BP神经网络结合正交试验法优化Bacillus velezensis Z—27菌株培养基组分

BP神经网络结合正交试验法优化Bacillus velezensis Z—27菌株培养基组分作者：甄新武乔均俭来源：《湖北农业科学》2013年第13期摘要：将BP人工神经网络（Artificiai neural network）技术与传统的正交试验方法相结合，提出一种新的试验分析和处理方法，利用神经网络特有的自学能力，对主要影响因素进行仿真优化，获得Bacillus velezensis Z-27菌株培养基组分，即玉米粉2.0%、豆饼粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH为7.0、接种量为2.0%，应用优化得到的培养基组分进行验证试验，取得了较好的效果。

关键词：BP人工神经网络（Artificiai neural network）；正交试验；培养基；Bacillus velezensis Z-27菌株中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3109-03近年来，健康和生态环境问题日益受到重视，中国已全面启动实施无毒、无公害的微生态饲料添加剂工程。

农业部于1994年公布的可用于微生态制剂生产的菌种包括乳酸杆菌、芽孢杆菌、粪链球菌、酵母菌和双歧杆菌。

其中芽孢杆菌可以使肠道内形成有利于厌氧微生物生长的环境，从而保持肠道微生态系统平衡。

芽孢杆菌在肠道中还可以产生多种消化酶和有机酸，这有益于提高饲料的利用率，抑制有害菌的繁殖，可为乳酸杆菌等菌群的生长创造有利条件。

所以，芽孢杆菌是一种理想的动物微生态制剂的生产菌种。

Z-27菌株[1]是以来自猪粪便的耐高浓度胆酸盐的产芽孢菌株为出发菌株，以大肠杆菌为病原指示菌，经过初筛、复筛筛选出的具有较高拮抗活性的芽孢杆菌，对其进行了菌种鉴定，经鉴定为Bacillus velezensis。

人工神经网络（Artificiai neural network），简称神经网络，是近几年迅速发展起来的一门集神经科学、信息科学、计算机科学于一体的交叉边缘学科，是生物神经网络（Biology neural network）在结构、功能及某些基本特性方面的理论抽象和模拟而构成的一种信息处理系统[2，3]。

本研究以Bacillus velezensis Z-27为发酵菌株，利用BP神经网络结合正交试验法优化其培养基发酵条件，旨在降低生产成本，为进一步研制具有抗腹泻功能的猪用益生菌制剂奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料Bacillus velezensis Z-27菌株，由河北农业大学生命科学学院实验室保存。

1.2 培养基NA培养基、NB培养基、LB培养基。

摇瓶发酵基础培养基：蛋白胨1.0%，葡萄糖1.0%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，Na2HPO4·2H2O 0.4%，CaCl2 0.02%，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.3 试验方法1.3.1 单因素试验确定培养基组分根据试验需要单因素改变基础培养基的碳源、氮源、无机盐。

摇床转速170 r/min，摇瓶装液量50 mL，接种10～12 h芽孢杆菌Z-27菌株种子液，接种量2.0%，37 ℃培养24 h。

考察单因素对芽孢杆菌Z-27菌株发酵液活菌浓度、发酵液抗菌活性及芽孢产率的影响，从而得到最佳碳源、氮源和无机盐。

利用发酵液梯度稀释后涂布平板的活菌计数法测定芽孢杆菌Z-27菌株摇瓶发酵液活菌浓度。

芽孢观察和计数采用孔雀绿芽孢染色和血球计数板直接计数相结合的方法，将培养液稀释一定倍数后在显微镜下观察，计算芽孢产率。

采用琼脂打孔扩散法测定发酵液抗菌活性。

1.3.2 正交试验优化培养条件培养基组成及接种量等培养条件对芽孢杆菌Z-27菌株发酵的影响按正交试验表L16（45）进行考察[4-8]。

碳源采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四个水平；氮源采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%四个水平；无机盐采用0.01%、0.03%、0.05%、0.07%四个水平；pH采用6.5、7.0、7.5、8.0四个水平；接种量采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四个水平。

以发酵液活菌浓度为指标，确定出芽孢杆菌Z-27菌株最佳培养基组成及最适接种量[9，10]。

1.3.3 芽孢杆菌Z-27菌株生长曲线的测定在组成优化后的发酵培养基中接入种龄为10～12 h的芽孢杆菌Z-27菌株种子液，摇床转速170 r/min，摇瓶装液量50 mL，接种量2.0%，37 ℃培养24 h。

