（IU）相当
2005年版
----
4、常用干热灭菌法（250℃、 常用的方法是在250 ℃干烤至少 30分钟以上）去除 60分钟 5、删除 对于过酸、过碱或本身有缓冲能 力的供试品，需调节被测溶液 （或其稀释液）的pH 值，可 使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂 家推荐的适宜的缓冲液调节pH 值。
实验基本流程图
供试品 限值确定
最大有效稀释 倍数确定
正式实验
供试品干扰实验
结果判断
2. 试剂、仪器设备等
细菌内毒素检查法所应用的 试剂，主要包括：鲎试剂、细菌 内毒素检查用水、细菌内毒素工 作标准品等。
国内鲎试剂的生产情况
安度斯生物技术有限公司 湛江海洋生物制品厂 福州新北鲎试剂厂 厦门鲎试剂厂 福州东方鲎试剂厂 福州平潭东方鲎试剂厂 广西北海鲎试剂厂
细菌内毒素工作标准品(CSE)
细菌内毒素工作标准品系以细菌内 毒素国家标准品为基准标定其效价， 用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干 扰试验及各种阳性对照。
仪器设备与实验器具
分析天平 超净工作台 细菌内毒素检查专用干式恒温器 电热恒温干燥箱 旋涡混合器
细菌内毒素检验注意事项
德州市药品检验所
简 介 实验介绍：凝胶法 光度测定法 实验涉及内容及相关要
简介
细菌内毒素具有： 耐热性： 不易灭活（180℃、2小时；250℃、 30分钟） 分子极性： 易聚集、吸附，需充分混合 高致热性： 作用于人体，会引起发热、寒战、 休克、甚至死亡
细菌内毒素检查方法的分类
凝胶限度试验
凝胶限度试验
凝胶法
干扰作用
凝胶法
凝胶法
鲎试剂灵敏度复核：当使用新批号的鲎试剂或 实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变 时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前， 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查时， 须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能 影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
试验有效
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
凝胶限度实验—日常检查
1、限值的确定
1、计算最大有效稀释倍数
2、供试品溶液的制备
3、检查法—凝胶限度试验
度试验
凝胶限度试验
凝胶限度试验
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发布日期20060822
栏目化药药物评价>>化药质量控制
标题细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
作者李霞张哲峰
部门
正文内容
审评三部李霞张哲峰
摘要：本文通过审评中发现的一些问题，结合药品检验的工作实际，对细菌内毒素进
行方法学验证的重要性、必要性以及在技术审评中应关注的几个方面进行了全面阐述。
关键词：细菌内毒素、药品申报、技术审评
热原检查法和细菌内毒素检查药典附录并没有统一的给药剂量和标准限度，均在各
品种项下具体规定，故是否能有效地保证临床用药的安全性，其标准限值是我们在制
订质量标准时首先要关注的。
对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以
接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。
M为按规定的给药途径，人每公斤体
重每小时给药的最大剂量。
这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。
原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。
通常以一次剂量为准，如注明输
2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以计算后的最大剂量，即2 g/次计算。
用法用量中有成人剂量、儿童剂量、重症剂量时，要体现出最大剂量。
通常儿童剂量以Kg计算时大于成人剂量，所以，此时应用儿童剂量，因为儿童与重症病人更易出现问题，故应更严格。
用于感染、肿瘤、心血管、中枢疾患易感的药物建
议加上安全系数。
复方、输液、工艺易污染者从严，大输液一般计为0.5EU/ml。
有时候，细菌内毒素限值也以国外药典为参考，甚至就直接采用国外药典的限值。
这一点在实际应用的时候，必须从中国的临床用药的实际出发，不能不加区分地把同
品种中国外药典规定的限值移至中国药典，总的原则是，对这一类国外药典已建立细
菌内毒素检查法的品种，原则上要求将国外药典规定的限值与按公式计算出的数值进
行比较，一般应以严格者为该品种的限值。
另外以热原剂量作参考的问题，现在原则上已不再考虑热原的剂量。
但大容量输液细
菌内毒素限值为0.5EU/ml，主要是由热原试验中以10ml/kg iv家兔剂量得出的。