每隔2 h测定1次发酵液OD600 nm值，记录测定时间及相应OD600 nm值绘制芽孢杆菌Z-27菌株的生长曲线。

1.3.4 建立BP人工神经网络模型建立神经网络的图形用户界面：应用Matlab7.2的GUIDE 功能创设了含有输入因子数据库、输出因子数据库、神经网络训练参数设置、隐含层数、隐含层的神经元数、训练函数、预测输入、预测结果、神经网络保存等多个功能的操作界面。

数据输入及网络初始化：导入玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、pH、接种量5因素4水平的16个试验值作样本输入，用专家相应评价结果作为输入样本对应的教师值，取精度ε=0.000 07，输入节点数为5，隐含层取5个节点，输出层取1个节点，以玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、pH、接种量 5因素为自变量，建立输入矩阵，以活菌浓度为因变量，建立输出矩阵，对数据网络初始化。

网络设置的训练参数为：最大训练步数为10 000，学习效率为0.02，训练误差目标为0，动量常数为0.05，网络训练采用Levebberg-Marquardt算法。

2 结果与分析2.1 正交试验优化培养条件2.1.1 不同碳源对芽孢杆菌Z-27菌株摇瓶发酵的影响在摇瓶发酵基础培养基中分别加入1.0%的不同碳源，进行发酵试验，结果见表1。

由表1可见，在培养基中以玉米粉和麸皮为碳源，活菌浓度均≥2.6×109 CFU/mL，芽孢产率亦均≥90%，发酵液中抑菌物对大肠杆菌的抑菌活性也较高。

其中以玉米粉为碳源时，相应的3个指标均表现为最高，故选择玉米粉为最佳碳源。

2.1.2 不同氮源对芽孢杆菌Z-27菌株摇瓶发酵的影响以1.0%玉米粉为碳源，在摇瓶发酵基础培养基中分别加入1.0%的不同氮源进行发酵试验，结果见表2。

由表2可见，在培养基中以豆饼粉或花生饼粉为氮源，活菌浓度均≥2.40×109 CFU/mL，芽孢产率均≥97%，发酵液中抑菌物的活性也较高，因此豆饼粉或花生饼粉均可作为最佳氮源。

以下试验均选择以豆饼粉为氮源。

2.1.3 不同无机盐对芽孢杆菌Z-27菌株摇瓶发酵的影响在摇瓶发酵基础培养基中以1.0%玉米粉为碳源，以1.0%豆饼粉为氮源，分别添加FeSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 6种无机盐代替培养基中的CaCl2，添加量均为0.02%，考察不同无机离子对发酵的影响，不同无机离子对芽孢杆菌Z-27菌株活菌数、芽孢产率和抑制大肠杆菌能力的影响结果见表3。

由表3可见，Mn2+对芽孢杆菌Z-27菌株的促进作用最强，故选择MnSO4·H2O作为无机盐。

2.1.4 正交试验与结果综合以上各单因素试验结果，选择玉米粉、豆饼粉、MnSO4·H2O、pH、接种量 5个因素，按正交试验表L16（45）设计试验（表4），结果见表5。

依据正交试验的直观分析结果，极差值大小为R豆饼粉>RpH>R玉米粉>R接种量>R■，表明豆饼粉为主要影响因素，pH影响次之。

由表5可见，7号试验组合发酵液的活菌数最高，为1.70×109 CFU/mL，其组合为A2B3C4D1E2，即玉米粉2.0%、豆饼粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH为6.5，接种量为2.0%。

2.2 对主要因素进行仿真和优化分析在正交试验所获得的较优组合的基础上，改变一种影响因素值，固定其他4种影响因素值，应用所建立的BP人工神经网络模型进行模拟，结果如图1至图5所示。

由图1至图5可知，固定其他4种影响因素值，改变一种影响因素值，所建立的BP人工神经网络模型进行数值仿真，确定获得Bacillus velezensis Z-27菌株培养基组分为：玉米粉2.0%、豆饼粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%、起始pH为7.0、接种量为2.0%。

应用优化得到的最佳组分进行了3次验证试验，所得活菌浓度平均为1.81×109 CFU/mL，优于正交试验结果。

3 小结与讨论1）利用正交试验数据对BP人工神经网络模型进行训练，测试样本的网络预测值和实际测量值的相对误差小于1%，训练好的模型可对提取结果进行预测。

2）将BP人工神经网络技术与传统的正交试验方法相结合，充分利用正交试验数据，并对主要影响因素进行仿真优化，获得Bacillus velezensis Z-27菌株培养基组分：即玉米粉2.0%，豆饼粉1.5%，MnSO4·H2O 0.07%，起始pH为7.0，接种量为2.0%。

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