细菌内毒素的限值确定后，需要关注的第二个方面就是细菌内毒素方法学研究问题。
在申报资料中，无论是仿制药还是创新药，申请人一般均会提供有关物质、溶出度、
含量测定等主要检测项目的方法学研究资料，而对于细菌内毒素检查，给予的关注似
乎要少得多，而申报资料中提供了这方面资料的也少之又少。
实际上，处方工艺的改变对检测方法所带来的影响，对有关物质、溶出度、含量测定等项目的影响绝对不会比对细菌内毒素检查法带来的影响大，因为，细菌内毒素检查法实际是一种较为特殊的检查方法，中国药典2005年版对什么时候该进行细菌内毒素的干扰试验进行了相关规定【1】：
当进行新药的细菌内毒素检查试验前，或无细菌内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
所谓干扰试验，换句话说就是方法的可行性试验。
从药典对它的要求可以看出，不论是新药，还是已有国家标准的仿制药，只要须控制细菌内毒素的，有这样一项检查项的，均应在质量研究中对其方法的可行性进行验证。
在以往工作中遇到的一个实例可以对其进行说明，我们曾经对硫酸头孢匹罗这个品种进行标准复核，结果发现不同厂家的硫酸头孢匹罗，几乎相同的含量、相同的工艺，对其细菌内毒素检查所产生的干扰情况却存在较大的差别，通过进一步的试验研究，结果发现造成这种结果最大的可能是由于生产过程中引入的微量杂质的不同所引起的。
这个例子进一步说明了在申报资料中提供细菌内毒素方法学研究资料的必要性。
进行内毒素干扰试验时，首先要确定限值，然后采用至少两个厂家的鲎试剂进行干扰预试验，得到一最大不干扰浓度或最小稀释倍数后，即可用这一最大不干扰浓度进行正式的干扰试验。
预试验一般不要以市售鲎试剂灵敏度计算所得的MVD作为起始浓度来做。
注射液建议以原液来做，粉针剂建议至少往上几个浓度级来做，探索其干扰程度，如没有干扰，方法则更可靠。
在申报资料中经常会看见这种情况：就是研究者直接用灵敏度为0.06或0.03的鲎试剂进行试验，资料中既不交代是否是由于样品有干扰，不能用高于此灵敏度的鲎试剂进行试验，或者是样品没有干扰，实验者手中只有这种灵敏度的鲎试剂，审评人员根本无法根据资料情况判断样品本身是否产生了干扰？其引起干扰的浓度为多少？不产生干扰的样品的浓度又为多少？在此情况下，无法对方法的可行性作出判断。
因为现在市售灵敏度最高的鲎试剂也就是0.03，而前面已经介绍了，生产工艺的细微变化都可能引起其干扰的增加，如果一个样品，原来就只能用0.03灵敏度的鲎试剂进行检测，而这时干扰程度又增加了，则进行检测时，方法已不可行，所以，如果采用稀释法，样品浓度要稀释到必须使用灵敏度为0.06甚至0.03的鲎试剂时，只能说方法的粗放度不够，耐用性不好，最好采用其它手段排除干扰，实在暂时不能排除干扰时，可还是采用经典的热原检查法。
在资料中有时也会看到这种情况，实验者先采用一种灵敏度的鲎试剂（如灵敏度为0.5EU/ml）进行预试验，只做了一个样品浓度，就是灵敏度0.5EU/ml所对应的稀释浓度，结果这一浓度有干扰，接着就采用灵敏度为0.06EU/ml的鲎试剂在其相对应的稀
释浓度来进行试验，而前面几个浓度样品有没有干扰，资料中根本无从体现，这种方
法也是不完善的。
资料中还有一种情况是，实验者在预试验时做到样品稀释到30倍即已不产生干扰，但正式试验时，试验者手中只有 0.125EU/ml灵敏度的鲎试剂，则实验者就把样品稀释到其对应的稀释浓度如120倍进行试验，其实这时正确的做法应该是就用30倍的稀释液进行试验。
现在要确定的是什么浓度不产生干扰，对于用什么灵敏度的鲎试剂是没
有影响的，干扰试验与鲎试剂灵敏度无关。
理论上某一浓度无干扰，则对各种灵敏度
的鲎试剂都没有干扰。
只不过使用的鲎试剂过于灵敏，如样品本身内毒素偏高，则容
易产生阳性，故在进行研究工作时，一般使用较低灵敏度的TAL进行试验，如采用
0.5EU/ml或0.25EU/ml灵敏度的鲎试剂，避免由于样品本身所含内毒素所造成的干扰影响。
中国药典2005年版一部也增加了细菌内毒素检查，但中药注射剂进行内毒素检查
要慎重。
由于中药成分比较复杂，干扰因素也多，其中的成分由于原料及提取工艺不同，干扰因素也在变动，确定剂量时，不要单纯用M值，最好加上安全因子。
对于中
药注射剂来说，不光是原料、工艺对细菌内毒素检查有影响，其中所含的鞣质、多糖
等都有影响，也许用热原检查可能更合适。
现在又推出一种新的体外热原试验方法【2】【3】，利用免疫分析方法测定细胞因子（cytokine）以检查药品中污染的热原，这些
细胞因子包含白细胞介素－1、肿瘤坏死因子¦Α、白细胞介素－6和干扰素，目前认为它们是进入体内的热原物质刺激外周血中白细胞释放的具有热原和炎症活性的“内源
性热原”。
这种体外热原试验方法一旦被药典收载，可能会克服中药细菌内毒素检查
中出现的一些弊端。
参考文献：
1、《中国药典》2005年版二部附录Ⅺ E
2、Poole S,et al.Detection of pyrogen by cytokine ncet,1988,(8577):130
3、 Poole S,et al.Assay of pyrogenic contamination in pharmaceuticals by cytokine release.Pharma Europa,1989,(1):17
备注。